宋濱陽 孫健 朱杰 王嬌 李偉平 陳雪瑜 慕俐君

ITP是一種自身免疫性疾病，由于針對自身反應(yīng)的B淋巴細胞增殖及分化，產(chǎn)生血小板膜糖蛋白抗體，導(dǎo)致血小板破壞過多，生成減少[1]。B淋巴細胞通過生成抗體、抗原提呈及分泌細胞因子共同參與機體的免疫調(diào)節(jié)，在自身免疫性疾病發(fā)病機制中起了重要作用[2]。因此尋找一種能夠調(diào)節(jié)B淋巴細胞功能的藥物，將有益于修復(fù)免疫，改善疾病進程?；倍甯嗍撬幱谜婢倍|(zhì)發(fā)酵后的熱水提取物，目前已有成品槐耳顆粒是一種傳統(tǒng)的抗腫瘤中藥，在其抗腫瘤的機制研究中發(fā)現(xiàn)其同時具有免疫調(diào)節(jié)作用[3]。槐耳清膏對于B淋巴細胞是否具有調(diào)節(jié)作用從而達到治療ITP疾病的目的，值得探究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

分析大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院診斷的20例ITP患者的外周血，中位年齡53.5（16.0～87.0）歲，其中男性8例，女性12例。患者血小板計數(shù)波動于1～28×109·L?1，所有患者診斷依據(jù)2020年中國原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）指南，除外繼發(fā)血小板減少且均有治療指征?；颊咧饕R床特征，見表1。同時收集與患者的年齡及性別匹配的健康人作為對照，中位年齡49.5（23.0～82.0）歲。本研究取得本院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

表1 患者臨床特征

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑 槐耳清膏（購于江蘇蓋天力藥業(yè)公司），溶解于RPMI-1 640溶液（購于美國Gibco公司），應(yīng)用0.22 μm 濾紙進行過濾，得到100 ng/mL的無菌溶液，?80℃冰箱儲存?？谷薈D40抗體購于美國BD公司。CpG寡聚脫氧核苷酸購于德國Miltenyi公司?？谷薈D27-FITC抗體、抗人CD19-PE抗體、抗人CD24-APC抗體、抗人CD45-AmCyan和抗人CD38-PE-Cy7均購于美國eBioscience公司。

1.2.2 流式細胞術(shù) EDTA抗凝血50 μL，根據(jù)試劑說明加入相應(yīng)量流式相關(guān)抗體如下：抗人CD27-FITC抗體、抗人CD19-PE抗體、抗人CD24-APC抗體、抗人CD45-AmCyan，抗人CD38-PE-Cy7，室溫避光孵育15 min，加入500 μL溶血素再次室溫避光孵育15 min。1 800 r離心4 min，用PBS洗滌2次后上機測流式。培養(yǎng)的細胞收集后用PBS洗滌1次，加入上述抗體，室溫避光孵育15 min，用PBS洗滌2次后上機測流式。

1.2.3 CCK-8 檢測細胞增殖 在96 孔板每孔加入濃度為1×104·mL-1B細胞（HMy2.CIR細胞系，購自大連陳鈺生物有限公司）懸液100 μL，加入不同濃度槐耳清膏處理細胞（2、4、6 mg），培養(yǎng)72 h，根據(jù)Cell Counting Kit-8(CCK-8，購于中國MCE公司)試劑說明，收集前向每實驗孔加入10 μL CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，待其中培養(yǎng)基變色明顯時檢測。每孔設(shè)3個復(fù)孔，檢測時用酶標儀檢測450 nm處吸光度，用公式計算出相應(yīng)的細胞活力, 應(yīng)用GraphPad Prism 5計算IC50。

1.2.4 外周血單個核細胞制備及培養(yǎng) EDTA抗凝患者外周血2 mL，按照操作指南，應(yīng)用Ficoll-Hypaque密度梯度分離液，即淋巴細胞分離劑（購于天津TBD生物公司）提取單個核細胞，加入含10%胎牛血清RPMI-1 640培養(yǎng)基共孵育，加入10 kU·L?1青霉素及100 mg·L?1鏈霉素，加入CD40 3 μg·mL?1，CpG 2 μg·mL?1活化B細胞。后加或不加4 mg·L?1槐耳清膏，置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，收集細胞測流式。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析。以t檢驗或單因素方法分析（one-way ANOVA）進行組間比較，數(shù)據(jù)以mean±SD表示。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP患者中B淋巴細胞比例高于健康對照組

比較20例ITP患者與健康對照組的外周血B細胞及其亞群是否有差異。應(yīng)用流式細胞儀進行B細胞及其亞群分析，CD19+作為B細胞標記，CD19+CD27+作為記憶B細胞標記，CD19+CD24+CD38+作為調(diào)節(jié)B細胞標記，設(shè)門進行分析（圖1A）。檢測結(jié)果顯示患者B細胞比例明顯高于健康對照[（11.260±0.715) vs. (13.890±1.039）]（圖1 B），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；記憶B細胞比例在ITP中較健康對照比有升高趨勢[（20.670±1.693) vs. (25.93±2.36）]，但差異無統(tǒng)計學意義（圖1C）。而兩組在調(diào)節(jié)B細胞比例上比較無顯著性差異[（10.960±1.441) vs. (8.855±0.930）]（圖1D）。

2.2 槐耳清膏抑制B淋巴細胞的增殖

應(yīng)用人B淋巴細胞株，用不同濃度（2、4、6 mg·mL?1）槐耳清膏處理不同時間（24、48、72 h），CCK-8結(jié)果提示：槐耳清膏抑制B細胞增殖，且呈劑量依賴，與時間無相關(guān)關(guān)系，濃度為4 mg·mL?1時抑制率約為50%。因此在后續(xù)的實驗中選用槐耳清膏4 mg·mL?1，見圖2。

2.3 槐耳清膏對于B細胞亞群的變化

采用CD40、CpG活化PBMC中的B細胞，用槐耳清膏處理PBMC，流式細胞結(jié)果提示：槐耳清膏處理后無論是記憶B細胞還是調(diào)節(jié)B細胞，比例均明顯下降。提示槐耳清膏可抑制記憶B（圖3A）、調(diào)節(jié)B細胞（圖3B）。差異均具有統(tǒng)計學差異（均P<0.05）。

3 討論

ITP是一類獲得性、免疫介導(dǎo)的、單獨表現(xiàn)為血小板減少的疾病，外周血血小板計數(shù)<100×109·L-1，需要除外藥物、感染、自身免疫性疾病、淋巴細胞增殖性疾病等其他繼發(fā)因素。目前，認為ITP的發(fā)生是由于針對血小板膜糖蛋白-GpⅡbⅢa、GpⅠb產(chǎn)生抗體，從而導(dǎo)致血小板在肝臟及脾臟中被巨噬細胞吞噬過多，而骨髓不能代償[4-5]，最終外周血血小板計數(shù)減少，引起出血傾向。其中B細胞被認為在發(fā)病機制中居于核心地位[6]。B細胞激活因子屬于腫瘤壞死因子配體超家族的一種，是B細胞正常發(fā)育的主要刺激因子，在ITP患者血漿中水平升高，也間接證明了B細胞的主要作用[7]。基于此，一線治療首先選擇糖皮質(zhì)激素，但長期有效率僅為50%，且66.67%患者最終會演變?yōu)槁赃^程。長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素易帶來不良反應(yīng)，使很多患者生存質(zhì)量下降。二線治療包括CD20單克隆抗體、促血小板生成素及血小板受體激動劑，但價格昂貴，存在一定的不良反應(yīng)，且難以維持或無法完全停藥。脾臟切除長期有效率可以達到60%以上，但為有創(chuàng)治療，而且有繼發(fā)感染的風險[8]。所以仍然需要探索新的治療。

中醫(yī)中藥是我國醫(yī)學特色，已經(jīng)有研究證明從中醫(yī)體質(zhì)角度進行調(diào)理ITP具有一定優(yōu)勢[9]?；倍w粒是一種傳統(tǒng)中藥，具有抗腫瘤作用[10-11]。在研究過程中發(fā)現(xiàn)其還具有免疫調(diào)節(jié)作用。同樣含有槐耳菌絲的槐杞黃顆粒已經(jīng)證明對于患兒ITP具有免疫調(diào)節(jié)作用[12]。那么，槐耳顆粒是否能夠調(diào)節(jié)成人ITP患者B淋巴細胞增殖與分化，達到治療疾病的目的，基于此，本課題組開展了此項研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者外周血中B淋巴細胞比例明顯高于正常對照，與既往報道相一致[13]。這與B細胞是血小板抗體的主要產(chǎn)生者，而ITP患者體內(nèi)血小板抗體增多有關(guān)[14]。CD20單克隆抗體能夠清除B淋巴細胞，被用于ITP的治療，證明了B細胞在ITP的發(fā)生中的重要作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，槐耳清膏能夠抑制ITP患者B細胞增殖，減少B淋巴細胞數(shù)量，類似去B細胞的作用。

記憶B細胞是B淋巴細胞亞群成分之一。文獻報道記憶B細胞激活后轉(zhuǎn)化為漿細胞，分泌抗體[16]，參與了免疫性疾病的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者記憶B淋巴細胞比例高于正常對照，但差異無統(tǒng)計學意義，這與Lyu等[17]報道相一致。經(jīng)槐耳清膏共孵育后，ITP患者記憶B細胞增殖明顯受抑。槐耳清膏抑制ITP患者記憶B細胞增殖，從而抑制了記憶B細胞向產(chǎn)生抗體的漿細胞過度轉(zhuǎn)化，發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用。因此，這可能是槐耳清膏治療ITP患者的潛在機制。

調(diào)節(jié)B細胞是B淋巴細胞亞群又一重要成分，通常認為其表達CD19+CD24+CD38+，在自身免疫疾病中發(fā)揮著重要的免疫抑制作用[18]。研究報道腎移植患者，調(diào)節(jié)B細胞增高是預(yù)測疾病預(yù)后良好的指標；相反，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中，由于調(diào)節(jié)B細胞分泌IL-10功能受損，導(dǎo)致疾病發(fā)生[18]。有研究證明，ITP患者調(diào)節(jié)B細胞比例下降，但治療有效后可以明顯增高[19]。但也有研究報道ITP患者調(diào)節(jié)B細胞高于正常對照，且高反應(yīng)的B細胞與α干擾素水平呈正相關(guān)[20]。故調(diào)節(jié)B細胞在ITP中的作用尚未明確。分泌IL-10是調(diào)節(jié)B細胞發(fā)揮作用的重要部分，因此其功能損傷而并非數(shù)目多少對ITP疾病的發(fā)生更為重要。因此，亟需進一步研究槐耳清膏對于細胞因子IL-10水平的變化。

綜上所述，本研究提示槐耳清膏體外可以抑制ITP患者B淋巴細胞的增殖，這為槐耳顆粒在ITP治療中提供了理論依據(jù)?；倍鳛閭鹘y(tǒng)中藥，成分穩(wěn)定單一，深入探討其免疫調(diào)節(jié)機制，將有助于槐耳顆粒在免疫相關(guān)疾病臨床上的應(yīng)用。