王法琴，金瑩瑩

(南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

大青葉IsatidisFolium是十字花科植物菘藍(lán)IsatisindigoticaFort.的干燥葉[1]，其化學(xué)成分包括生物堿類、有機(jī)酸類、苷類、微量元素等。大青葉具有清熱解毒、涼血消斑之效[2]。能夠發(fā)揮抗腫瘤、解熱、抗炎、提高免疫力、抗內(nèi)毒素、抗病原微生物等作用[3]，在臨床上有廣泛應(yīng)用。

呼吸道感染RTI(Respiratory tract infection)是呼吸道因病原微生物入侵并繁殖而造成的感染。按感染部位，可分為上呼吸道感染和下呼吸道感染。老年人、嬰幼兒、免疫功能低下、慢性呼吸道疾病患者易感染此病，尤其是兼患嚴(yán)重慢性肺部疾病者，可因嚴(yán)重并發(fā)癥而預(yù)后不良。

近年來，人們對(duì)大青葉有效成分及藥理活性的研究日益深入，但對(duì)于大青葉生物堿抗病毒、治療呼吸道感染作用機(jī)制方面的研究還很少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于中藥復(fù)方多成分、多靶標(biāo)、多途徑的整體調(diào)控機(jī)體模式，整合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，從分子網(wǎng)絡(luò)水平探索大青葉治療呼吸道感染的作用機(jī)制[4]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，以大青葉中所含生物堿為對(duì)象進(jìn)行研究，篩選生物堿成分，對(duì)其潛在作用靶點(diǎn)和呼吸道感染相關(guān)的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整理、篩選，進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的分析、基因本體(GO)功能富集分析和KEGG通路富集分析，并構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，從整體揭示大青葉對(duì)RTI的干預(yù)作用及其機(jī)制，為后續(xù)深入研究大青葉中不同活性成分調(diào)節(jié)RTI的作用機(jī)制的研究提供依據(jù)。

中藥總生物堿的含量測(cè)定常用酸性染料比色法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法等。酸性染料比色法屬于離子對(duì)萃取比色法，結(jié)合紫外分光光度法，對(duì)總生物堿含量進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用此法采取酸性染料比色法測(cè)定大青葉中總生物堿的含量，利用四因素三水平L9(34)正交設(shè)計(jì)，設(shè)定緩沖液pH、緩沖液用量、指示劑(酸性染料)用量、有機(jī)溶劑萃取的用量為影響因素，比較各提取條件下的吸光度值，確定含量測(cè)定的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 生物堿成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的篩選

成分靶點(diǎn)篩選：通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP)檢索大青葉的化學(xué)成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中去除無靶點(diǎn)化合物，篩選生物堿類活性成分，獲取生物堿成分的Related targets及Target name信息，輸入至String數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇以Homo sapiens為Organism的條件，轉(zhuǎn)化為靶點(diǎn)相應(yīng)的Gene Symbol，得到各生物堿成分的作用靶點(diǎn)。

疾病靶點(diǎn)篩選：運(yùn)用GencardS，OMIM，Drugbank三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選。均以“Respiratory tract infection(呼吸道感染RTI)”為搜索詞，檢索并去重獲得疾病靶點(diǎn)。

1.2 構(gòu)建藥物-疾病交集靶基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

為了明確大青葉生物堿成分與呼吸道感染疾病靶點(diǎn)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用韋恩圖Venny篩選成分靶點(diǎn)蛋白與疾病靶點(diǎn)蛋白的交集，將所獲得的交集靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)信息輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行PPI蛋白相互作用分析，物種設(shè)定為“Homo Sapiens”，去除游離的靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

向繪圖軟件Cytoscape 3.7.2中導(dǎo)入PPI網(wǎng)絡(luò)圖的TSV文件。分析網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算節(jié)點(diǎn)的屬性值，根據(jù)Degree值調(diào)節(jié)各個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小和顏色。

1.3 基因本體(GO)功能富集分析和KEGG通路富集分析

將“1.2”項(xiàng)下的交集靶點(diǎn)以Excel形式導(dǎo)入Hiplot 平臺(tái)，運(yùn)用GO/KEGG富集分析插件(v 0.1.4)進(jìn)行KEGG和GO分析。選擇上傳KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和相應(yīng)的Org DB，進(jìn)行GO細(xì)胞組分(Cell component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)、生物學(xué)過程(Biological process，BP)以及KEGG通路富集分析，輸出富集柱狀圖和氣泡圖。

1.4 構(gòu)建大青葉“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將大青葉生物堿成分、作用靶點(diǎn)與作用通路富集分析結(jié)果進(jìn)行整理，導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，以探究大青葉治療呼吸道感染的藥效學(xué)作用機(jī)制。

1.5 酸性染料比色法測(cè)定大青葉總生物堿含量

酸性染料比色法是在一定 pH 值的溶液體系中，生物堿與H+結(jié)合成陽(yáng)離子，酸性染料與其結(jié)合成有色離子對(duì)，經(jīng)有機(jī)溶劑如氯仿、乙酸乙酯萃取后，定量溶解于有機(jī)溶劑，在紫外可見分光光度計(jì)中測(cè)定有機(jī)層的吸光度，可代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算得出生物堿含量[5]。

1.5.1 儀器、材料與試劑 大青葉藥材(安徽省豐厚銅陵中藥飲片有限公司，批號(hào) 20100823)；E-201-C型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KH-500B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；ME104E電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；UV-1800PC 紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；R-3 HB旋蒸儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

溴甲酚綠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20201023)；氫氧化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180403)；二氯甲烷(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150707)；鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180628)；無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180419)；無水乙酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20210111)；冰醋酸(上海申博化工有限公司)。

1.5.2 大青葉總生物堿的提取 以二氯甲烷為溶劑，利用相似相溶原理，使親脂性生物堿溶于親脂性有機(jī)溶劑。旋蒸并回收溶劑，蒸干后得大青葉總生物堿。取大青葉粉末100 g，加3倍量的2.5%氨水浸泡12 h，8倍量的二氯甲烷按5∶3∶2比例回流提取3次，每次1 h，旋蒸儀減壓回收溶劑至近干，蒸干即得。

1.5.3 對(duì)照品溶液的制備 由于大青葉生物堿的結(jié)構(gòu)與3-吲哚甲醛結(jié)構(gòu)相似，因此選3-吲哚甲醛作為對(duì)照品。精密稱取3-吲哚甲醛對(duì)照品10 mg于試管中，加入1%鹽酸乙醇溶液10 mL，超聲溶解，作為對(duì)照品溶液(每1 mL 含3-吲哚甲醛1 mg)。

1.5.4 供試品溶液的制備 稱取“1.5.2”項(xiàng)下大青葉總生物堿樣品2.5 mg于試管中，加入1 mL 1%鹽酸乙醇溶液，超聲溶解，即得供試品溶液。

1.5.5 酸性染料的制備[6]稱取溴甲酚綠200 mg，加0.05 mol/L NaOH 3.5 mL研磨使其溶解，加水至200 mL，即得溴甲酚綠指示液。

1.5.6 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 向2個(gè)分液漏斗中分別加入1 mL對(duì)照品溶液、1 mL供試品溶液，各加入5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和5 mL溴甲酚綠指示液，混勻，用5 mL二氯甲烷萃取。進(jìn)行萃取液的紫外全波長(zhǎng)掃描，二者的最大吸收峰都在414 nm處，所以檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為414 nm。

1.5.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取“1.5.2”中的對(duì)照品溶液0.32、0.48、0.64、0.80、0.96、1.12、1.28、1.44、1.60 mL于不同試管中，加入1%鹽酸乙醇溶液至1 mL。各加入5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和2 mL溴甲酚綠指示液，混勻，用5 mL二氯甲烷萃取。于紫外414 nm處測(cè)量吸光度。以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.8 大青葉總生物堿的含量測(cè)定 “1.5.2”項(xiàng)下提取出的大青葉總生物堿，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定供試品溶液中總生物堿的含量。

1.6 正交試驗(yàn)選擇最優(yōu)含量測(cè)定條件

平行稱取大青葉樣品9份，每份2.5 mg，均置于小試管中，各加入1 mL 1%鹽酸乙醇溶液，超聲溶解，即得供試品溶液。

分別精密吸取供試品溶液各1 mL于分液漏斗中，加入5 mL醋酸—醋酸鈉緩沖液和5 mL溴甲酚綠指示液，混勻，用5 mL二氯甲烷萃取。將1 mL 1%鹽酸乙醇經(jīng)同樣操作，所得萃取液作空白置零并進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。二者的最大吸收峰都在414 nm處，所以檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為414 nm。

利用L9(34)正交設(shè)計(jì)(表1)[7]，通過四因素三水平，考察影響含量測(cè)定相關(guān)因素，影響因素設(shè)定為緩沖液pH、緩沖液用量、指示劑(酸性染料)用量、有機(jī)溶劑萃取用量。于414 nm處測(cè)定9份樣品的吸光度值并進(jìn)行比較，選擇最優(yōu)的含量測(cè)定條件。含量測(cè)定的因素水平見表1。

表1 總生物堿含量測(cè)定因素水平

2 結(jié)果

2.1 生物堿成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，去除無靶點(diǎn)的化合物，最終共檢索到6個(gè)生物堿類化合物，獲取生物堿成分的Related targets及Target name信息，轉(zhuǎn)化為靶點(diǎn)的Gene Symbol，去重后最終得到39個(gè)靶點(diǎn)。6種成分中，靶點(diǎn)最多的是靛玉紅，涉及27個(gè)靶點(diǎn)；其次是靛藍(lán)和色胺酮。生物堿成分及其靶點(diǎn)基因的具體信息見表2。

表2 生物堿成分及其靶點(diǎn)基因

疾病靶點(diǎn)篩選：運(yùn)用GenCards，OMIM，Drugbank三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選。均以“Respiratory tract infection(呼吸道感染RTI)”為搜索詞，檢索疾病靶點(diǎn)。運(yùn)用Excel整理三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的疾病靶點(diǎn)并去重，最終得到9 410個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.2 構(gòu)建藥物-疾病交集靶基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用韋恩圖Venny篩選成分靶點(diǎn)蛋白與疾病靶點(diǎn)蛋白的交集，得到38個(gè)交集靶點(diǎn)，分別為PPARG，CYP1A1，AHR，NOS2，PTGS1，PTGS2，ESR1，AR，RXRA，CDK2，GABRA1，MAPK14，GSK3B，HSP90AA1，CHEK1，CCNA2，CHRM1，CHRM3，PDE3A，SCN5A，CA2，ACHE，ADRB2，PRSS1，IFNG，CCL5，NQO2，DRD1，HTR3A，HGF，ABCB1，NCOA2，SLC6A3，SLC6A4，KDR，MAOB，LYZ，CDKN3(圖1)。

圖1 靶點(diǎn)交集韋恩圖

將結(jié)果輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI蛋白相互作用分析，物種設(shè)定為“Homo Sapiens”，去除游離的靶點(diǎn)，剩余35個(gè)相互作用的節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

下載PPI網(wǎng)絡(luò)圖的TSV文件，導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2。分析網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算節(jié)點(diǎn)的屬性值，根據(jù)Degree值調(diào)節(jié)各個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小和顏色，PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)越大、顏色越亮表示節(jié)點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性越大，排名前5的為PTGS2、ESR1、HSP90AA1、AR、PPARG。根據(jù)節(jié)點(diǎn)相互作用強(qiáng)度調(diào)節(jié)連接線的粗細(xì)，相互作用越強(qiáng)，線條越粗(圖2)。

圖2 String 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 基因本體(GO)功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

運(yùn)用GO/KEGG富集分析插件(v 0.1.4)進(jìn)行GO、KEGG分析。

GO分子功能(Molecular function，MF)、生物學(xué)過程(Biological process，BP)、細(xì)胞組分(Cell component，CC)以及KEGG通路富集分析，得到富集柱狀圖和氣泡圖(圖3)。

GO-BP分析篩選保留前10條富集結(jié)果，主要涉及離子轉(zhuǎn)運(yùn)的正向調(diào)節(jié)、活性氧代謝過程、肽基絲氨酸磷酸化、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的正向調(diào)節(jié)等；GO-MF分析篩選保留前10條富集結(jié)果，涉及核受體活性、RNA聚合酶II通用轉(zhuǎn)錄起始因子結(jié)合、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等；GO-CC富集到10條結(jié)果，涉及谷氨酸能突觸、突觸前膜、突觸后膜等。KEGG結(jié)果富集到10條結(jié)果，涉及IL-17 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、Th17 分化細(xì)胞、血清素能突觸、PI3K-Akt通路、小細(xì)胞肺癌等信號(hào)通路，主要與病毒感染、炎癥反應(yīng)、機(jī)體免疫、細(xì)胞生長(zhǎng)分化和創(chuàng)傷愈合等相關(guān)[8]。各富集結(jié)果信息見表3。

圖3 GO生物學(xué)分析和KEGG富集分析

2.4 構(gòu)建大青葉“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

通過Cytoscape 3.7.2軟件，根據(jù)大青葉的有效成分、靶點(diǎn)和作用通路，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)共有54個(gè)節(jié)點(diǎn)(包括6個(gè)生物堿活性成分、38個(gè)靶點(diǎn)、10條通路)。如圖4所示，靛玉紅、色胺酮、靛藍(lán)等節(jié)點(diǎn)度值排名靠前，可能為大青葉中重要的生物堿成分。

2.5 酸性染料比色法測(cè)定大青葉中總生物堿含量

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按“1.5.5”項(xiàng)下方法測(cè)定。以吲哚-3-甲醛濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從而得到線性回歸方程Y=0.480 8X+0.014 3，R2=0.998 7，表明3-吲哚甲醛在0.32～1.60 mg/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5.2 大青葉總生物堿含量測(cè)定 采用二氯甲烷提取大青葉總生物堿，在紫外414 nm處有最大吸收，吸光度為0.716 0，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出：提取出的總生物堿含量為58.38%。大青葉總生物堿選用二氯甲烷提取，此方法提取的總生物堿雜質(zhì)較少，易于進(jìn)行后期的純化。

2.5.3 含量測(cè)定正交試驗(yàn)方案[7]及結(jié)果 正交實(shí)驗(yàn)中的各實(shí)驗(yàn)均按照“1.6”項(xiàng)下方法。分別采用表1中設(shè)計(jì)的緩沖液pH、緩沖液用量、指示劑(酸性染料)用量、有機(jī)溶劑萃取用量，對(duì)9份樣品進(jìn)行萃取，于414 nm處測(cè)定并進(jìn)行比較吸光度值，選擇最優(yōu)的含量測(cè)定條件。結(jié)果見表4。

2.5.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)表4對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析：酸性染料比色法測(cè)定大青葉總生物堿含量試驗(yàn)中RA>RD>RC>RB，表明影響大青葉總生物堿含量測(cè)定的因素主次順序?yàn)锳>D>C>B，即緩沖液pH是影響總生物堿含量測(cè)定的最主要因素，其次是有機(jī)溶劑用量，指示劑用量、緩沖液用量影響較小。

表3 富集分析結(jié)果

注：A為生物堿成分，B為作用靶點(diǎn)，C為作用通路。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 含量測(cè)定正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

運(yùn)用酸性染料比色法測(cè)定大青葉總生物堿含量的最優(yōu)條件為A1B3C3D3，即緩沖液pH=3.6、用量為6 mL，指示劑用量為4 mL，有機(jī)溶劑用量為6 mL。

3 討論

大青葉具有抗腫瘤、解熱、抗炎、提高免疫力、抗內(nèi)毒素、抗病原微生物等作用，其所含有效成分可分為生物堿、有機(jī)酸、黃酮類、苯丙素等，其中生物堿是發(fā)揮作用的主要成分。吲哚類生物堿(靛藍(lán)、靛玉紅、菘藍(lán)苷B、異靛藍(lán)等)，具有抑制癌細(xì)胞增殖[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]的作用，喹唑酮類生物堿(青黛酮、4(3H)喹唑酮、色胺酮等)具有一定的抗病毒活性。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析了大青葉生物堿治療呼吸道感染的分子機(jī)制，預(yù)測(cè)PTGS2、ES-R1、HSP90AA1、AR、PPARG等可能是治療呼吸道感染的重要靶點(diǎn)。靶點(diǎn)前列腺素內(nèi)過氧化酶(PTGS2)、過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)對(duì)炎癥、脂質(zhì)代謝具有一定影響，PEG2的產(chǎn)生與PTGS2密切相關(guān)，它參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、增殖和抗凋亡活動(dòng)；生長(zhǎng)因子、炎性細(xì)胞因子、腫瘤啟動(dòng)子誘導(dǎo)PTGS2合成，進(jìn)一步合成PG產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[11]。PPARG的活化可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞降低 TNF-α的釋放[12]。ESR1主要通過刺激生長(zhǎng)因子的表達(dá)，抑制相關(guān)炎性細(xì)胞因子如IL-1，6、TNF-α的分泌，保護(hù)細(xì)胞不被破壞[13]。因此，大青葉的生物堿成分可作用于相關(guān)靶點(diǎn)，減少炎性細(xì)胞因子 TNF-α 和 IL-6 的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)。大青葉生物堿作用于HSP90AA1靶蛋白，通過對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞生物合成過程的正向調(diào)控，引起自噬抵御病毒感染，對(duì)治療呼吸道感染具有重要作用[14]。

大青葉生物堿靶點(diǎn)之間相互作用，通過IL-17 信號(hào)通路、Th17 分化細(xì)胞、鈣信號(hào)通路、PI3K-Akt等信號(hào)通路引起機(jī)體內(nèi)部反應(yīng)，從而參與呼吸道感染的發(fā)展過程。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，通過促進(jìn)激活T細(xì)胞、刺激上皮、內(nèi)皮、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生如 IL-6、IL-8、GM-CSF、CAM-1[15]等多種細(xì)胞因子，促進(jìn) TNF-α、IL-1β 等細(xì)胞因子的表達(dá)[16]，從而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。大青葉生物堿或可作用于鈣通道或鈣釋放使Ca2+濃度升高，影響病毒的生命周期從而發(fā)揮防治病毒的作用[17]。生物堿可調(diào)控Th17分化細(xì)胞、IL-17信號(hào)通路，抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)呼吸道組織。PI3K/Akt信號(hào)通路：細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化與磷脂酞肌醇-3-激酶PI3K通路相關(guān)；Akt是位于PI3K下游的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Akt磷酸化后具有激酶活性，使下游分子發(fā)生磷酸化，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。生物堿通過調(diào)控PI3 K/Akt信號(hào)通路，促使炎癥細(xì)胞凋亡[18]，減少相關(guān)炎癥因子的分泌[19]，抑制炎癥反應(yīng)。

大青葉生物堿可作用于一些抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路，抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)，從而對(duì)呼吸道感染產(chǎn)生治療作用。但本研究?jī)H限于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)層面，還需通過進(jìn)一步的探索和驗(yàn)證，對(duì)具體的調(diào)控機(jī)制、關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究。

酸性染料溴甲酚氯主要用于吲哚類、喹唑酮類生物堿的含量測(cè)定，也可用于萜類、甾類、有機(jī)胺類、異喹啉類或混合型生物堿的含量測(cè)定。在適當(dāng)?shù)膒H體系中，溴甲酚氯可與陽(yáng)離子生物堿形成離子對(duì)，經(jīng)二氯甲烷萃取后溶于有機(jī)相中，可通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定大青葉總生物堿含量。

緩沖液的pH是影響測(cè)定結(jié)果的一個(gè)重要因素。當(dāng)緩沖液的pH適當(dāng)時(shí)，生物堿全部生成陽(yáng)離子，同時(shí)，酸性染料生成足量的陰離子，二者結(jié)合生成定量的離子對(duì)絡(luò)合物，從而充分溶解于有機(jī)溶劑中。pH過低或過高，均會(huì)影響離子對(duì)的穩(wěn)定性，從而影響測(cè)定結(jié)果。而緩沖液的用量則關(guān)系著整個(gè)體系的pH。試驗(yàn)中使用的有機(jī)溶劑為二氯甲烷。如果有機(jī)溶劑萃取用量不足、次數(shù)不夠，離子對(duì)將不能被萃取完全，則會(huì)導(dǎo)致總生物堿測(cè)定出的含量小于其實(shí)際含量。