劉霄飛，王 愷，徐恩民*，楊修鎮(zhèn)，李玉姣，趙豐華，章安源，王 燕

（1.山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，山東濟(jì)南 250102；2.濟(jì)南新牧人文化傳媒有限公司，山東濟(jì)南 250102；3.山東省飼料獸藥檢測中心，山東濟(jì)南 250102）

細(xì)菌內(nèi)毒素是1種致熱源，也是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜中的1種組分，在臨床上易引起哺乳動(dòng)物發(fā)熱反應(yīng)等癥狀，具有耐熱性強(qiáng)、可過濾性、不揮發(fā)性等特點(diǎn)。細(xì)菌內(nèi)毒素是注射用原料藥生產(chǎn)廠通常面臨的問題之一，對易引入內(nèi)毒素的藥品和醫(yī)療器械等出廠前必須進(jìn)行內(nèi)毒素檢測[1-3]。鹽酸頭孢噻呋（ceftiofur hydrochloride）是由美國法瑪西亞普強(qiáng)公司開發(fā)的第一個(gè)專門用于動(dòng)物的第三代頭孢菌素類抗生素，分子式為C19H17N5O7S3·HCl。鹽酸頭孢噻呋具備抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、β內(nèi)酰胺環(huán)穩(wěn)定性好、毒副作用小、殘留量低、不易產(chǎn)生耐藥性或者交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在一定程度上解決了耐藥菌問題。近年來，鹽酸頭孢噻呋制劑在世界各地獸醫(yī)臨床中廣泛應(yīng)用于防治豬、牛、羊及雛雞的呼吸系統(tǒng)等疾病[4-5]。

為填補(bǔ)鹽酸頭孢噻呋無菌原料檢查標(biāo)準(zhǔn)的空白，更好地對該原料進(jìn)行安全性評價(jià)和質(zhì)量控制，確保其無菌制劑臨床用藥的安全性，本試驗(yàn)對鹽酸頭孢噻呋無菌原料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查進(jìn)行了方法學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鹽酸頭孢噻呋無菌原料分別由齊魯晟華制藥有限公司（批號(hào)：711067118211、80671025A、605067105011）和艾美科健生物醫(yī)藥有限公司（批號(hào)：PS077-1712025、PS077-1802001、PS046-1802001、PS046-1802002）提供。

1.2 主要儀器

XPE205型電子天平（梅特勒公司）、DK-8AX型恒溫水槽（上海精密儀器儀表有限公司）、Vortex Genie2旋渦混合器（Scientific Industries）、DHG-9076A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏儀器有限公司）、HG-50型全自動(dòng)滅菌鍋（HIRAYAMA株式會(huì)社）；移液器、無熱源吸頭、試管、試管架、洗耳球、玻璃移液管、封口膜等。

1.3 主要試劑

鱟試劑購自福州新北生化工業(yè)有限公司，靈敏度（λ）為0.125 EU/mL，規(guī)格為0.1 mL/支，批號(hào)：18080912。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品購自福州新北生化工業(yè)有限公司，效價(jià)為10 EU/支，批號(hào)：160905。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水購自福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào)：18090105。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

試管、試管架、玻璃移液管等耐高溫器皿置于電熱鼓風(fēng)干燥箱，250℃干烤60 min以上；洗耳球等置全自動(dòng)滅菌鍋中滅菌；所用試劑安瓿外壁以75%酒精擦拭干凈。

1.4.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

1.4.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1.0 mL溶解，渦旋混勻15 min。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行40、80、160、320倍稀釋，每稀釋一步均需渦旋混勻30 s，制備成4個(gè)濃度（2.00、1.00、0.50、0.25λ）的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2.2 試驗(yàn)操作

取備好的鱟試劑18支各加入0.1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解。取其中16支，分為4組，4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液各為1組；每組4支平行，每支分別加入對應(yīng)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL；其余的2支作為陰性對照，各加入0.1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。37℃恒溫水槽保溫60 min，輕輕取出并緩緩倒轉(zhuǎn)180°，觀察結(jié)果。

1.4.3 鱟試劑靈敏度測定值計(jì)算

計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度測定值。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度[6]。

式中：X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）；n為每個(gè)濃度的平行管數(shù)。

1.4.4 干擾試驗(yàn)

1.4.4.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液的制備制備方法同1.4.2.1。

1.4.4.2 供試品溶液的制備

本試驗(yàn)供試品為無菌原料藥，最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）為1，細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）為1.0 EU/mg，根據(jù)公式[6-7]MVD=CL/λ，計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度為0.125 g/L。精密稱取鹽酸頭孢噻呋50 mg，采用2.6%無內(nèi)毒素的碳酸鈉溶液1.0 mL溶解，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1.0 mL制成25 g/L的溶液，精密移取上述濃度溶液適量，采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分步稀釋成終濃度為0.125 g/L的供試品溶液。

1.4.4.3 含細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液的制備

以1.4.4.2項(xiàng)下制備好的0.125 g/L的供試品溶液為稀釋用液，將1.4.4.1項(xiàng)下的同支細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分步稀釋，分別制備成含2.00、1.00、0.50、0.25λ細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液。

1.4.4.4 干擾試驗(yàn)溶液的制備

取準(zhǔn)備好的鱟試劑28支放在試管架上，各加入0.10 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，排成10列（6列2支，4列4支）。其中1列2支為陰性對照組，各加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.10 mL；另1列2支為供試品溶液組，各加入0.10 mL供試品溶液；其余的4列2支為內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液組，每支分別加入0.10 mL的2.00、1.00、0.50、0.25λ的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液；4列4支為干擾試驗(yàn)組，每列每支分別加入0.10 mL的含2.00、1.00、0.50、0.25λ細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液。置于37℃恒溫水槽保溫60 min，輕輕取出并緩緩倒轉(zhuǎn)180°，觀察結(jié)果。

1.4.5 供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測（凝膠限度試驗(yàn)）

1.4.5.1 溶液制備

按1.4.4.1方法制備2.00λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液；按1.4.4.2方法分別制備從兩個(gè)廠家收集到的7批供試品，作為供試品溶液；按1.4.4.3方法制備含2.00λ細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液。

1.4.5.2 凝膠限度試驗(yàn)

取準(zhǔn)備好的8支鱟試劑各加入0.1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，排成4列，每列2支。其中1列2支為陰性對照組，各加入0.1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水；1列2支為陽性對照組，各加入0.1 mL的2.00λ細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液；1列2支為供試品組，各加入0.1 mL供試品溶液；1列2支為供試品陽性對照組，各加入0.1 mL含2.00λ細(xì)菌內(nèi)毒素的供試品溶液。37℃水槽保溫60 min，取出并緩緩倒轉(zhuǎn)180°，觀察結(jié)果。7個(gè)批次的供試品均如上操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果（見表1）

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Sensitivity check result of Tachypleus amebocyte lysate reagent

由表1可知，細(xì)菌內(nèi)毒素2.00λ濃度管均為陽性，0.25λ濃度管均為陰性，陰性對照管全為陰性；結(jié)果表明，試驗(yàn)方法有效。

依據(jù)公式得鱟試劑靈敏度測定值λc=0.088 EU/mL，此測定值在0.50～2.00λ（包括0.50和2.00λ）范圍內(nèi)，符合規(guī)定，判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，以標(biāo)示靈敏度0.125 EU/mL為該批次鱟試劑的靈敏度。

2.2 干擾試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

由表2可知，供試品溶液組和陰性對照組的所有平行管均為陰性。

表2 干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Resut of interfere test

依據(jù)公式得細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液組的結(jié)果為0.088 EU/mL，干擾試驗(yàn)組的結(jié)果為0.105 EU/mL，結(jié)果均在0.50～2.00λ（包括0.50和2.00λ）范圍內(nèi)，符合要求；說明試驗(yàn)有效且供試品在稀釋濃度為0.125 g/L時(shí)無干擾作用，可在該濃度下對此供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。

2.3 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（見表3）

由表3可知，陽性對照組均為陽性，陰性對照組均為陰性，供試品陽性對照組均為陽性，表明試驗(yàn)結(jié)果成立。兩個(gè)廠家7個(gè)批次的供試品檢測結(jié)果均為陰性，符合規(guī)定。

表3 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab.3 Bacterial endotoxin test result of samples

3 討論

根據(jù)內(nèi)毒素限值計(jì)算公式[8-9]L=K/M，參考美國藥典標(biāo)準(zhǔn)中鹽酸頭孢噻呋的細(xì)菌內(nèi)毒素限值以及同品種的原料與不同制劑間內(nèi)毒素限值應(yīng)基本一致的慣例，為保證安全用藥，本試驗(yàn)取1.0 EU/mg作為鹽酸頭孢噻呋無菌原料的細(xì)菌內(nèi)毒素限值[10-12]。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法要求試驗(yàn)供試品溶液的pH值控制在6.0～8.0范圍內(nèi)[13]；因此，供試品檢測前經(jīng)常需加入二價(jià)陽離子調(diào)節(jié)劑、堿性或酸性調(diào)節(jié)劑或采用稀釋法消除供試品對鱟試劑的干擾[14-18]。由分子式可知，鹽酸頭孢噻呋在水中呈酸性，但不溶于水，經(jīng)驗(yàn)證能夠溶解于碳酸鈉溶液、氫氧化鈉溶液[19-20]。本試驗(yàn)選用2.6%無內(nèi)毒素碳酸鈉溶液作為溶劑，呈堿性；鹽酸頭孢噻呋初始濃度越低，終溶液pH值越高，越易對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，故需固定供試品初始溶液濃度，確保pH值在6.0～8.0范圍內(nèi)，必要時(shí)需調(diào)節(jié)pH值，以防干擾。

內(nèi)毒素檢測存在許多局限性，不同的檢查方法得出的檢測結(jié)果之間差異很大，且脂多糖作為內(nèi)毒素的主要成分，在其結(jié)構(gòu)、溶解度等物理性質(zhì)方面以及生物活性方面均存在較大的異質(zhì)性；此外，內(nèi)毒素檢測結(jié)果可因所用檢測試劑生產(chǎn)廠家及其生產(chǎn)批次的不同而出現(xiàn)差異。鱟試驗(yàn)屬于生物試驗(yàn)，生物學(xué)檢查缺乏化學(xué)檢查的精確性；且隨著對鱟保護(hù)力度的不斷加大，急需研發(fā)鱟試驗(yàn)的替代方法[2,21-23]。

4 結(jié)論

本研究中鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)結(jié)果均符合要求，應(yīng)用建立的方法對供試品進(jìn)行內(nèi)毒素檢查，結(jié)果符合規(guī)定且穩(wěn)定。本試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）合理可行，可作為常規(guī)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對鹽酸頭孢噻呋無菌原料進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測。本試驗(yàn)為鹽酸頭孢噻呋無菌原料的安全性評價(jià)和質(zhì)量控制提供了一定參考，對更好地控制鹽酸頭孢噻呋無菌制劑和注射劑的產(chǎn)品質(zhì)量具有一定價(jià)值。