周小玨，馮婧，龐日朝，劉捷，張安仁

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院，四川成都市 610075；2.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，四川成都市 610036；3.加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)，加拿大溫哥華V6T1Z4；4.同濟大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，上海市200434

0 引言

脊髓損傷是脊柱骨折的嚴(yán)重并發(fā)癥，不僅會引起永久性神經(jīng)損傷，還會導(dǎo)致各種并發(fā)癥[1-2]；臨床尚未找到確切有效的治療方法[3]。脊髓損傷原發(fā)性損傷產(chǎn)生后數(shù)分鐘至數(shù)日內(nèi)會發(fā)展繼發(fā)性損傷，造成損傷區(qū)域內(nèi)瘢痕組織發(fā)育，神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞激活破壞，并導(dǎo)致進(jìn)一步組織破壞和損傷區(qū)擴展，降低功能恢復(fù)[4]。炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性損傷的主要原因[5-6]。

間歇性禁食(intermittent fasting,IF)和能量限制飲食(energy-restricted diet,ERD)是兩種常見的飲食限制方式，可能通過降低全身炎癥狀態(tài)[7]，特別是降低活性氧的生成[8]、抑制多種基因表達(dá)，參與組織水平炎癥反應(yīng)[9]。ERD 常用于治療肥胖及相關(guān)疾病[10-12]，而IF已經(jīng)演變?yōu)橐环N飲食方法[13]。隔日限食(every-otherday fasting,EODF)是另一種重要的飲食限制方式，即禁食24 h 與進(jìn)食24 h 交替進(jìn)行并不斷重復(fù)，不限飲水[14]。EODF 可促進(jìn)脊髓損傷大鼠運動功能恢復(fù)[15-17]，減輕病理損害和細(xì)胞凋亡[18-20]。本研究室發(fā)現(xiàn)，EODF能通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factorκB,NF-κB)通道的激活，抑制脊髓損傷繼發(fā)炎癥反應(yīng)。腸道菌群依賴的色氨酸代謝轉(zhuǎn)錄因子芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AHR)配體與AHR 結(jié)合后，可誘導(dǎo)細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子2 (suppressor of cytokine signaling 2,SOCS2)的表達(dá)，從而干擾NF-κB的激活，進(jìn)而降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[21]。EODF 也可通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮神經(jīng)保護作用[22]。

本研究觀察EODF 干預(yù)后，脊髓損傷大鼠脊髓組織AHR、SOCS2、NF-κB 和相關(guān)炎癥因子水平的變化，闡明EODF對脊髓損傷繼發(fā)性炎癥反應(yīng)的作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley 大鼠36 只，體質(zhì)量130～150 g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，動物許可證號SCXΚ(川)2008-24。大鼠分籠飼養(yǎng)在通風(fēng)、安靜、清潔的實驗環(huán)境下，室溫22～25 ℃，相對濕度40%～70%。術(shù)前所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由進(jìn)食飲水。實驗操作嚴(yán)格遵循中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會要求。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑

HE 染色試劑盒：北京索萊寶生物科技公司。HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體(ab6721)、SOCS2 抗體(ab109245)：美國ABCAM 公司。AHR 抗體(67785-1-lg)、HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG 抗體H&L (SA00001-1)：美國PROTEINTECH 公司。NF-κB 抗體(8242)、GAPDH 抗體(5174)：美國CST 公司。逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：日本TAΚARA公司。

1.2.2 主要儀器

FT228T 醫(yī)用動脈瘤夾(夾力70 g)：德國貝朗公司。施夾鉗：德國雷伯公司。精密電子天平：瑞士PRESRCA 公司。組織脫水機、包埋機、石蠟切片機：美國THERMO FISHER 儀器有限公司。高速冷凍離心機：美國THERMO 公司。DYY-6C 電泳儀、UV Transilluminator 化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀、qPCR 反應(yīng)儀：美國BIO-RAD公司。

1.3 模型制備

取24 只大鼠建立C5半側(cè)鉗夾脊髓損傷模型[23]。1.5%戊巴比妥鈉3.3 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥位，以肩胛骨間最高點T2棘突為起點，向頭側(cè)切口，長5 cm；逐層切開皮膚、筋膜、肌肉，充分暴露C4-6椎板和棘突。咬骨鉗咬除C5椎板，暴露C5脊髓。將縫合針頓性一端小心穿入C6神經(jīng)根上緣脊髓和椎板之間再退出，確保動脈瘤夾可順利通過。張開動脈瘤夾，沿縫合針穿過的通道，至前端靠近中央靜脈時，平穩(wěn)釋放動脈瘤夾，夾閉30 s 后撤去，可見夾閉處出現(xiàn)明顯血腫帶。止血，生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合消毒。模型成功標(biāo)志：術(shù)后大鼠損傷側(cè)前肢呈杵狀，行走時身體向損傷側(cè)偏斜，提尾懸空時患側(cè)前肢不能向前下方伸直。

另12 只大鼠僅夾除C5椎板，不造成脊髓損傷，為假手術(shù)組。

1.4 干預(yù)方法

造模成功大鼠分為模型組和EODF 組，各12 只。假手術(shù)組和模型組術(shù)后自由飲食，EODF 組術(shù)后立即禁食24 h(自由飲水)，之后24 h 予食物喂養(yǎng)，再禁食24 h，如此反復(fù)14 d。

術(shù)后大鼠均予每天腹腔注射生理鹽水1 ml，共3 d，防止脫水和電解質(zhì)紊亂。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 行為學(xué)評價

采用梳理試驗評價大鼠患側(cè)前肢運動功能[24]。造模前1～2 周，所有大鼠行行為學(xué)訓(xùn)練，使其熟悉行為學(xué)評價。于術(shù)前1 d，術(shù)后1 d、7 d、14 d 行梳理試驗。將直徑20 cm、高30 cm 透明圓筒置于清潔桌面上，大鼠放到圓筒中，圓筒兩側(cè)放置特制鏡子，以便從各個角度完整觀察大鼠自主理毛的過程中損傷側(cè)前肢活動范圍；數(shù)碼攝像機固定在三腳架上，置于圓筒正前方，每只大鼠采集活動視頻15 min。評分標(biāo)準(zhǔn)[24]：0 分，患側(cè)前肢下垂，無任何梳理活動；1 分，患側(cè)前肢有小范圍活動，在梳理過程中能夠達(dá)到鼻平面以下；2 分，患側(cè)前肢能進(jìn)行活動，在梳理過程中能夠達(dá)到鼻平面至兩眼水平面；3 分，患側(cè)肢體能自主活動，在梳理過程中能夠達(dá)到雙眼水平面；3.5 分，患側(cè)肢體能進(jìn)行較大范圍活動，在梳理過程中能夠達(dá)到眼水平面以上至兩耳水平面；4 分，患側(cè)前肢能進(jìn)行大范圍活動，在梳理過程中能夠達(dá)到兩耳水平面；5 分，患側(cè)前肢能進(jìn)行大范圍活動，在梳理過程中能夠達(dá)到雙耳后。

1.5.2 樣品采集

術(shù)后14 d，各組采用經(jīng)心灌注固定取脊髓組織[25-26]。1.5%戊巴比妥鈉3.3 ml/kg 腹腔注射麻醉，仰臥固定于操作臺上，打開胸腔，完全暴露心臟；剪開心尖，插入灌注針，灌入生理鹽水后立即剪開右心耳，生理鹽水快速灌流至大鼠肺、肝變白，改用4%多聚甲醛固定液繼續(xù)灌注，直至大鼠四肢和頸部僵硬。取損傷處前后0.5 cm 范圍內(nèi)的脊髓組織，每組4只大鼠脊髓組織置4%多聚甲醛固定液中固定，用于HE 染色；另8 只大鼠脊髓組織置-80 ℃保存，用于Western blotting和RT-qPCR。

1.5.3 HE染色

固定的脊髓組織梯度脫水，石蠟包埋，切片，厚4 μm，HE染色。光學(xué)顯微鏡5、10、20倍物鏡下觀察病理情況。

1.5.4 RT-qPCR

每組取4 只大鼠脊髓組織，提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書配制qPCR 反應(yīng)體系。以β-actin為內(nèi)參基因，計算2-ΔΔCT。

引物序列信息如下。

β-actin：上游5'-ACG GTC AGG TCA TCA CTA TCG-3'；下游5'-GGC ATA GAG GTC TTT ACG GAT G-3'。

AHR：上游5'-GCT GAG GTG CCT GCT GGA TA-3'；下游5'-GGA TGG ACG GTG GCT GAA GT-3'。

SOCS2：上游5'-AGT ACC AAG ACG GGA AAT TCA GAT-3'；下游5'-GCC TGT CCG TTT GTC CTT GC-3'。

NF-κB：上游5'-GCA ACA ACA CAG ACC CAG GAG T-3'；下游5'-CCA GGC GAG TTA TAG CTT CAG G-3'。

核因子κB 抑制因子α (inhibitor α of NF-κB,IκBα)：上游5'-CTT GGT GAC TTT GGG TGC TGA-3'；下游5'-GCC CTG GTA GGT TAC TCT GTT GA-3'。

腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)：上游5'-CAA GGA GGA GAA GTT CCC AAA TG-3'；下游5'-GGT TTG CTA CGA CGT GGG CTA-3'。

白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)：上游5'-AAG ACA AAG CCA GAG TCA TTC AGA G-3'；下游5'-TGG TCC TTA GCC ACT CCT TCT GT-3'。

1.5.5 Western blotting

每組4 只大鼠的脊髓組織加入蛋白提取裂解液，剪碎后勻漿10 s，重復(fù)3 次，每次間隔5 min。4 ℃12 000 g 離心30 min，取上清液。BCA 試劑盒以50∶1 加入A 液和B 液混勻，將BCA 試劑加入蛋白上清中，混勻后煮沸15 min。取總蛋白20 μg，SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF 膜，300 mA轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入AHR (1∶3000)、SOCS2 (1∶3000)、NF-κB (1∶1000)一抗，室溫下?lián)u床1 h，4 ℃孵育過夜。搖床復(fù)溫1 h，TBST 洗膜3次，每次5 min。加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體和HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG 抗體(1∶1000)，搖床孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min。ECL 顯影。采用Image J測定各條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計算目的蛋白與內(nèi)參的灰度值比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料服從正態(tài)分布且方差齊，以()表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 梳理試驗

術(shù)前各組梳理試驗評分無顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后，與假手術(shù)組比較，模型組和EODF 組術(shù)后各時間點評分均降低(P＜0.05)；模型組和EODF 組評分逐漸增加(P＜0.001)；與模型組比較，EODF組術(shù)后14 d評分增加(P＜0.05)。見表1。

表1 各組各時間點患側(cè)前肢梳理試驗評分比較

2.2 HE染色

假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)完好，未見出血、空洞壞死、炎性細(xì)胞浸潤等病理改變，灰白質(zhì)界限清晰。模型組脊髓組織出現(xiàn)大面積空腔，灰白質(zhì)界限模糊，神經(jīng)元分布紊亂，可見大量炎性細(xì)胞浸潤和廣泛出血灶。與模型組相比，EODF 組脊髓組織空洞壞死范圍較小，可見少量炎性細(xì)胞浸潤(圖1)。

圖1 各組脊髓組織病理(HE染色)

2.3 RT-qPCR

與假手術(shù)組比較，模型組AHR、SOCS2 和IκBα mRNA 水平降低(P＜0.05)，NF-κB、TNF-α 和IL-6 mRNA 水平升高(P＜0.05)；與模型組相比，EODF 組NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA 水平降低，AHR、SOCS2、IκBα mRNA水平升高(P＜0.05)。見表2。

表2 各組mRNA水平比較 單位：2-ΔΔCT

2.4 Western blotting

與假手術(shù)組相比，模型組AHR、SOCS2 水平降低(P＜0.05)，NF-κB 水平升高(P＜0.05)。與模型組相比，EODF 組AHR、SOCS2 水平升高(P＜0.05)，NFκB蛋白降低(P＜0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組AHR、SOCS2和NF-κB的蛋白表達(dá)水平(Western blotting)

表3 各組蛋白表達(dá)水平 單位：/GAPDH

3 討論

脊髓損傷根據(jù)損傷時間和病理生理變化可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷過程不可逆；繼發(fā)性損傷發(fā)生在原發(fā)性損傷之后，涉及細(xì)胞和分子水平變化，是可逆的[27-28]。炎癥是脊髓損傷后繼發(fā)性損傷的主要部分，嚴(yán)重程度取決于原發(fā)性損傷的機制及繼發(fā)病理過程[29]。創(chuàng)傷性損傷后，脊髓的炎癥反應(yīng)比腦更為廣泛、持久，募集的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量更多，血-脊髓屏障破壞區(qū)域更大，血管損傷持續(xù)時間更長[30]。

IF 和熱量限制是激活5'-腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPΚ)的自然方式。AMPΚ 可通過增加中性粒細(xì)胞趨化性和吞噬作用，調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，同時減輕感染引起的有害炎癥[31-33]。禁食模仿飲食(fasting mimicking diets,FMD)對炎性疾病中也有益[33]。EODF 可改善脊髓損傷大鼠脊髓病理變化，降低繼發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)大鼠運動功能恢復(fù)[15]。與本研究結(jié)果相同。

NF-κB 通路是脊髓損傷后神經(jīng)炎癥和凋亡調(diào)控的主要參與者[34]。在靜息狀態(tài)下，IκBα 與NF-κB p65、p50 兩個亞單位以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)上游信號激活I(lǐng)κB 激酶(IκB kinase,IΚΚ)后，活化的IΚΚ 泛素化、磷酸化并降解IκBα，使NF-κB p65、p50 活化，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)(尤其是p65)，與相應(yīng)的炎癥相關(guān)基因結(jié)合，誘發(fā)炎癥[4,35]。脊髓損傷后，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中均存在NF-κB 異常激活，使NF-κB 依賴的促炎細(xì)胞因子和趨化因子上調(diào)，炎癥細(xì)胞浸潤，神經(jīng)元凋亡，膠質(zhì)瘢痕形成；抑制NF-κB 通路可減輕脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)并改善其功能[34,36-37]。孫年怡[38]發(fā)現(xiàn)，EODF 可以通過調(diào)控NF-κB 活性和激活狀態(tài)，抑制脊髓損傷急性炎癥反應(yīng)。本研究顯示，EODF 后，脊髓損傷大鼠脊髓NF-κB 水平下降，IκB 水平升高。NF-κB 可能是EODF 抑制脊髓損傷繼發(fā)炎癥的分子基礎(chǔ)之一。

TNF-α 主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，參與炎癥和免疫反應(yīng)[39]，在許多病理狀況下增加，包括敗血癥、惡性腫瘤、心力衰竭和慢性炎癥性疾病[40]。脊髓損傷后，TNF-α 表達(dá)上升可促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤和炎癥[41]，并引發(fā)神經(jīng)元凋亡[42]。此外，高水平的TNF-α還加劇神經(jīng)性疼痛發(fā)生[43]。IL-6 與中樞神經(jīng)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、炎癥啟動相關(guān)，在脊髓損傷急性期激活NF-κB 會使其表達(dá)迅速上調(diào)[44]。禁食和熱量限制可通過降低血漿TNF-α 和IL-6 水平，改善炎癥狀態(tài)[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，EODF 后，脊髓損傷大鼠脊髓中TNF-α 和IL-6 水平下降，提示有顯著抗炎作用。

AHR 是配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，在上皮、內(nèi)皮、基質(zhì)和免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的分化與功能表達(dá)[46]。在AHR缺陷細(xì)胞中，NF-κB與多種啟動子的結(jié)合增加；AHR主要是通過與SOCS2 結(jié)合，干擾NF-κB 的激活[21,47-48]。在體外，AHR 上調(diào)SOCS2 表達(dá)；AHR 或SOCS2 缺乏都將導(dǎo)致NF-κB 活化增加，增加細(xì)胞氧化應(yīng)激[49]。EODF干預(yù)還可調(diào)控腸道菌群[50]，而腸道菌群可以將色氨酸代謝為AHR 激動劑[51]。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)EODF后，脊髓損傷大鼠脊髓組織中AHR 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平顯著升高。

總之，本研究顯示，EODF 可激活A(yù)HR/SOCS2/NF-κB 信號通路，抑制脊髓損傷后炎癥反應(yīng)，促進(jìn)脊髓損傷大鼠的運動功能恢復(fù)。未來或可通過糞菌移植的方式探究EODF 激活A(yù)HR/SOCS2/NF-κB 通路是否依賴腸道菌群；此外，EODF 調(diào)控脊髓損傷后繼發(fā)炎癥的其他信號通路也需進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。