張含露，劉詩雨，趙夢杉，趙懿侔，邱 實(shí)，呂 熙，楊豐利，萬春云

（長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院小動(dòng)物疾病研究中心，湖北荊州 434025）

犬細(xì)小病毒病，又稱犬傳染性腸炎或犬病毒性腸炎，是一種由犬細(xì)小病毒（canine parvovirus，CPV）感染所導(dǎo)致的烈性傳染病，幼犬感染率和病死率較高[1]。該病可根據(jù)臨床表現(xiàn)分為出血性腸炎型和急性心肌炎型[2-3]。CPV基因組包括NS1、NS2、VP1、VP2，其中VP2基因中最易發(fā)生突變，突變速度與RNA病毒相似，速率達(dá)到了2×10-4置換/位點(diǎn)/年[4]。CPV僅有一種抗原型，即CPV-2；但隨著CPV的不斷進(jìn)化，截至2000年已報(bào)道發(fā)現(xiàn)了CPV的3種亞型。目前，已經(jīng)出現(xiàn)的亞型包括CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c、CPV-2c（a）和CPV-2c（b）[5-7]。

中國的主要流行株包括CPV-2a和CPV-2b，但近幾年因297位氨基酸由Ser突變?yōu)锳la，而將其命名為New CPV-2a和New CPV-2b[8]。有研究者提出猜想，即免疫失敗可能是由于不斷出現(xiàn)的新型變異株，傳統(tǒng)疫苗免疫對不同變異株的中和能力降低，導(dǎo)致臨床上免疫疫苗后的犬感染CPV的情況時(shí)有發(fā)生[9-10]。本研究對1株CPV進(jìn)行病毒滴度測定、病毒VP2基因測序鑒定以及VP2基因序列分析，了解荊州地區(qū)犬細(xì)小病毒的進(jìn)化規(guī)律及當(dāng)前的流行趨勢，為該地區(qū)對犬細(xì)小病毒病的預(yù)防及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：貓腎細(xì)胞（F81）為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院曹罡教授饋贈(zèng)；DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、0.25%Trypsin-EDTA（賽默飛世爾科技公司）；2×PCRTaqMix、2×Pfu Mix（北京佳蘭生物科技有限公司）；DL 2000 DNA Buffer（北京聚合美生物科技有限公司）；DNA膠回收試劑盒、病毒DNA提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）。

主要儀器：臺(tái)式冷凍離心機(jī)（上海耐圣卡蘭實(shí)業(yè)有限公司）；CO2培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（BIOMETRA）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

于荊州某動(dòng)物醫(yī)院就診的1只因劇烈腹瀉、嘔吐死亡的2月齡博美幼犬，經(jīng)朝云帆干式熒光免疫分析儀檢測CPV為陽性。

無菌條件下采集患犬腸道組織及內(nèi)容物，研磨后反復(fù)凍融3次，加入適量PBS溶液，4℃10 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22μm微孔濾膜，加入終止?jié)舛葹?0%的100 U/mL的雙抗（青、鏈霉素）溶液，-80℃保存。

1.2.2 病毒分離與培養(yǎng)

預(yù)先配制好含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基。將F81細(xì)胞在37℃、5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿單層后（24～48 h），對其進(jìn)行傳代。

將處理好的病料樣品按照1∶10細(xì)胞培養(yǎng)液的體積加入剛貼壁的F81細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h后，換為2%犢牛血清濃度的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并設(shè)置1組不接毒的細(xì)胞作為對照組。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)3～4 d，每日觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）現(xiàn)象。細(xì)胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象并且程度達(dá)到80%以上時(shí)，將其在-20℃以及4℃條件下分別凍融3次，再將病毒進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.2.3 病毒DNA提取

將培養(yǎng)的第3代病毒液作為模板提取病毒DNA，提取步驟參照病毒DNA提取試劑盒說明書。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)

采用卜賓等[11]設(shè)計(jì)的CPV檢測引物P1進(jìn)行PCR檢測。參照GenBank中上傳的CPV的VP2蛋白基因的序列設(shè)計(jì)了一對用于擴(kuò)增VP2基因全長的引物P2，添加BamHⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程（武漢）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 PCR鑒定

以1.2.3中獲得的病毒DNA作為模板，引物P1進(jìn)行PCR鑒定。

PCR反應(yīng)體系（25μL）：模板DNA 4μL、上游引物1μL、下游引物1μL、2×PCR Taq Mix 12.5μL、ddH2O 6.5μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，45℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.6 病毒滴度（TCID50）的測定

使用DMEM培養(yǎng)液作為稀釋液對待測病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，按順序轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，取等量DMEM培養(yǎng)液作為空白對照。每孔加入100μL的3×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液。37℃5%CO2的條件下培養(yǎng)3～6 d，每日觀察細(xì)胞CPE情況，按Reed-Muench兩氏法計(jì)算待檢病毒的TCID50值。

1.2.7 目的基因的PCR擴(kuò)增

以1.2.3中獲得的病毒DNA作為模板，引物P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系（25μL）：模板DNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、2×PCR Taq Mix 12.5μL、ddH2O 9.5μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.8 PCR產(chǎn)物的回收

參考DNA小量凝膠回收試劑盒說明書的方法，對上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。回收后的DNA-20℃保存。

1.2.9 序列分析

將1.2.7中回收的PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（武漢）股份有限公司測序。使用DNAMAN軟件對獲得的測序結(jié)果進(jìn)行拼接和分析，將得到的序列與GenBank中已收錄的30株國內(nèi)外的CPVVP2基因序列進(jìn)行同源性比對，使用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析氨基酸變異情況，確立新病毒株的分型。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果（見圖1）

由圖1可知，將處理好的病毒上清同步接種F81細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、皺縮（CPE）現(xiàn)象。

2.2 病毒的PCR鑒定結(jié)果（見圖2）

由圖2可知，以第3代犬細(xì)小病毒液的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察到1條大約682 bp的目的條帶，符合預(yù)期的犬細(xì)小病毒的結(jié)果。

2.3 病毒滴度測定結(jié)果

按照Reed-Muench法計(jì)算，第5代的病毒TCID50滴度為105.0/mL。

2.4 VP2基因的PCR擴(kuò)增（見圖3）

由圖3可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可觀察到一條大約為1 755 bp的目的條帶，符合預(yù)期的結(jié)果。

2.5 VP2基因序列分析

將得到的VP2基因命名為VP2-JZ1。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，VP2-JZ1一共含有1 755個(gè)核苷酸，AT值所占有的比例是64.30%，而CG值所占有的比例是35.70%。其中A為616個(gè)，T為512個(gè)，C為278個(gè)，G為349個(gè)。通過VP2基因推導(dǎo)出的VP2蛋白包含584個(gè)氨基酸。申請GenBank登錄號為MW495851。

使用DNAMAN軟件預(yù)測了VP2-JZ1蛋白的抗原肽段。結(jié)果顯示，在247～256、145～156、479～493、495～505、135～143、267～276、531～542、453～466、103～114、66～72、170～178、285～296、80～86、421～434、335～346、569～581、558～565、398～403、126～131、217～222、4～9、195～202、207～213等23個(gè)位置可能存在抗原表位。

2.6 VP2基因的同源性分析（見表2、圖4、圖5）

使用MEGA5.2軟件對VP2-JZ1和GenBank中收錄的VP2基因（見表2）進(jìn)行比較顯示。

表2 30株參考株VP2信息Tab.2 VP2 gene information of 30 reference strains

由圖4可知，VP2-JZ1株與30株來自不同國家的VP2基因的核苷酸同源性高達(dá)98.39%～99.83%；由圖5可知，氨基酸同源性為97.56%～100.00%。

2.7 VP2基因的遺傳進(jìn)化分析（見圖6）

由圖6可知，VP2-JZ1株與CPV-2c型的病毒株親緣性最近，屬于同一分支；結(jié)果表明，VP2-JZ1株屬于CPV-2c型；VP2-JZ1株與三大疫苗株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，而且與VP2-JZ1株同源性高的參考株也與疫苗株遺傳關(guān) 系較遠(yuǎn)。

3 討論

CPV可在多種動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行感染增殖。近年來，犬腎細(xì)胞（MDCK）和貓腎細(xì)胞（F81）細(xì)胞是最常用于分離培養(yǎng)CPV的兩種細(xì)胞。有報(bào)道表明，F(xiàn)81細(xì)胞接種CPV后的CPE較MDCK細(xì)胞更明顯。因此，本試驗(yàn)采用F81細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒。

犬糞便中成分較雜，有毒成分較多，可能會(huì)對接種的細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，進(jìn)而嚴(yán)重影響細(xì)胞貼壁生長。在接種細(xì)胞前，要將病料經(jīng)氯仿處理和微孔濾膜過濾除菌，去除病料中的細(xì)菌和有毒物質(zhì)。本研究所采集的病料為CPV確診死亡病犬的腸管及腸道內(nèi)容物，病料經(jīng)過處理后通過F81細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒，在37℃5%CO2的培養(yǎng)條件下，接毒細(xì)胞在24～72 h出現(xiàn)了拉網(wǎng)、聚集、脫落等細(xì)胞病變現(xiàn)象，收取病毒液盲傳5代后CPE現(xiàn)象仍明顯。收集病毒液提取DNA對其進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，凝膠電泳鑒定有1條明顯的條帶，通過DNA測序最終確定該分離株為犬細(xì)小病毒，命名為CPV-JZ2020，第5代的病毒TCID50滴度為105.0/mL。

在臨床使用疫苗的過程中免疫失敗的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，是由于使用的疫苗仍舊是基于最開始發(fā)現(xiàn)的分離株制備而成[12-13]。X射線晶體學(xué)解析發(fā)現(xiàn)，CPV病毒衣殼由約由60個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中最主要的衣殼蛋白為VP2蛋白，其形成的衣殼上的纖突是決定病毒的抗原特性和宿主范圍的關(guān)鍵區(qū)域[14]，一旦VP2蛋白上的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變，病毒的抗原性和致病性也會(huì)隨之改變，進(jìn)而出現(xiàn)新的變異型，部分變化甚至?xí)?dǎo)致病毒的感染對象增加[15]。CPV-2可能是由貓細(xì)小病毒（FPV）變異而來，隨后由貂和狐貍等野生犬科動(dòng)物逐漸傳播至犬；經(jīng)過幾年的歷程，CPV的抗原出現(xiàn)了變化，包括抗原性、血凝性以及感染的宿主種類等，其遺傳變異性甚至與RNA病毒相似。隨后，VP2蛋白的5個(gè)氨基酸發(fā)生了變化，出現(xiàn)了新的基因型CPV-2a。1984年，其主要抗原位點(diǎn)426位發(fā)生了突變（Asn→Asp），將其命名為CPV-2b，此種基因型一般會(huì)與CPV-2a發(fā)生混合感染。隨后，426位氨基酸又出現(xiàn)了新的突變（Asn/Asp→Glu），命名為CPV-2c。

通過測序結(jié)果可知，本研究所獲得的CPV-JZ2020的VP2基因（VP2-JZ1）一共含有1 755個(gè)核苷酸，584個(gè)氨基酸，并申請了GenBank登錄號，為MW495851。通過遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，VP2-JZ1與CPV-2c型的病毒毒株親緣性最近，屬于同一分支，說明VP2-JZ1屬于CPV-2c型。VP2-JZ1與30株來自不同國家的不同VP2基因的核苷酸同源性高達(dá)98.39%～99.83%，氨基酸同源性為97.56%～100.00%。

通過基因比對發(fā)現(xiàn)，本研究分離的CPV-JZ2020株的VP2蛋白同所選取的國內(nèi)外的CPV-2c型均發(fā)生了F267Y、S297A、Y324I、Q370R、N426E的突變，但CPVJZ2020未出現(xiàn)部分病毒毒株發(fā)生的A5G的突變。VP2蛋白由4個(gè)無規(guī)則卷曲的Loop構(gòu)成，病毒的抗原性質(zhì)由該結(jié)構(gòu)決定。第267位氨基酸不在任何Loop中，而本分離株的VP2蛋白發(fā)生突變的第297、300以及324位氨基酸均位于Loop3中，其頂部突起部位由第300～303位氨基酸組成。Loop4頂部突起部位則由第421～428位以及第433～443位氨基酸組成。

有研究發(fā)現(xiàn)，VP2蛋白的GH環(huán)變異率最高，即氨基酸267～498位[16]，其中，親水性和抗原指數(shù)較高的350～400位于B細(xì)胞抗原表位區(qū)，此為蛋白的潛在跨膜區(qū)[17]，VP2-JZ1的突變位點(diǎn)存在于此活躍區(qū)域中。雖然267位發(fā)生了變異，但由于該位點(diǎn)并未暴露于VP2蛋白表面，所以可能并不會(huì)對CPV的抗原性產(chǎn)生影響。但近年來有關(guān)F267Y的突變的報(bào)道逐漸增多，在本分離株中也出現(xiàn)了該突變，其影響有待進(jìn)一步研究。297位點(diǎn)位于B細(xì)胞抗原表位附近，此位點(diǎn)的突變可能會(huì)引起CPV抗原性的變化，S297A的改變使CPV在CPV-2a與CPV-2b亞型的基礎(chǔ)上被新命名為New CPV-2a與New CPV-2b亞型[18]。

2004年，我國首次報(bào)道了Y324I的突變，且日、韓等其他亞洲地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了該突變[19]。323位保守氨基酸已被證明是影響CPV感染宿主范圍的關(guān)鍵點(diǎn)之一[20]，324位與其相鄰，其突變可能會(huì)對323位點(diǎn)造成影響，故Y324I也有影響CPV感染宿主范圍的可能[21]。324位突變位點(diǎn)與323位氨基酸相鄰，這種突變可能導(dǎo)致其與犬轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合的能力發(fā)生改變。本研究所分離的CPV-2c中出現(xiàn)了Q370R突變，該突變?yōu)镃PV-2c型的特有突變。該突變可能引起蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致CPV致病性出現(xiàn)不同程度的變化，Q370R突變也在CPV-2a的報(bào)道中出現(xiàn)過，而目前主要見于CPV-2c。N426E是CPV-2c的標(biāo)志性變異。

通過繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，國內(nèi)外CPV-2c亞型呈現(xiàn)1個(gè)獨(dú)立的分支，且目前國內(nèi)外分離的CPV病毒毒株與市面上常見的疫苗株距離均較遠(yuǎn)，此原因可能造成了CPV疫苗的免疫失敗。

4 結(jié)論

本研究成功分離犬細(xì)小病毒CPV-JZ2020株，第5代的病毒TCID50滴度為105.0/mL，并成功克隆出1 755 bp的CPV-JZ2020 VP2基因片段（VP2-JZ1）；同源性和遺傳進(jìn)化分析的結(jié)果顯示，VP2-JZ1屬于CPV-2c型；VP2-JZ1與30株不同國家的不同VP2基因的核苷酸同源性高達(dá)98.39%～99.83%，氨基酸同源性為97.56%～100.00%。本研究為進(jìn)一步研究犬細(xì)小病毒的變異提供參考。