田曉琳，楊玲玲，趙 倩，仇玉蘭，孫子龍，牛瑞燕，*，閻小艷，*

(1．山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西省環(huán)境獸醫(yī)重點實驗室，山西 晉中 030801；2．山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室，山西太原 030001)

無機氟和砷是自然界中廣泛存在的環(huán)境污染物。中國是全球地方性氟、砷中毒較為嚴重的國家，由于特殊的氣候、地貌和地質(zhì)特征，我國面臨著地下水中多種地質(zhì)污染的情況，其中高氟與高砷的共存現(xiàn)象廣泛分布在高堿度的半干旱地區(qū)，包括河套盆地、大同盆地、松嫩平原及準葛爾盆地等[1-3]。因此我國地下水氟、砷的廣泛分布對人類和動物健康產(chǎn)生有害影響，成為最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一[4]。

慢性氟中毒與慢性砷中毒均集中表現(xiàn)為全身多器官、多系統(tǒng)的損傷。眾多研究表明，腎臟作為機體主要的排泄器官，是機體氟、砷代謝的必經(jīng)之路。1937年Dharmaratne 等[5]首次發(fā)現(xiàn)氟暴露可能導致機體腎臟組織發(fā)生病變。隨后的流行病學表明，氟一方面改變腎功能相關(guān)酶的代謝活力，導致腎功能紊亂[6]，另一方面導致人體腎小管上皮細胞產(chǎn)生病變，促進慢性腎臟疾病的發(fā)生[7-8]。砷在1978 年被國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)確定為致癌物，其中飲用水中砷長期暴露不僅增加機體非癌病變風險，而且引發(fā)癌變[9]。2021 年美國環(huán)境保護署學者，基于美國疾病控制與預防中心提供的砷暴露數(shù)據(jù)與國家癌癥研究所2011—2015年的癌癥數(shù)據(jù)，采用回歸模型預測發(fā)現(xiàn)每年砷的累計濃度與腎癌的發(fā)生率呈正相關(guān)[10]?？梢?，氟和砷的單獨暴露可對腎臟造成毒性損傷，然而現(xiàn)階段關(guān)于氟與砷聯(lián)合中毒的相關(guān)研究仍處于初期階段。

細胞自噬不僅參與了腎臟正常的發(fā)育及衰老過程，更多的體現(xiàn)在其對急性腎損傷、腎纖維化、免疫性腎小球疾病、足細胞病及IgA 腎病等疾病發(fā)生發(fā)展的調(diào)控[11]?？梢?，在腎臟發(fā)育及疾病中，細胞自噬在腎小球與腎小管中均發(fā)揮了重要的作用。因此，為進一步完善氟、砷暴露對腎臟的毒性損傷機制，本研究建立妊娠期至成年期氟、砷單獨及聯(lián)合暴露大鼠模型，初步評估了氟、砷單獨及聯(lián)合暴露對模型大鼠腎臟組織形態(tài)學、超微結(jié)構(gòu)的毒性影響，并進一步探究細胞自噬在氟、砷所致腎臟毒性損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氟化鈉與亞砷酸鈉(美國Sigma公司)；Masson染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；LC3抗體和p62抗體(美 國CST 公 司)；Beclin1 抗 體(美 國Abcam 公司)；GAPDH抗體(美國Abcam公司)；熒光二抗(中國博士德生物有限公司)。

1.2 實驗儀器

JEM-1011 透射電子顯微鏡(日本JEOL 公司)；酶標儀(美國Bio-Tek 公司)；萊卡切片機(德國Leica 公司)；Chemi-Doc 成像系統(tǒng)(英國Bio-Rad 公司)；CK40倒置顯微鏡和正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 妊娠期至成年期氟、砷單獨及聯(lián)合暴露動物模型的建立

本研究SD 大鼠由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK(晉)2019-0007。研究建立妊娠期至成年期氟與砷單獨及聯(lián)合暴露的子代雄性大鼠模型，采用飲水染毒方式，分為4 組即對照組(蒸餾水)、氟暴露組(100 mg/L 氟化鈉)、砷暴露組(75 mg/L亞砷酸鈉)、氟與砷聯(lián)合暴露組(100 mg/L氟化鈉+75 mg/L 亞砷酸鈉)。子代大鼠在妊娠期經(jīng)其母體宮內(nèi)暴露于氟、砷；哺乳期(出生后第0 天至第21 天斷乳)經(jīng)母乳暴露于氟、砷；斷乳后，通過飲水染毒方式暴露至120 d 后，各組隨機選6 只子代雄性大鼠作為本研究最終試驗大鼠。采集腎臟組織，稱量體質(zhì)量與腎臟質(zhì)量，并計算腎系數(shù)。

1.4 腎臟組織病理學觀察

采集子代雄性大鼠新鮮腎臟皮質(zhì)部分組織，固定于多聚甲醛中；經(jīng)過脫水、透明后將組織包埋成蠟塊；切為厚3 μm 的切片，并確保切片中有腎小球與腎小管的分布；最后采用Masson染色試劑盒染色并評估腎臟組織形態(tài)學改變。

1.5 腎臟組織超微結(jié)構(gòu)的觀察

采集子代雄性大鼠新鮮的腎臟皮質(zhì)部分組織，切成1 mm3大小的切塊，經(jīng)過固定、脫水、包埋后進行切片與染色，此過程中需要經(jīng)過半包埋技術(shù)以確定所包埋組織中均包含有腎小球與腎小管的分布，最后每個組織制備2~3 張切片在透射電鏡下觀察腎臟組織中腎小管及腎小球的超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6 Western blot 測定腎臟組織自噬相關(guān)蛋白的表達

取30 mg腎臟皮質(zhì)部分組織，加入300 μL裂解液混合物，研磨儀破碎組織后，1×104r/min 離心5 min，采用BCA法測定蛋白濃度，計算并配制體系后將蛋白煮沸變性備用。配制分離膠與濃縮膠，加樣后采用恒壓電泳與恒流轉(zhuǎn)膜，之后將膜封閉2 h，一抗孵育過夜，洗滌3 次后再孵育二抗，膜上滴加ECL 發(fā)光液后上機曝光，最后獲得條帶并保存。本實驗中涉及的一抗包括： 自噬基因Atg6 同系物(homologue of autophagy gene Atg6，Beclin1)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated proteins light chain 3，LC3)、泛素結(jié)合蛋白p62(ubiquitin-binding protein p62，p62)、植物磷酸甘油酸脫氫酶(GAPDH)。GAPDH、Beclin1、LC3 與p62 的一抗稀釋比例分別為1∶10 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000；二抗稀釋比例均為1∶4 000。

1.7 免疫熒光測定腎臟組織自噬相關(guān)蛋白的表達

切取3 μm 腎臟組織白片60 ℃烘烤3 h 后進行脫蠟與復水，使用過氧化氫溶液去除內(nèi)源性酶，檸檬酸鈉溶液進行抗原修復，滴加5% BSA 封閉15 min，并依次在濕盒中滴加一抗(稀釋比例為1∶200)過夜，隨后滴加熒光二抗(稀釋比例為1∶100)在室溫孵育2 h，最后使用DAPI 染細胞核，用熒光猝滅劑封片后使用熒光顯微鏡觀察自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3 與p62 的熒光強度與分布情況(避光環(huán)境下操作)。每組隨機選取3 只大鼠腎組織切片，每張切片隨機選擇6 個視野進行定量分析并取平均值。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用xˉ±s進行統(tǒng)計描述，單因素方差分析進行組間比較，LSD-t進行兩兩比較，交互作用采用析因分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 氟與砷單獨及聯(lián)合暴露對大鼠腎系數(shù)的影響

基于氟、砷單獨及聯(lián)合暴露的子代SD 大鼠模型，腎系數(shù)的改變?nèi)鐖D1 所示，相較于對照組，砷暴露組腎系數(shù)顯著升高(P＜0.01)，而氟暴露組與聯(lián)合暴露組腎系數(shù)未見顯著性改變。

圖1 氟、砷暴露對腎系數(shù)的影響(n=6)

2.2 氟與砷單獨及聯(lián)合暴露對大鼠腎臟組織纖維化病變的影響

Masson 染色結(jié)果見圖2。腎小球腎小管上皮細胞胞漿、間質(zhì)細胞胞漿、肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色。對照組腎小球腎小管完整，腎小管腎間質(zhì)纖維化不明顯；氟暴露組著色較深，腎小球和腎間質(zhì)毛細血管內(nèi)紅細胞淤積增多，腎小管肌纖維化輕微加重，腎小球旁的腎小管排列紊亂，腎間質(zhì)纖維化加重；砷暴露組腎小球基底膜斷裂，腎小管輕微擴張，肌纖維化加重，腎間質(zhì)纖維化加重；氟與砷聯(lián)合暴露組，腎小球萎縮并伴有系膜增生，腎小管擴張并伴有上皮細胞碎片脫落，腎間質(zhì)纖維化加重。

圖2 氟、砷暴露對腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響(標尺50 μm，20 μm)

2.3 氟與砷單獨及聯(lián)合暴露對大鼠腎小球系膜細胞的影響

腎小球系膜細胞的超微結(jié)構(gòu)觀察如圖3 所示，相較于對照組，各暴露組系膜細胞數(shù)量增多，氟暴露組與砷暴露組中腎小球系膜數(shù)量增多，氟與砷聯(lián)合暴露組中系膜細胞數(shù)量增多的同時并伴隨胞漿內(nèi)容物的蓄積。

圖3 氟、砷暴露對腎小球系膜細胞的影響(標尺5 μm，2 μm)

2.4 氟與砷單獨及聯(lián)合暴露對大鼠腎小球足細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

足細胞內(nèi)細胞器的超微結(jié)構(gòu)如圖4 所示，相較于對照組，各暴露組中大鼠腎臟組織足細胞內(nèi)線粒體空泡化，部分嵴斷裂；氟暴露組中發(fā)生了嚴重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張；砷暴露組中觀察到典型的自噬小體。

圖4 氟、砷暴露對腎小球足細胞的影響(標尺2 μm，500 nm)

2.5 氟與砷單獨及聯(lián)合暴露對大鼠腎臟自噬相關(guān)蛋白熒光分布及表達的影響

自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62 在腎臟組織中的表達水平見圖5。與對照組相比，各暴露組中Beclin1、LC3、p62 蛋白的表達顯著增加(P＜0.05)。細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62 分別在腎小球與腎小管中的熒光分布情況見圖6 和圖7。與對照組相比，各暴露組中自噬蛋白的熒光強度增加且熒光分布面積增大；進一步的統(tǒng)計學分析結(jié)果如圖8 所示，在腎小球與腎小管中，氟、砷單獨及聯(lián)合暴露導致組織中自噬蛋白Beclin1、LC3、p62 的表達水平均顯著升高(P＜0.01)。

圖5 氟、砷暴露對腎臟組織中Beclin1、LC3、p62蛋白表達水平的影響(n=6)

圖6 氟、砷暴露對腎小球中Beclin1、LC3、p62蛋白表達的免疫熒光分布的影響(標尺50 μm，20 μm)

圖7 氟、砷暴露對腎小管中Beclin1、LC3、p62蛋白表達的免疫熒光分布的影響(標尺50 μm，20 μm)

圖8 氟、砷暴露對自噬相關(guān)蛋白的免疫熒光分布的影響(n=3)

2.6 氟與砷在對腎臟自噬相關(guān)蛋白熒光分布及表達的交互影響

腎臟組織中細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62的表達水平結(jié)果中，氟與砷的析因分析見表1，結(jié)果顯示氟與砷均存在交互作用(均為P＜0.01)。腎小球與腎小管中細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62 的熒光表達強度結(jié)果中，氟與砷的析因分析見表2。結(jié)果顯示在各指標中，氟與砷存在交互作用(均為P＜0.01)。由于各指標在氟與砷聯(lián)合暴露組中的表達低于單獨氟暴露組與砷暴露組之和，推測氟與砷交互作用可能為拮抗作用。

表1 氟與砷在Beclin1、LC3、p62蛋白表達水平中的析因分析表

表2 氟與砷在Beclin1、LC3、p62免疫熒光指標中的析因分析表

3 討 論

長期飲用氟或砷污染的地下水，對機體發(fā)育與健康構(gòu)成威脅，智利的一項流行病學調(diào)查顯示生命早期(子宮內(nèi)和嬰幼兒時期)暴露于砷環(huán)境可以增加暴露人群的死亡率[12]。多項研究表明，在生命早期，機體更容易受到砷的毒性危害，影響了嬰兒和兒童的生長發(fā)育[13-14]。此外，氟化物的暴露也增加嬰幼兒患氟斑牙風險，并與兒童腎臟損害密切相關(guān)[15-17]。印度雅魯藏布江平原的流行病學調(diào)查顯示，相較于成人，地下水中氟和砷同時暴露給兒童帶來更為嚴重的健康風險[18]。綜合以上結(jié)果，生命早期暴露于氟和砷的群體具有更高的患病風險。因此，為了更好的模擬地下水氟和砷的實際暴露情況，本課題建立了妊娠期至成年期的氟、砷單獨及聯(lián)合暴露的大鼠模型，氟與砷的暴露過程包括了母體的宮內(nèi)與母乳暴露方式及子代斷乳后自由飲水暴露方式。

研究表明腎臟組織病理學改變是氟和砷中毒性腎臟損傷的重要指標之一[19-20]。高濃度的氟暴露可引發(fā)腎小管擴張、變性、炎癥及纖維化[21]，而砷暴露也可導致腎小球萎縮、腎小管上皮細胞脫落等病變的發(fā)生[22]。這些報道與本研究中腎小管及腎小球的病理損傷結(jié)果相一致。此外，線粒體是為腎臟足細胞提供所需的能量的重要細胞器。多項研究表明，足細胞損傷伴隨著線粒體功能障礙的發(fā)生，加入線粒體呼吸鏈復合物抑制劑后氧化應激水平降低，同時有效的緩解了足細胞的損傷[23]；另一項研究也通過促進與抑制線粒體裂變，進而調(diào)控足細胞凋亡、足突消失等足細胞損傷的發(fā)生[24]。本研究首次在染毒組中觀察到腎小球足細胞中細胞器的改變，主要體現(xiàn)在線粒體的空泡化損傷，再次證實了線粒體在腎臟足細胞中的重要性。最重要的是在超微結(jié)構(gòu)中還觀察到典型自噬小體的分布，這一結(jié)果為我們提供了自噬相關(guān)研究的思路。

大量研究已表明，細胞自噬參與了氟和砷暴露對機體多器官毒性損傷的過程，如海馬、肝臟、睪丸與腎臟等[25-26]?？梢姡毎允稍诜?、砷致病機制中發(fā)揮了重要的作用。自噬體的形成是一個動態(tài)過程，主要分為起始階段、延伸階段及成熟與降解階段[27-28]，在此過程中，任何一個環(huán)節(jié)出錯均可能打亂體內(nèi)細胞自噬的平衡[29]。在起始階段，Beclin1招募自噬相關(guān)蛋白形成復合物，啟動自噬蛋白的級聯(lián)反應，調(diào)控細胞自噬水平[30]。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)氟、砷單獨及聯(lián)合暴露促進了腎小球與腎小管中Beclin1蛋白的表達，提示腎臟組織中細胞自噬流已經(jīng)啟動。而在延伸階段，LC3 泛素樣連接系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，促進了自噬囊泡的形成，LC3 是自噬小體生成的標志因子之一[31]。此外，自噬小體的成熟與降解階段是自噬發(fā)生過程中非常重要的一個環(huán)節(jié)，其中p62 水平的高低是評估細胞自噬流中自噬小體正常降解的重要指標，報道顯示p62的蓄積預示著自噬流末端阻遏現(xiàn)象的發(fā)生[32]。我們的實驗設計中，發(fā)現(xiàn)延伸階段中LC3在腎小球與腎小管中的表達升高，且氟、砷暴露后可增加自噬下游調(diào)控蛋白p62 的表達水平。近期的多項研究表明，在腎小管上皮細胞中，單獨的氟或砷暴露后可誘導Beclin1、LC3 與p62 等自噬相關(guān)蛋白表達上升，促進細胞自噬的發(fā)生[33-36]，與我們的結(jié)果相一致。

此外，為闡明氟與砷的聯(lián)合效應，在細胞自噬指標中，我們發(fā)現(xiàn)氟與砷之間存在交互作用。雖然從地球化學角度考慮，氟、砷兩種元素不存在相似性或耦合，但是有多項研究報道氟、砷之間存在明顯的相關(guān)性，并且這種相似性可能源于二者在堿性的地下水中均呈現(xiàn)負離子的形式[37-38]。此外，近年來多項研究試圖闡明氟與砷在機體中的聯(lián)合毒性效應，但尚未有明確的定論，Mittal等[39]在氧化應激指標中發(fā)現(xiàn)氟與砷聯(lián)合暴露減弱了單獨的氟與砷暴露的毒性作用；但是在發(fā)育神經(jīng)毒性研究中發(fā)現(xiàn)，氟與砷聯(lián)合暴露體現(xiàn)出更強的毒性作用[40]；除此之外，本課題組前期建立的氟、砷單獨及聯(lián)合對睪丸自噬[41]、心臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[42]以及腎臟氧化應激[43]的研究中，均發(fā)現(xiàn)氟與砷之間的交互作用。因此，本研究得出在腎臟組織細胞自噬水平中氟與砷之間呈現(xiàn)出拮抗作用，進一步結(jié)合上述已報道的文獻得出氟與砷對機體多器官毒性中可能存在聯(lián)合作用的初步結(jié)論，但是未來仍需進一步的探索。

總而言之，本研究表明妊娠期至成年期氟、砷單獨及聯(lián)合暴露可造成腎臟組織腎小管、腎小球及其內(nèi)部細胞器病變，并首次在腎小管與腎小球中發(fā)現(xiàn)細胞自噬的發(fā)生，并進一步在細胞自噬水平中發(fā)現(xiàn)氟與砷的聯(lián)合效應，為完善氟與砷聯(lián)合中毒的分子機制及預防干預提供了理論基礎(chǔ)。