黃詩(shī)斯 李 芬 廖曉梅 彭玉鳳

(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，郴州市 423000，電子郵箱：hssjhmb@163.com)

腎功能衰竭是各種腎臟疾病的終末期表現(xiàn)形式，主要表現(xiàn)為生化水平及內(nèi)分泌代謝嚴(yán)重紊亂。據(jù)調(diào)查，近20年來(lái)，我國(guó)腎功能衰竭的發(fā)病率為0.01%[1-2]。腎功能衰竭的內(nèi)科治療方式主要為透析治療，以改善患者清除能力及防止并發(fā)癥發(fā)生，治療目的是代替腎臟的排泄功能 ，清除體內(nèi)的各種毒素。腎功能衰竭患者常見(jiàn)的并發(fā)癥包括心血管并發(fā)癥及醫(yī)院獲得性感染等，其中并發(fā)感染患者的病死率達(dá)15%～38%，為患者死亡的第二大原因[3-4]。據(jù)報(bào)道，腎功能衰竭患者醫(yī)院獲得性感染的病原菌主要以革蘭陰性菌為主[5]，多表現(xiàn)為肺部感染及泌尿系統(tǒng)感染，但是不同研究中主要的病原菌分布及耐藥性分析的結(jié)果不一[6-7]。醫(yī)院獲得性感染的危險(xiǎn)因素包括高齡、低蛋白血癥、透析時(shí)間等，但目前關(guān)于醫(yī)院獲得性感染與患者基因多態(tài)性相關(guān)性的研究報(bào)道較少。有研究顯示，白細(xì)胞介素10(interleukin 10,IL-10)作為常用的炎癥指標(biāo)，其基因多態(tài)性與終末期腎病患者的肺部感染的發(fā)生有關(guān)[8]，而IL-10的基因多態(tài)性是否與細(xì)菌多重耐藥相關(guān)尚不可知。本研究探討腎功能衰竭并發(fā)醫(yī)院獲得性感染患者的病原菌分布特點(diǎn)，并分析其血清IL-10的rs1800871、rs1800872及rs1800896基因位點(diǎn)與細(xì)菌多重耐藥的相關(guān)性，為腎功能衰竭并發(fā)醫(yī)院獲得性感染患者的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2020年6月就診于我院腎內(nèi)科的165例腎功能衰竭患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者確診為腎功能衰竭且年齡≤75歲；(2)無(wú)其他嚴(yán)重合并癥；(3)在入院之前未發(fā)生感染；(4)自愿同意參加本研究并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)終末期腎功能衰竭、急性腎功能衰竭患者；(2)合并其他腎臟疾病患者。165例患者中男性109例、女性56例，年齡(48.6±8.37)歲。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[9]中的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范采集并發(fā)醫(yī)院獲得性感染患者的標(biāo)本，其中疑似呼吸道感染患者采集晨起痰液標(biāo)本，疑似泌尿系統(tǒng)感染患者采集中段尿標(biāo)本，皮膚感染患者采集皮膚分泌物標(biāo)本，其余感染或疑似感染患者采集前臂靜脈血。采集完畢之后送至檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及耐藥性分析。治療期間，根據(jù)需要可多次采集標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)及耐藥性分析 血液標(biāo)本采用全自動(dòng)血培養(yǎng)儀進(jìn)行菌株鑒定，其余標(biāo)本接種至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)出的病原菌選擇純菌落后使用全自動(dòng)細(xì)菌檢定儀(法國(guó)生物梅里埃公司，型號(hào)：VITEK?2Compact)進(jìn)行菌株測(cè)定，質(zhì)控菌株(來(lái)自國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心)為銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922，每周作標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)控校核1次，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。藥敏實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)微生物藥敏分析儀(德國(guó)西門(mén)子公司，型號(hào)：MicroScan WalkAway 96 Plus)及配套的藥敏卡進(jìn)行檢測(cè)，頭孢哌酮/舒巴坦使用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的藥敏試驗(yàn)操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥物的敏感性進(jìn)行劃分[10]。細(xì)菌耐藥率=(耐藥+中介)株數(shù)/總株數(shù)×100%。多重耐藥主要是對(duì)臨床使用的三類或三類以上抗菌藥物同時(shí)出現(xiàn)耐藥的細(xì)菌。

1.4 基因多態(tài)性分析

1.4.1 血樣標(biāo)本的采集及保存：采集并發(fā)醫(yī)院獲得性感染患者的外周靜脈血5 mL于枸櫞酸鈉抗凝管中，顛倒混勻后填寫(xiě)編號(hào)，于-80℃下冷凍保存。

1.4.2 標(biāo)本DNA提?。喊凑誕IAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒(荷蘭Qiagen公司，批號(hào)：51104)說(shuō)明書(shū)的使用方法，首先將血液標(biāo)本低溫融化后，取0.1 mL標(biāo)本至離心管中，加入蛋白酶K 20 μL，混勻后加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)，加入試劑盒中的Buffer AL 0.2 mL，混勻后56℃消化10 min裂解樣本，充分裂解后加入0.2 nL乙醇，8 000 r/min離心1 min洗脫。將濾液放置于新的制備管中，加入0.5 mL的Buffer AW1震蕩30 s，8 000 r/min離心1 min；將濾液放置于新的制備管中，再加入0.5 mL的Buffer AW2震蕩30 s，14 000 r/min離心1 min；將濾液放置于新的制備管中，最后加入80 μL Buffer AE，靜置5 min后8 000 r/min離心1 min，留取收集管中的DNA洗脫液。吸取5 μL DNA提取物，再用蒸餾水稀釋至1 mL，移至分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：Nano-300)的比色槽中，讀取吸光度260/吸光度280處的比值，比值在1.8～2.0之間表示DNA純度較好。

1.4.3 基因分型檢測(cè)：使用高通量單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)分型技術(shù)對(duì)IL-10基因進(jìn)行分型檢測(cè)，在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找IL-10基因的全長(zhǎng)序列，根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]篩選IL-10與感染相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，分別為rs1800871、rs1800872及rs1800896。采用 Primer 3軟件特異性連接引物，由上海生工生物股份有限公司合成。3個(gè)SNP位點(diǎn)的引物序列如下：rs1800871上游引物序列為5′-TCATTCTATGGTGGAGATGG-3′，下游引物序列為5′-TGGGGGAAGTGGCTAAGAGT-3′；rs1800872上游引物序列為5′-CCTCAGCACTACCTGACTAGC-3′，下游引物序列為5′-GGTGAGCACTACCTGACTAGC-3′； rs1800896上游引物序列為：5′-CCAAGACAACACTACTAAGGCTCCTTT-3′，下游引物序列為5′-GCTTCTTATATGCTAGTCAGGTA-3′。

1.4.4 PCR擴(kuò)增：使用PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：Bio-Rad S1000)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系為50 μL，其中PCR Master Mix 25 μL、模板DNA 2.5 μL、上下游引物各0.25 μL，剩余的用無(wú)酶水補(bǔ)齊。rs1800896擴(kuò)增條件為:94℃，5 min，預(yù)變性；94℃，20 s變性；56℃，30 s退火；72℃，30 s延伸；共35個(gè)循環(huán)；最后72℃末端延伸3 min。rs1800871擴(kuò)增條件為：94℃，5 min預(yù)變性；94℃，20 s變性；62℃，30 s退火；72℃，50 s延伸；共35個(gè)循環(huán)；72℃末端延伸3 min。rs1800872擴(kuò)增條件為：94℃，5 min預(yù)變性；94℃，20 s變性；60℃，30 s退火；72℃，50 s延伸；共35個(gè)循環(huán)；72℃末端延伸3 min。

1.4.5 PCR 產(chǎn)物的酶切：使用限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切：將0.2 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、1 μL緩沖液、0.1 μL限制性內(nèi)切酶及6.9 μL無(wú)酶水加入EP管中，充分混勻后放入37℃的恒溫恒濕箱中，反應(yīng)30 min。rs1800871、rs1800872及rs1800896的限制性內(nèi)切酶分別為MaeⅢ、RsaⅠ、BseRⅠ。

1.4.6 SNP位點(diǎn)的基因型分型：配制6%聚丙烯酰胺凝膠，加入電泳緩沖液，在加樣孔中加入5 μL DNA Marker、1 μL 6×DNA上樣緩沖液和5 μL DNA酶切產(chǎn)物，在其余加樣孔中依次加入上述緩沖液和DNA酶切產(chǎn)物，調(diào)節(jié)電壓300 V，電泳30 min后取出凝膠。將凝膠放于1‰硝酸銀溶液中，待充分染色后收集硝酸銀溶液，清洗凝膠后加入氫氧化鈉顯色溶液至DNA條帶顯色。觀察顯色的條帶數(shù)目并依次記錄DNA分型結(jié)果。

1.5 醫(yī)院獲得性感染的診斷標(biāo)準(zhǔn) 住院患者在住院期間發(fā)生的感染或醫(yī)院內(nèi)獲得出院后發(fā)生的感染，不包括入院前已開(kāi)始或已存在的感染。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腎功能衰竭并發(fā)醫(yī)院獲得性感染患者的一般情況 本研究中，腎功能衰竭患者并發(fā)醫(yī)院獲得性感染的比例為54.55%(90/165)，其中男性63例、女性27例，年齡38～75(54.3±8.65)歲，感染部位多發(fā)生在呼吸道及泌尿系統(tǒng)，其他感染部位有消化道、腹膜及導(dǎo)管處皮膚等，具體情況見(jiàn)表1。

表1 腎功能衰竭并發(fā)醫(yī)院獲得性感染患者的一般情況

2.2 腎功能衰竭并發(fā)醫(yī)院獲得性感染患者的病原菌分布 90例腎衰竭并發(fā)醫(yī)院獲得性感染患者共計(jì)送檢樣本134份，送檢樣本包括痰樣本、血樣本及分泌物等，同一患者僅保留相同細(xì)菌第一株(剔除重復(fù)菌株)，共培養(yǎng)出108株病原菌，檢出陽(yáng)性率為80.60%。病原菌分布以革蘭陰性菌為主，共計(jì)64株，占比為59.26%，其中以銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯、大腸埃希菌為主。革蘭陽(yáng)性菌共計(jì)32株，占比為29.63%，以金黃色葡萄球菌為主。少數(shù)患者先后培養(yǎng)出不同病原菌，如銅綠假單胞與白色假絲酵母菌、鮑曼不動(dòng)桿菌與銅綠假單胞菌等。見(jiàn)表2。

表2 腎功能衰竭并發(fā)醫(yī)院獲得性感染患者的病原菌分布情況(n)

2.3 革蘭陰性菌對(duì)常用抗生素的耐藥性分析 細(xì)菌耐藥性分析結(jié)果顯示：銅綠假單胞菌中多重耐藥菌為4株，占比為10.53%(4/38)；銅綠假單胞菌對(duì)頭孢曲松、亞胺培南及頭孢他啶的耐藥率較高，對(duì)阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦及慶大霉素的敏感性較高。肺炎克雷伯多重耐藥菌為2株，占比20.00%(2/10)；肺炎克雷伯對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松及左氧氟沙星的耐藥率較高。大腸埃希菌多重耐藥菌為1株，占比12.50%(1/8)；大腸埃希菌對(duì)頭孢曲松、左氧氟沙星及頭孢他啶的耐藥率較高。見(jiàn)表3。

表3 革蘭陰性菌對(duì)常用抗生素的耐藥情況

2.4 革蘭陽(yáng)性菌對(duì)常用抗生素的耐藥性分析 細(xì)菌耐藥性分析結(jié)果顯示：金黃色葡萄球菌中多重耐藥菌為6株，占比25.00%(6/24)，其中金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥率較高，對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感度較高。肺炎鏈球菌未檢出多重耐藥菌株，其對(duì)阿米卡星的耐藥率最高。溶血葡萄球菌未檢出多重耐藥菌株，其對(duì)阿米卡星、苯唑西林、慶大霉素的耐藥率較高。見(jiàn)表4。

表4 革蘭陽(yáng)性菌對(duì)常用抗生素的耐藥情況

2.5 腎功能衰竭并發(fā)醫(yī)院獲得性感染患者血清IL-10基因多態(tài)性與細(xì)菌耐藥的相關(guān)性分析 根據(jù)細(xì)菌多重耐藥的分析結(jié)果，將菌株分為多重耐藥組(n=13)及非多重耐藥組(n=95)，分析血清IL-10基因多態(tài)性與細(xì)菌多重耐藥的相關(guān)性。結(jié)果顯示：rs1800896位點(diǎn)的AA基因型在非耐藥組中的比例明顯升高，而GG基因型在非耐藥組中的比例明顯降低(均P<0.05)；rs1800871位點(diǎn)及rs1800872位點(diǎn)各基因型與細(xì)菌多重耐藥無(wú)明顯相關(guān)性(均P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 腎功能衰竭并發(fā)院內(nèi)獲得性感染患者血清IL-10基因多態(tài)性與細(xì)菌耐藥的相關(guān)性[n(%)]

3 討 論

腎功能衰竭患者由于內(nèi)環(huán)境紊亂，毒素?zé)o法及時(shí)排出體外，加之蛋白攝入量有限，營(yíng)養(yǎng)狀況欠佳，容易發(fā)生感染等并發(fā)癥[13]。由于腎功能衰竭患者的腎功能減退，極大地限制了其對(duì)臨床常用抗生素的使用，探討患者感染的發(fā)生原因并分析病原菌的耐藥特點(diǎn)，對(duì)經(jīng)驗(yàn)性治療腎功能衰竭并發(fā)感染患者具有重大意義。Laranjinha等[14]研究結(jié)果表明，終末期慢性腎功能衰竭患者由于營(yíng)養(yǎng)不良、機(jī)體免疫力下降、腎功能嚴(yán)重?fù)p害等導(dǎo)致患者透析耐受性下降，如此惡性循環(huán)使患者容易發(fā)生肺部感染。吳麗英等[15]研究表明，呼吸道感染是慢性腎功能衰竭血液透析患者合并感染的首要類型，與本研究結(jié)果相似。泌尿系統(tǒng)感染是醫(yī)院獲得性感染的常見(jiàn)類型，腎功能衰竭患者由于腎臟過(guò)濾功能減退，在少尿或無(wú)尿狀態(tài)下，尿液沖洗作用減退，使定植于泌尿道中的細(xì)菌發(fā)生逆行感染，從而導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)感染發(fā)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，泌尿系統(tǒng)感染的癥狀較呼吸道感染癥狀隱匿，患者腎衰竭的原發(fā)癥狀與泌尿系統(tǒng)感染癥狀時(shí)常混淆，容易被忽略。尿常規(guī)檢查簡(jiǎn)單易行且可判斷感染發(fā)生情況，因此臨床醫(yī)師應(yīng)提高腎功能衰竭患者尿常規(guī)的檢測(cè)頻率，盡早發(fā)現(xiàn)泌尿系統(tǒng)感染的跡象，盡快治療。

本研究細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏結(jié)果顯示，患者感染的病原菌以革蘭陰性菌為主，其中銅綠假單胞菌占59.38%(38/64)，多重耐藥菌占10.53%(4/38)。在臨床上，醫(yī)務(wù)人員在監(jiān)測(cè)到多重耐藥菌后，應(yīng)當(dāng)及時(shí)下隔離醫(yī)囑，并落實(shí)消毒隔離等措施，加強(qiáng)院感防控。本研究細(xì)菌耐藥性分析結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌對(duì)頭孢曲松、亞胺培南及頭孢他啶的耐藥率較高，對(duì)阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦及慶大霉素的敏感性較高。但是由于患者腎功能減退，選擇抗菌藥物時(shí)應(yīng)參考患者的內(nèi)生肌酐清除率[17]，若確實(shí)需要使用影響腎功能的抗生素時(shí)，一定要密切監(jiān)測(cè)患者腎功能。雖然銅綠假單胞菌感染患者對(duì)阿米卡星、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素的敏感性較高，但由于這兩類藥物具有腎毒性，應(yīng)盡量避免使用[18]；頭孢哌酮/舒巴坦在輕中度腎功能損害時(shí)可按原劑量使用，重度腎臟損害時(shí)需減量使用，敏感度較高的左氧氟沙星則均需減量使用[19]。本研究結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌感染時(shí)宜選擇頭孢哌酮/舒巴坦抗感染，大腸埃希菌感染時(shí)則可選用亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦及哌拉西林/他唑巴坦抗感染。

本研究中，革蘭陽(yáng)性菌感染病原菌以金黃色葡萄球菌為主，金黃色葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感度較高，因此萬(wàn)古霉素可作為甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌感染的首選，但是在腎功能衰竭患者中應(yīng)用萬(wàn)古霉素應(yīng)當(dāng)十分小心，如確需使用，應(yīng)先計(jì)算患者的肌酐清除率，根據(jù)患者的肌酐清除率確定給藥間隔及給藥劑量，當(dāng)肌酐清除率為40～110 mL/min時(shí)，建議每12 h給藥1次；20～40 mL/min時(shí)，每24 h給藥1次；小于20 mL/min時(shí)，每48 h給藥1次；若患者正在進(jìn)行血液透析，則注意監(jiān)測(cè)患者的血液濃度，使患者的血藥谷濃度維持在15 mg/L以上[20]。

IL-10作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，其基因多態(tài)性與多種感染性疾病相關(guān)[21-23]。研究表明，IL-10參與并調(diào)控腎功能衰竭患者的肺部感染，IL-10基因rs1554286位點(diǎn)中的G等位基因和rs1518111位點(diǎn)中的C等位基因可促進(jìn)肺部感染的發(fā)生[24-26]。本研究細(xì)菌多重耐藥性分析結(jié)果顯示，IL-10基因rs1800896位點(diǎn)的AA基因型在非耐藥組中的比例明顯升高，而GG基因型在非耐藥組中的比例明顯降低(均P<0.05)，這提示rs1800896位點(diǎn)的AA基因型為抗生素治療的有利因素，而GG基因型為抗生素治療的不利因素。有關(guān)潰瘍性結(jié)腸炎及兒童腸道病毒性感染的研究結(jié)果均顯示IL-10基因的rs1800871和rs1800872位點(diǎn)的基因多態(tài)性與細(xì)菌感染或病毒感染的嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)[11,27]，本研究結(jié)果也顯示，rs1800871和rs1800872位點(diǎn)的基因多態(tài)性與細(xì)菌耐藥無(wú)明顯相關(guān)性，提示在IL-10參與的感染中，rs1800871和rs1800872位點(diǎn)可能與感染過(guò)程和治療效果無(wú)關(guān)。

綜上所述，腎功能衰竭患者并發(fā)醫(yī)院獲得性感染的概率較高，病原菌以銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌為主，且多重耐藥率較高，選擇治療方案時(shí)應(yīng)以患者的藥敏結(jié)果及腎功能指標(biāo)為參考，合理選擇抗菌藥物，且患者血清IL-10的rs1800896基因多態(tài)性與細(xì)菌多重耐藥相關(guān)。但由于本研究樣本量有限，今后尚需擴(kuò)大樣本量對(duì)患者IL-10基因多態(tài)性與不同細(xì)菌多重耐藥的相關(guān)性進(jìn)行分析，進(jìn)一步明確IL-10的基因多態(tài)性與細(xì)菌耐藥的關(guān)系。