段惠娟，孫照剛，郝衛(wèi)東，魏雪濤，褚洪遷，*

(1．北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所耐藥結(jié)核病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 101149；2．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室，北京101149；3．北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系，北京 100191；4．食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量產(chǎn)生，超岀了機(jī)體清除能力，破壞了機(jī)體正常的氧化/還原平衡狀態(tài)，造成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子物質(zhì)氧化損傷和功能紊亂，影響機(jī)體正常代謝過(guò)程而形成的一種異常應(yīng)激狀態(tài)。它是引起機(jī)體衰老、炎癥和多種慢性疾病如糖尿病、高血壓等的主要原因之一[1-2]。當(dāng)細(xì)胞受到外源或內(nèi)源刺激時(shí)，產(chǎn)生的ROS 會(huì)激活多條信號(hào)通路。Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1，Keap1)-核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路是一個(gè)綜合的氧化還原反應(yīng)體系，有多個(gè)激活途徑維持細(xì)胞的氧化還原平衡及代謝，能調(diào)節(jié)機(jī)體1%~10%的基因[3-4]。Keap1-Nrf2-ARE 信號(hào)通路與氧化應(yīng)激相關(guān)的多種疾病，包括癌癥、阿爾茨海默病、帕金森病、糖尿病等均有相關(guān)性[5]。抗氧化劑可影響氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而作用于Keap1-Nrf2-ARE 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用。

姜黃素(curcumin)、槲皮素(quercetin)、叔丁基對(duì)苯二酚(tert-Butylhydroquinone，tBHQ)是食品藥品中經(jīng)常添加的抗氧化劑，研究表明上述3 種化學(xué)物質(zhì)是Keap1-Nrf2-ARE 信號(hào)通路的小分子激活劑，可與Keap1 半胱氨酸上的巰基通過(guò)氧化或烷基化形成共價(jià)加合物，誘導(dǎo)Keap1 和Nrf2 解離，抑制Nrf2 通過(guò)泛素化降解，進(jìn)而促進(jìn)Nrf2 核轉(zhuǎn)位[6]。但是，上述物質(zhì)引起的具體哪種氧化應(yīng)激相關(guān)基因發(fā)生改變尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)的方法，以過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide)為對(duì)照、篩選槲皮素、姜黃素及叔丁基對(duì)苯二酚對(duì)84種氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響，擬為抗氧化劑的添加提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

過(guò)氧化氫、槲皮素、姜黃素、叔丁基對(duì)苯二酚均購(gòu)自美國(guó)BD公司，DMEM高糖培養(yǎng)液、胰酶、DMSO均購(gòu)自Sigma Aldrich 公司，胎牛血清購(gòu)自BD Pharmingen 公司。RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自QIAGEN 公司。人類氧化應(yīng)激PCR 芯片(RT2ProfilerTMPCR Array Human Oxidative Stress Plus) 測(cè)定由QIAGEN 公司完成。姜黃素先溶于DMSO 配成儲(chǔ)備液，再用新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度使用，其余3 種化學(xué)物質(zhì)用新鮮的DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋得到。

i-MARK 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)；RNA 質(zhì)量及濃度測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)；CO2培養(yǎng)箱和熒光定量PCR(美國(guó)Thermo 公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀NucleoCounter(丹麥ChemoMetec公司)。

1.2 細(xì)胞系及芯片

HaCaT 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。所需培養(yǎng)液為DMEM 高糖完全培養(yǎng)液(含0.37%碳酸氫鈉，10%滅活的胎牛血清，2 mmol/L左旋谷氨酰胺，100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在75 cm2培養(yǎng)瓶，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

人類氧化應(yīng)激PCR芯片用來(lái)探查84個(gè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)(表1)。過(guò)氧化物酶在此陣列上，包含谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和過(guò)氧化還原酶(TPx)。陣列上還包括ROS代謝相關(guān)基因，如氧化應(yīng)激應(yīng)答基因及參與過(guò)氧化物代謝的基因(如SOD等)。還包括其他由16個(gè)試驗(yàn)確定的生物標(biāo)志基因。每個(gè)陣列上均設(shè)有對(duì)照，用ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。使用qPCR 技術(shù)檢測(cè)氧化應(yīng)激基因的表達(dá)，基因的表達(dá)超過(guò)3 倍認(rèn)為有意義。

表1 人類氧化應(yīng)激相關(guān)基因

1.3 方 法

1.3.1 四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)4 種化學(xué)物對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，使用胰酶分離后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用完全DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，于96 孔板中加入100 μL HaCaT細(xì)胞懸液和100 μL不同濃度的過(guò)氧化氫及受試物。過(guò)氧化氫的終濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2.5、5、7.5、10 mmol/L，姜黃素的終濃度為0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，槲皮素的終濃度為0、300、400、500、600、700、800、900、1 000 μmol/L，叔丁基對(duì)苯二酚的終濃度為0、1.25、2.5、5、10、25、50、75、100 μmol/L。每個(gè)劑量設(shè)6 個(gè)平行孔，將培養(yǎng)板置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃培養(yǎng)箱20 h 后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL，用PBS 配制成pH=7.4)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 000 r/min 離心5 min 后取上清，加入150 μL DMSO，振蕩混勻10 min后，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.2 RNA 提取及質(zhì)量分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成終濃度為2×105/mL 的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種在6 孔板內(nèi)(4×105個(gè)/孔)，在37oC 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。分別用過(guò)氧化氫(0.5 和1.25 mmol/L)，姜黃素(5 和20 μmol/L)，槲皮素(200 和500 μmol/L)及叔丁基對(duì)苯二酚(10和50 μmol/L)刺激HaCaT 細(xì)胞4 h，24 h后重復(fù)1 次，將細(xì)胞用PBS 洗兩次，用胰酶消化，轉(zhuǎn)移到EP 管內(nèi)，300 g 離心5 min，棄掉上清。加入1 mL TRIzol，反復(fù)吹打幾次，將液體轉(zhuǎn)移到新的EP 管中。每管加入0.2 mL氯仿：異戊醇混合液，劇烈混合。室溫孵育3 min后，4 ℃、12 000 g離心5 min，將上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP 管內(nèi)，每管加入0.53 mL 無(wú)水乙醇。然后用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)純化RNA，將RNA 置于-80 ℃保存。合成cDNA 之前使用Agilent RNA 600 Nano Kit檢測(cè)RNA的質(zhì)量及濃度。

1.3.3 cDNA合成及qPCR根據(jù)RT2First Strand 試劑盒(QIAGEN)步驟要求，每管使用0.5 μg 的RNA 作為模板合成cDNA。合成cDNA 之后，進(jìn)入Real-time PCR 步驟(每個(gè)樣本重復(fù)3 次)，在5 mL 管內(nèi)配制反應(yīng)液，2×RT2SYBR Green Mastermix 1 350 μL，cDNA合成反應(yīng)液102 μL，RNase-free water 1 248 μL，總體積為2 700 μL。小心將RT2Profiler PCR Array(96孔板)從密封袋中取出，每孔加入25 μL上述PCR混合液，室溫下1 000g離心1 min 去除氣泡，然后在Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃、10 min，然后95 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)，最后60 ℃、1 min，得到每孔的CT值。根據(jù)2-ΔΔCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.1、SPSS 22.0 和Microsoft Office Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及作圖，用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 過(guò)氧化氫、槲皮素、姜黃素、叔丁基對(duì)苯二酚對(duì)HaCaT細(xì)胞的毒性

見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，過(guò)氧化氫濃度＞1 mmol/L時(shí)，HaCaT 細(xì)胞的存活率在80%以下(圖1A)。姜黃素濃度＞10 μmol/L 時(shí)，HaCaT 細(xì)胞的存活率在80%以下(圖1B)。而槲皮素在濃度為1 000 μmol/L 仍未顯示出明顯的細(xì)胞毒性(圖1C)。叔丁基對(duì)苯二酚在濃度＞50 μmol/L時(shí)，HaCaT細(xì)胞的存活率在80%以下(圖1D)。

圖1 不同濃度的4種化學(xué)物對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

2.2 RNA濃度測(cè)定及質(zhì)量分析

如圖2 所示，以槲皮素為例，可以看出，RNA 條帶及吸收峰完整(圖2A和C)，RNA質(zhì)量得分均為10分(圖2B)，可用來(lái)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 RNA質(zhì)量分析

2.3 4 種化學(xué)物質(zhì)對(duì)HaCaT 細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

給予不同濃度的過(guò)氧化氫、姜黃素、槲皮素及叔丁基對(duì)苯二酚處理HaCaT細(xì)胞4 h及24 h后，均能引起HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變。如圖3 和表2 所示，過(guò)氧化氫0.5 mmol/L 處理HaCaT 細(xì)胞4 h 后不會(huì)引起HaCaT 氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變，1.25 mmol/L 處理HaCaT 細(xì)胞4 h 引起ALB、CCL5、SOD3、HMOX1、SPINK1共5 種基因表達(dá)上調(diào)。24 h 時(shí)，0.5和1.25 mmol/L處理HaCaT細(xì)胞均能引起基因DUOX2和AKR1C2基因表達(dá)升高；此外，1.25 mmol/L 處理HaCaT 細(xì)胞24 h 后還可引起HMOX1和TXNRD1基因表達(dá)上調(diào)，CCL5基因表達(dá)下調(diào)。

圖3 H2O2對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖4 和表2 所示，姜黃素5 和20 μmol/L 處理HaCaT 細(xì)胞4 h后均引起HSPA1A、NOS2和HMOX1基因表達(dá)的上調(diào)，不同的是，5 μmol/L處理細(xì)胞后表達(dá)上調(diào)的基因還包括CCL5、CYGB、EPHX2、EPX、GCLC、GPX2、GPX3、KRT1、SRXN1、SLC7A11及TXNRD1共11種基因，未引起任何氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)降低；20 μmol/L 處理后表達(dá)上調(diào)的基因還包括ALB、AOX1、APOE、DUSP1、LPO、MB、MPO、TTN及SPINK1，并且引起GSR基因表達(dá)下調(diào)。5 μmol/L處理HaCaT 細(xì)胞24 h 后引起HMOX1、NQO1及SLC7A11共3 種基因表達(dá)上調(diào)，DHCR24、KRT1及SEPP1共3種基因表達(dá)下調(diào)。由于使用20 μmol/L 姜黃素處理24 h 后細(xì)胞存活率較低，提取的RNA 濃度少，所以導(dǎo)致24 h的數(shù)據(jù)缺失。

圖4 姜黃素對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖5 和表2 所示，槲皮素200 和500 μmol/L 處理HaCaT 細(xì)胞4 h 均能引起ALB、NOS2、HMOX1共3種基因表達(dá)上調(diào)，此外，500 μmol/L 處理4 h 后還能引 起DUSP1、GPX3、NCF1和PTGS2基 因 上 調(diào)，SEPP1基因表達(dá)下調(diào)。200 和500 μmol/L 處理HaCaT細(xì)胞24 h后均引起B(yǎng)NIP3和PTGS1共2種基因表達(dá)上調(diào)，MPO和SEPP1共2 種基因表達(dá)下調(diào)。此外，200 μmol/L 處理HaCaT 細(xì)胞24 h 后還可引起EPX基因表達(dá)下調(diào)，500 μmol/L處理HaCaT細(xì)胞24 h后還可引起CYGB、PTGS2和SPINK1共3 種基因表達(dá)上調(diào)，KRT1和MB共2種基因表達(dá)下調(diào)。

圖5 槲皮素對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖6 和表2 所示，叔丁基對(duì)苯二酚10 和50 μmol/L 處 理HaCaT 細(xì) 胞4 h 均 引 起EPX、GCLC、SRXN1、HMOXN1、SLC7A11及TXNRD1共6種基因表達(dá)上調(diào)，50 μmol/L 處理后還引起EPHX2、GSR、AKR1C2、GCLM、NQO1基因表達(dá)上調(diào)，均未引起任何氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)降低。叔丁基對(duì)苯二酚10和50 μmol/L處理HaCaT細(xì)胞24 h后，均引起AKRIC2和SLC7A11基因表達(dá)上調(diào)。此外，10 μmol/L處理后表達(dá)上調(diào)的基因還包括ALB、EPX、MB，50 μmol/L 處理后表達(dá)上調(diào)的基因還包括CYBB、GCLC、SRXN1、GCLM、HMOX1、NQO1。10 μmol/L處理后引起AOX1基因表達(dá)下調(diào)，50 μmol/L 處理后引起CYGB、EPX、KRT1、MPO及NCF1共5種基因的表達(dá)下調(diào)。

表2 4種化合物不同濃度下對(duì)基因表達(dá)的影響

圖6 叔丁基對(duì)苯二酚對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

人體表皮經(jīng)常暴露于大量的物理或化學(xué)因子，能夠引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[1]。ROS 是氧化應(yīng)激最重要的調(diào)節(jié)因子，并且能夠引起細(xì)胞的氧化損傷[3]。ROS是小的生物分子，是需氧有機(jī)體氧代謝的副產(chǎn)物，在體內(nèi)能夠持續(xù)產(chǎn)生。盡管細(xì)胞產(chǎn)生ROS能夠產(chǎn)生毒性作用，如細(xì)胞的壞死和凋亡，但是ROS也在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用[5]。在正常生理狀態(tài)下，由于體內(nèi)抗氧化機(jī)制的存在，ROS 的產(chǎn)生處于平衡狀態(tài)。在病理狀態(tài)下，由于ROS的產(chǎn)生增多或是抗氧化系統(tǒng)的受損導(dǎo)致ROS 的產(chǎn)生達(dá)到較高水平[2，7-9]。ROS能夠影響細(xì)胞的氧化還原平衡狀態(tài)，最終導(dǎo)致生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的改變。研究表明轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 能夠調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)[4，10]，但涉及哪些基因及可誘導(dǎo)基因表達(dá)的程度還不清楚[11]。有研究表明植物來(lái)源及人工合成的一些化合物能夠有效激活Nrf2。姜黃素、槲皮素、叔丁基對(duì)苯二酚3 種化學(xué)物質(zhì)作為Keap1-Nrf2-ARE 信號(hào)通路的小分子激活劑，被認(rèn)為是低活性的抗氧化劑，然而，這些化合物在較高濃度時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，而且其引起的具體氧化應(yīng)激相關(guān)基因的改變目前尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究基于HaCaT細(xì)胞，研究過(guò)氧化氫、槲皮素、姜黃素及叔丁基對(duì)苯二酚對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響，關(guān)于Nrf2途徑對(duì)減少氧化應(yīng)激的影響的研究將有助于確定每種化合物的安全劑量，擬為抗氧化劑的添加提供依據(jù)。研究結(jié)果表明，不同濃度以及不同處理時(shí)間，上述4 種化合物可引起HaCaT 細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。

過(guò)氧化氫作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在免疫細(xì)胞活化、血管重塑、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程中起著重要的作用，同時(shí)也是體內(nèi)幾種經(jīng)典的酶(葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶、膽固醇氧化酶等)催化的生物化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物[12]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)氧化氫濃度為≤1 mmol/L 時(shí)，HaCaT 細(xì)胞的存活率在80%以上。細(xì)胞在正常狀態(tài)下也能產(chǎn)生低濃度的過(guò)氧化氫，在過(guò)氧化氫酶的作用下分解成水和氧。過(guò)氧化氫能夠激活Nrf2，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用[13]。過(guò)氧化氫本身作為ROS，能夠直接誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，過(guò)氧化氫0.5 mmol/L 處理HaCaT 細(xì)胞4 h 后不會(huì)引起HaCaT 氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變，1.25 mmol/L處理HaCaT細(xì)胞4 h 引起ALB、CCL5、SOD3、HMOX1、SPINK1共5種基因表達(dá)上調(diào)。24 h 時(shí)，0.5和1.25 mmol/L處理HaCaT 細(xì)胞均能引起基因DUOX2和AKR1C2表達(dá)升高；此外，1.25 mmol/L過(guò)氧化氫處理HaCaT細(xì)胞還可引起HMOX1和TXNRD1基因表達(dá)上調(diào)，ALOX12、AOX1及CCL5基因表達(dá)下調(diào)。

姜黃素和槲皮素均屬于植物多酚類，是天然的抗氧化劑，可增強(qiáng)機(jī)體抵抗ROS 或活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)的能力，均與Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)[14]。在臨床上，姜黃素被用來(lái)降低術(shù)后炎癥反應(yīng)。除了氧自由基清除作用，姜黃素還能降低促炎因子的表達(dá)(如TNF-α、IL-β、IL-6)[15]。同時(shí)，姜黃根來(lái)源的姜黃素能夠激活Nrf2，參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示，與過(guò)氧化氫相比，不同濃度姜黃素處理HaCaT 細(xì)胞4 h 后不僅可引起ALB、CCL5、HMOX1和SPINK1共4 種 基 因 上 調(diào)外，還 可 引 起HSPA1A、NOS2、CYGB、EPHX2、APOE、LPO等多種基因的上調(diào)，并且引起GSR基因表達(dá)下調(diào)。與本研究一致的是，張春云等[17]使用姜黃素對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)鯽魚肝損傷的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)姜黃素處理后的鯽魚肝切片中，ALB的含量顯著增高。但也有研究表明[18]，姜黃素受濃度影響，具有親氧化劑和抗氧化劑雙向調(diào)控性，但促氧化劑的作用劑量目前還未見(jiàn)報(bào)道，需進(jìn)一步研究。有研究表明槲皮素具有抗氧化，清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的功能，具有抗腫瘤等作用。槲皮素也是通過(guò)Nrf2 來(lái)發(fā)揮抗氧化作用[19]。本研究中，槲皮素200 和500 μmol/L 處理HaCaT 細(xì)胞4 h 均能引起ALB基因表達(dá)上調(diào)，但與過(guò)氧化氫相比，500 μmol/L 處理4 h 后還能SEPP1基因表達(dá)下調(diào)，24 h后可引起KRT1基因表達(dá)下調(diào)。

叔丁基對(duì)苯二酚與上述3 種化合物一樣，能夠通過(guò)激活Nrf2，控制氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，降低ROS，促進(jìn)抗氧化酶的活力，進(jìn)而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，活化Nrf2 信號(hào)通路[20-22]。叔丁基對(duì)苯二酚10 μmol/L 處理HaCaT 細(xì)胞24 h 能引起ALB、HMOX1等基因表達(dá)的上調(diào)，與姜黃素和槲皮素有相同的效應(yīng)。劉輝等[23]對(duì)增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力機(jī)制的研究結(jié)果表明，叔丁基對(duì)苯二酚處理后的細(xì)胞，Nrf2的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，NQO1和GCLC的表達(dá)也呈一致性升高，這與本研究結(jié)果一致。

Keap-Nrf2-ARE 信號(hào)通路對(duì)抗氧化防御機(jī)制非常重要，激活Keap-Nrf2-ARE系統(tǒng)，對(duì)開(kāi)發(fā)抗氧化藥物具有重要意義。本研究顯示，HMOX1基因在四種化合物處理后均上調(diào)表達(dá)，其中姜黃素和叔丁基對(duì)苯二酚引起的基因表達(dá)量上調(diào)明顯。HMOX1作為一種細(xì)胞保護(hù)酶，具有抗炎和抗氧化特性，可在多種有害環(huán)境刺激和疾病狀態(tài)下誘導(dǎo)產(chǎn)生，已有研究證明Nrf2 是HMOX1啟動(dòng)子激活的重要轉(zhuǎn)錄因子，HMOX1啟動(dòng)子被促氧化刺激激活，主要是通過(guò)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子。氧化應(yīng)激介導(dǎo)的HMOX1啟動(dòng)子激活誘導(dǎo)lacZ基因表達(dá)[24]。HMOX1基因轉(zhuǎn)錄可能會(huì)受到熱療、炎性細(xì)胞因子或特定的磷酸化依賴性信號(hào)級(jí)聯(lián)的刺激[25]。此外，研究表明，BNIP3 蛋白通常在正常細(xì)胞和組織中低表達(dá)，包括骨骼肌、心肌細(xì)胞、大腦和心臟的細(xì)胞和組織，并通過(guò)參與多種細(xì)胞信號(hào)通路參與多種細(xì)胞功能[26]，但本研究結(jié)果顯示，BNIP3基因在榭皮素的作用下上調(diào)表達(dá)明顯。

綜上所述，姜黃素、槲皮素及叔丁基對(duì)苯二酚作為Nrf2的激活劑，研究其對(duì)84種氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響，為抗氧化劑的添加提供了實(shí)驗(yàn)支持。本研究結(jié)果表明過(guò)氧化氫、姜黃素、槲皮素及叔丁基對(duì)苯二酚分別處理HaCaT細(xì)胞后，引起部分氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平升高，部分表達(dá)水平降低。而且處理濃度越高，處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平的影響越大，為抗氧化劑的添加提供一定的理論依據(jù)。