劉政 屠娟 黃蕾丹 董小小 李濘珊

放化療是臨床大多數(shù)惡性腫瘤的首選和主要治療方法，而免疫治療則是當(dāng)今最具發(fā)展前景的新興治療方法。然而，在這些治療中腫瘤常產(chǎn)生治療抵抗，嚴(yán)重影響了治療療效[1-3]。近年來，低強(qiáng)度超聲治療作為一種新的腫瘤治療抵抗的解決方法，正在受到業(yè)界的關(guān)注。

雖然超聲影像診斷在臨床廣泛應(yīng)用，但超聲的治療作用一直是超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要方向[1]。低強(qiáng)度超聲一般指平均聲強(qiáng)（ISPTA）低于3 W/cm2的聚焦式或非聚焦式治療超聲，采用單晶片或多晶片相控陣超聲換能器。單晶片換能器聚焦范圍小而固定，一般4 mm×2 mm，焦點(diǎn)聲壓高；多晶片相控陣換能器聚焦范圍和形態(tài)可調(diào)，可變范圍大。與高強(qiáng)度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）的熱消融機(jī)制不同，低強(qiáng)度超聲治療機(jī)制主要以空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)為主，往往需要聯(lián)合使用超聲造影劑微泡（microbubble）來誘導(dǎo)增強(qiáng)空化效應(yīng)，而熱效應(yīng)則需要避免，故也稱為微泡介導(dǎo)的超聲空化治療方法[2，4]。

近年來，低強(qiáng)度超聲用于腫瘤放化療和免疫治療增強(qiáng)的基礎(chǔ)研究成果令人矚目，具有安全無創(chuàng)、療效顯著、簡便等特點(diǎn)，其治療機(jī)制也逐漸明朗[2，5]。其中，因具有低強(qiáng)度超聲輸出的相控陣超聲診斷儀廣泛應(yīng)用于臨床，故直接采用超聲診斷儀實(shí)施超聲治療成為可能，并已被初步嘗試用于小樣本臨床研究[6]。

1 診斷超聲的治療機(jī)制

診斷超聲的治療原理與低強(qiáng)度超聲治療類似，但輸出能量和聲學(xué)參數(shù)更低,其平均聲強(qiáng)ISPTA<720 mW/cm2、機(jī)械指數(shù)（mechanical index，MI）<1.9、熱指數(shù)（thermal index，TI）<6.0，因此，診斷超聲在組織中產(chǎn)生的熱效應(yīng)微小可忽略，其治療機(jī)制以超聲空化（cavitation）和機(jī)械效應(yīng)為主。由于診斷超聲采用多晶片相控陣換能器，聚焦范圍及聚焦區(qū)聲壓可調(diào)（一般為0～3 MPa可調(diào)），并有實(shí)時影像監(jiān)控的特點(diǎn)。

生物組織中通常含有很多的微小氣核（如溶解的氧氣），當(dāng)超聲傳播且聲壓超過一定閥值時，這些氣核會發(fā)生空化諧振膨脹生成空化泡。在超聲作用下，空化泡會產(chǎn)生震蕩、膨脹、收縮以及內(nèi)爆等一系列動力學(xué)過程，釋放出輻射壓力、沖擊波、微射流等機(jī)械能量，在微血管壁或細(xì)胞膜上形成微小聲孔（圖1），即所謂聲孔效應(yīng)[7]（sonoporation），可能造成生物膜屏障通透性增高、甚至微小血管破壞和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效應(yīng)。早期研究認(rèn)為，在常用診斷超聲頻率范圍（1～5 MHz），生物組織自發(fā)空化所對應(yīng)的聲壓閾值較高，空化強(qiáng)度微弱，隨機(jī)性強(qiáng)，不易控制，不適用于臨床治療。

近年來，一系列研究表明，造影劑微泡的應(yīng)用賦予微泡精準(zhǔn)調(diào)控聲場能量的能力，將微泡作為空化核注入體內(nèi)可顯著降低空化閾值，高度聚集聲能，大幅度提高聲空化治療效應(yīng)；在較低聲壓（<0.3 MPa）驅(qū)動下，微泡產(chǎn)生較溫和的穩(wěn)態(tài)空化（stable cavitation），空化泡的周期性諧振會對附近細(xì)胞膜產(chǎn)生不斷的推拉作用或聲輻射壓力，或激發(fā)聲微流（microstreaming），進(jìn)而在細(xì)胞膜上產(chǎn)生小于94納米的聲孔（圖1）；當(dāng)驅(qū)動聲壓較大時（通常>0.3 MPa），主要引發(fā)造影劑微泡的非線性慣性空化（inertial cavitation，亦稱瞬態(tài)空化）行為。在此過程中，入射聲能會被高度集中，伴隨空化泡劇烈崩潰瞬間，在液體中的極小空間內(nèi)釋放出沖擊波、微射流等機(jī)械能量，瞬間擊穿周圍的組織血管壁和細(xì)胞膜等生物屏障，慣性空化導(dǎo)致的細(xì)胞膜穿孔可能過大（2～4微米）而無法修復(fù)，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[7]。這些超聲空化效應(yīng)所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)在腫瘤化療釋藥、放療增敏、基因轉(zhuǎn)染、開放血腦屏障和溶栓等眾多領(lǐng)域具有多種治療作用。

低強(qiáng)度超聲治療需要聯(lián)合靜脈注射超聲造影劑微泡，這種微泡平均粒徑為2～3 μm、微泡濃度為108～109/mL，其最佳諧振頻率為2～3 MHz，與低頻診斷超聲頻率符合。微泡在超聲治療中的作用不再是診斷作用，而是誘導(dǎo)空化效應(yīng)的空化核治療作用。

2 超聲腫瘤血流效應(yīng)

已知實(shí)體瘤的乏血供和乏氧狀態(tài)是造成腫瘤放化療和免疫治療抵抗的一個重要原因[3]，而診斷超聲治療具有刺激實(shí)體腫瘤血流灌注明顯增強(qiáng)的作用，即所謂“超聲腫瘤血流效應(yīng)（sononeoperfusion）”，可能是解決乏血供腫瘤治療抵抗的一個新方法。

2.1 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用參數(shù)改進(jìn)的診斷超聲[參數(shù)設(shè)置：頻率3～4 MHz、機(jī)械指數(shù)MI 0.25～0.30，脈沖重復(fù)頻率（pulse repetition frequency，PRF）1kHz]聯(lián)合靜脈注射微泡治療大鼠Walker-256腫瘤和兔VX2腫瘤10～20 min后，結(jié)果顯示約80%的動物腫瘤血流灌注明顯增強(qiáng)，灌注面積增大，對于乏血供腫瘤的效果尤為明顯，部分缺血無灌注區(qū)重新獲得血流灌注，可持續(xù)4 h以上[8-9]。研究還發(fā)現(xiàn)，從超聲造影定量分析結(jié)果看，腫瘤血流量平均增加18%、平均血流灌注面積增加31%以上。腫瘤血流增強(qiáng)的機(jī)制，可能是因?yàn)槲⑴菘栈瘜ξ⒀鼙诘臋C(jī)械刺激損傷，產(chǎn)生了炎癥反應(yīng)和多種炎性擴(kuò)血管因子釋放（圖2），治療后腫瘤組織的eNOs增加53.16%、NO增加28.80%、PGF2增加52.03%等。

2.2 臨床研究

由于超聲診斷儀和超聲造影劑微泡均是臨床常用的商品化醫(yī)療儀器和藥品，因此，在倫理批準(zhǔn)的情況下，進(jìn)行了小樣本乳腺癌[10]、胰腺癌和轉(zhuǎn)移性肝癌[11]的超聲化療臨床研究，治療參數(shù)為：發(fā)射頻率4 MHz，聲壓為0.3～0.6 MPa（對應(yīng)MI值0.15～0.30），PRF 20 Hz，脈沖寬度18個周期，超聲聚焦區(qū)大小為2.5～4.0 cm；治療中勻速靜脈注射（推注速率0.5 mL/min）SonoVue微泡一支。結(jié)果顯示，超聲治療后乏血供腫瘤的血流灌注明顯增強(qiáng)，具體表現(xiàn)為超聲造影顯示的腫瘤灌注面積增大、血流灌注強(qiáng)度增強(qiáng)（圖3）。

3 超聲化療

3.1 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究

超聲化療（sonochemotherapy）的基礎(chǔ)研究眾多，涉及面廣泛，包括超聲化療釋藥機(jī)制、熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)釋藥以及聯(lián)合實(shí)施方法等[2]。盡管這些研究采用的仍然是低強(qiáng)度超聲治療儀，但其平均聲強(qiáng)為22.57～2560 mW/cm2，聲壓在400 kPa～1.9 MPa，大部分參數(shù)均與診斷超聲能量范圍重疊，為利用診斷超聲聯(lián)合微泡實(shí)施低強(qiáng)度超聲治療提示了可能性。

超聲增強(qiáng)腫瘤化療的效果主要表現(xiàn)在以下方面[2]：增加腫瘤的化療釋藥1.5～10倍不等；超聲化療產(chǎn)生的腫瘤生長抑制效應(yīng)可以造成腫瘤體積下降2倍，其生存期一般顯著高于單純化療。雖然診斷超聲比一般治療超聲的聲強(qiáng)更低，但仍然獲得了較好結(jié)果，如診斷超聲聯(lián)合微泡不僅可在化療時增強(qiáng)腫瘤血流灌注、提高腫瘤血管通透性，而且可增加至少兩種動物腫瘤的局部化療釋藥濃度，從而加強(qiáng)化療對腫瘤的生長抑制和殺傷作用[8-9]。該研究中，診斷超聲增強(qiáng)的化療在MI僅0.25的情況下，顯著提高了阿霉素對大鼠Walker-256腫瘤的局部釋藥3.12倍，且在組織分布更均勻；在兔VX2腫瘤模型中，也提高了阿霉素在腫瘤組織中的藥物濃度2.63倍，并且顯著抑制了腫瘤生長。上述結(jié)果充分說明，診斷超聲可能具有與一般低強(qiáng)度治療超聲同樣的治療效應(yīng)。

3.2 臨床研究

近年診斷超聲已經(jīng)開始被嘗試用于增強(qiáng)臨床胰腺癌化療，初步結(jié)果令人矚目。Dimcevski等[6]研究采用診斷超聲聯(lián)合微泡用于失去手術(shù)機(jī)會的胰腺癌的吉西他濱單藥化療，為單中心、小樣本回顧對照研究，其超聲治療參數(shù)頻率為1.9 MHz，MI為0.2（聲壓0.27 MPa），脈沖寬度4個周期；治療時推注SonoVue微泡0.5 mL/3.5 min，治療時間共31.5 min；結(jié)果超聲化療顯著延長10例胰腺癌患者的中位生存期（超聲化療組17.6個月，單純化療組8.9個月），超聲化療的周期數(shù)（13.8 ± 5.6）也比單純化療組（8.3 ± 6.0）明顯提高，其中2例患者在超聲化療結(jié)束后重新獲得了手術(shù)機(jī)會。本課題組也在國內(nèi)完成了一項(xiàng)胰腺癌超聲化療隨機(jī)對照臨床研究（RCT）的入組和治療，試驗(yàn)組采用經(jīng)改進(jìn)的診斷超聲（參數(shù)：MI 0.2、脈沖寬度8.5個周期、PRF 2 kHz，治療時推注SonoVue微泡1 mL/5 min，治療時間共25 min）聯(lián)合胰腺癌經(jīng)典方案化療（吉西他濱+白蛋白紫杉醇），對照組僅實(shí)施經(jīng)典化療，結(jié)果在試驗(yàn)還未達(dá)到終點(diǎn)的情況下，試驗(yàn)組的疾病控制率（DCR）顯著優(yōu)于對照組（69.2% vs. 40%），且試驗(yàn)組能耐受的化療周期數(shù)高于對照組6.0個周期，以上臨床研究中，均未發(fā)現(xiàn)超聲化療有增加化療不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

4 超聲放療

4.1 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究

所謂超聲放療主要是通過超聲刺激增加腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞對放療的敏感性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，達(dá)到增強(qiáng)低劑量放療的目的[12-13]，產(chǎn)生該現(xiàn)象的主要機(jī)制是血管內(nèi)微泡空化諧振的機(jī)械性刺激（如剪切力、微射流等），促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞合成神經(jīng)酰胺（ceramide）。雖然內(nèi)皮合成神經(jīng)酰胺并不能直接克服腫瘤乏氧的放療抵抗，但通過一種酸性神經(jīng)磷脂酶（sphingomyelinase）誘導(dǎo)的神經(jīng)酰胺依賴機(jī)制卻顯示出低于8 Gy的低劑量放療有效殺傷腫瘤血管。

有學(xué)者對2-羥?；拾贝?-β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT8）在調(diào)控超聲放療引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的作用進(jìn)行了研究。UGT8 的主要功能是通過轉(zhuǎn)移尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）半乳糖基而合成半乳糖神經(jīng)酰胺——一種抗凋亡分子。在免疫缺陷鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，超聲放療可顯著下調(diào)UGT8表達(dá)而達(dá)到放療增敏效果，研究結(jié)論認(rèn)為，超聲對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械刺激，誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺進(jìn)入細(xì)胞而促進(jìn)細(xì)胞死亡，進(jìn)而明確了神經(jīng)酰胺和酸性鞘磷脂酶通過介導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷而實(shí)現(xiàn)放療增敏的作用[14]。

目前，超聲增敏放療的方法已經(jīng)在乳腺癌、膀胱癌、肝癌等多種腫瘤的動物模型中得到驗(yàn)證，展現(xiàn)出對2～8 Gy低劑量放療的顯著增敏效果，具有降低放療不良反應(yīng)的潛在意義[14]。盡管大多數(shù)基礎(chǔ)研究中，超聲治療仍然采用聚焦式超聲治療儀，但是不論其聲壓（550～570 kPa）、脈沖寬度（16個周期）和PRF（3 kHz）均在低強(qiáng)度超聲范疇，與診斷超聲參數(shù)有重疊且非常接近。

4.2 臨床研究

正因?yàn)槌暦暖熅哂械蛷?qiáng)度超聲治療和對低劑量放療增效的特點(diǎn)，最近有學(xué)者采用超聲診斷儀聯(lián)合微泡的方法實(shí)施臨床超聲放療研究。首次超聲放療的臨床研究應(yīng)用于原發(fā)性肝癌患者（hepatocellular carcinoma，HCC）的釔-90微球放療栓塞（transarterial radioembolization，TARE）治療，研究采用臨床常規(guī)的超聲診斷儀和造影劑微泡，而超聲治療選用微泡擊破模式（flash）進(jìn)行，其頻率為1.5 MHz，機(jī)械指數(shù)為1.13，PRF 100 Hz，脈沖寬度4個周期，聯(lián)合Optison微泡（0.18 mL/min），治療時間10 min，最后以mRECIST標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)4～6個月后的療效。結(jié)果顯示，在針對28例HCC患者的隨機(jī)對照研究（randomized controlled trial，RCT）中，超聲放療（共3次超聲治療）組患者獲得了93%的客觀緩解率，而對照組僅有50%（P<0.05，圖4）[15]。通過肝功能等放療相關(guān)的生化和血液檢查，未發(fā)現(xiàn)超聲放療有增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

5 超聲免疫治療

近年來，超聲空化治療方法也在增強(qiáng)腫瘤免疫治療方面凸顯希望[16-17]。超聲空化治療技術(shù)，從理論上可作用于腫瘤免疫周期的多個環(huán)節(jié)[18]，從而增強(qiáng)免疫治療療效（圖5）。其作用環(huán)節(jié)包括：1）直接機(jī)械性殺傷腫瘤細(xì)胞致抗原暴露，從而激活抗原提呈細(xì)胞，基于該理論的聲壓通常>3 MPa[19]；2）損傷腫瘤細(xì)胞，引起損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的表達(dá)，從而促進(jìn)樹突狀（DC）細(xì)胞成熟；3）介導(dǎo)效應(yīng)性T細(xì)胞歸巢，如刺激趨化因子、細(xì)胞因子釋放，從而募集效應(yīng)性T細(xì)胞到達(dá)腫瘤微環(huán)境；4）聲孔效應(yīng)突破“血-腫瘤屏障”，包括改變血管狀態(tài)、機(jī)械性擾動細(xì)胞外基質(zhì)[20]，從而有利于效應(yīng)性T細(xì)胞浸潤。

雖然超聲治療的能量形式具有多樣性，既有以熱效應(yīng)為主的HIFU、以高強(qiáng)度空化機(jī)械消融為主的組織毀損術(shù)（histotripsy），也有微泡介導(dǎo)的低強(qiáng)度超聲空化治療方法，而采用安全性更好的診斷超聲激勵微泡同樣也產(chǎn)生了顯著的治療作用。有研究[21]發(fā)現(xiàn)，診斷超聲聯(lián)合微泡治療產(chǎn)生的血流增強(qiáng)效應(yīng)聯(lián)合抗PDL1具有明顯抗腫瘤療效。具體表現(xiàn)在：增加了腫瘤中CD8+T細(xì)胞浸潤數(shù)量，CFSE標(biāo)記的活化CD8+T細(xì)胞數(shù)量為對照組的1.96倍（P<0.01）；增加了抗PDL1在腫瘤內(nèi)的濃度；聯(lián)合治療有促進(jìn)腫瘤血管正常化的趨勢；最后，超聲改善了腫瘤免疫治療微環(huán)境。因此，超聲血流增強(qiáng)效應(yīng)可作為增效PD-L1抗體腫瘤免疫治療的有效方法，目前超聲腫瘤免疫治療尚未見相關(guān)臨床研究報(bào)道。

6 安全性研究

診斷超聲和造影劑在臨床應(yīng)用分別有超過60年和20年的安全記錄，在超聲放化療臨床研究中也未發(fā)現(xiàn)有增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[6，11]，但是，其增強(qiáng)腫瘤血流效應(yīng)是否可能有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)是一個值得關(guān)注的問題。Zhang等[8]在采用兔VX2腫瘤模型的研究中，未發(fā)現(xiàn)超聲化療（阿霉素）有增加肺、腦、肝、腎等主要轉(zhuǎn)移靶器官的腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，超聲化療與單純化療之間比較轉(zhuǎn)移評級差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。其他類似研究也未發(fā)現(xiàn)診斷超聲有增加小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移或結(jié)直腸癌脾轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[21-22]。因此，診斷超聲用于增強(qiáng)腫瘤化療尚未發(fā)現(xiàn)有明顯的不良反應(yīng)。

7 針對超聲治療的儀器改進(jìn)

利用診斷超聲實(shí)施低強(qiáng)度超聲治療具有超聲影像引導(dǎo)的先天優(yōu)勢，由于診斷和治療脈沖是同一組換能器發(fā)射，診療信號完全同軸共面，故精準(zhǔn)性有保證。

然而，一般超聲診斷儀畢竟是為超聲診斷設(shè)計(jì)制造的，雖然也可以用于超聲治療，但是在聲學(xué)參數(shù)調(diào)控、聲束聚焦和治療可操作性方面都有不少困難和局限性。為了適應(yīng)超聲治療，國外有研究將診斷儀的脈沖寬度增加到5～20 μs（8～30個周期），以提高對微泡空化諧振的效率，因?yàn)槌Ｒ?guī)超聲的脈沖非常短，僅有1～2個周期[23]。該研究對超聲診斷儀的治療改進(jìn)相對豐富而完整，不僅增加了多個治療參數(shù)調(diào)控設(shè)置（機(jī)械指數(shù)、脈沖寬度和脈沖重復(fù)頻率等），而且還具有相控電子“弱聚焦”（即自適應(yīng)可變焦域技術(shù)）、專用治療操作界面和程序設(shè)置等，使之成為一臺同時兼有超聲空化治療能力的超聲診療一體機(jī)（圖6）。該儀器采用了診斷和治療脈沖相間發(fā)射的方式，信號互不干擾，又能夠在超聲影像引導(dǎo)下對病灶進(jìn)行聚焦治療。超聲能量輸出控制在診斷超聲標(biāo)準(zhǔn)范圍，腫瘤血流增強(qiáng)還可以通過儀器的造影功能實(shí)時評價(jià)。因此，該儀器可能成為實(shí)施低強(qiáng)度超聲治療較好的臨床研究平臺。

利用診斷超聲增強(qiáng)腫瘤放化療和免疫治療是全新的領(lǐng)域，尚存在許多認(rèn)識空白。不同腫瘤及部位的超聲治療參數(shù)可能不一樣，今后更多將聚焦于腫瘤個性化治療參數(shù)，針對不同腫瘤探索適宜的超聲治療參數(shù)組合。

綜上所述，診斷超聲增強(qiáng)腫瘤放化療和免疫治療不僅安全無創(chuàng)，至今尚未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，而且還具備臨床轉(zhuǎn)化迅速的特點(diǎn)，是一個值得關(guān)注的新方法。