徐興楠，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

槐角為豆科植物槐(SophorajaponicaL.) 的干燥成熟果實(shí)，性苦、寒，集中分布于河南、天津、河北、山東等地?；苯蔷哂星鍩釣a火、涼血止血之功效，臨床用于腸熱便血、痔腫出血、肝熱頭痛、眩暈?zāi)砍嗟劝Y，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)槐角中含多種黃酮類化合物，其中槐角苷是槐角的主要活性成分之一[1-3]，常溫下為白色精細(xì)粉末，藥理研究表明槐角苷具有抗炎、抑制免疫、抗生育和雌激素樣等作用[4-5]，可見槐角苷的開發(fā)潛力巨大。本研究以槐角苷得率和固形物純度為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化槐角中槐角苷的超聲提取法工藝參數(shù)，以期為槐角苷的提取分離和生產(chǎn)工藝改進(jìn)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

槐角購(gòu)自陜西興盛德藥業(yè)有限公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)院科學(xué)院王偉明研究員鑒定為豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥成熟果實(shí)；槐角苷對(duì)照品(純度>98%，批號(hào)：111695-201703，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)；津騰有機(jī)濾頭(尼龍66)0.45 μm 濾膜；102新星中速濾紙；水為超純水；甲醇、乙腈為色譜純；95%乙醇為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AF-20A 1000g粉碎機(jī)(溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司)；ATC2-5-U 超純水機(jī)(美國(guó)艾科浦國(guó)際有限公司)；KQ-800KDB高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LC20AD-SPDM20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；BP211D型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))；LE2002E/02型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 槐角苷得率測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.07%磷酸溶液(12∶20∶68)，柱溫：室溫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取槐角苷對(duì)照品 11.4 mg，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，搖勻，作為槐角苷標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。再分別準(zhǔn)確量取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，分別用甲醇定容至10 mL，照“ 2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=5E+07x+38 754，R2=0.999 6，槐角苷在11.1～55.6 μg /mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 供試品溶液制備 取適量槐角，粉碎過I號(hào)篩，準(zhǔn)確稱取20 g槐角藥粉，按不同提取條件進(jìn)行提取，過濾，精確吸取0.5 mL濾液至100 mL容量瓶中，用相應(yīng)醇濃度的提取液定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，得到的峰面積分別為242940、243936、244788、244186、244143，RSD為0.28 %(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.1.5槐角苷得率和固形物純度的計(jì)算 按“2.1.3”項(xiàng)下得出的進(jìn)樣濃度C，槐角苷的得率=(C×V)/M×100%，C(mg/mL)為提取液中槐角苷濃度，V(mL)為提取液體積，M(g)為提取所用槐角藥粉的質(zhì)量。固形物純度=A/B×100%，A為固形物中所含槐角苷的質(zhì)量，B為固形物總質(zhì)量。

2.2 超聲提取工藝研究

2.2.1 超聲提取單因素試驗(yàn) (1)乙醇濃度：準(zhǔn)確稱取4份槐角粉末，每份約 20 g，液固比為8∶ 1 mL /g，超聲功率為80%(640 W)，超聲提取30 min，提取液醇濃度分別為 60%、70%、80%、90%，按 “2.1.5”項(xiàng)下條件得出槐角苷的得率。結(jié)果如圖1(A)，槐角苷得率隨溶劑量的增加而增加，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，槐角苷得率達(dá)到最大。

(2)提取時(shí)間：準(zhǔn)確稱取4份槐角粉末，每份約 20 g，提取時(shí)間分別設(shè)定為 20、30、40、50 min，其他處理同“(1)乙醇濃度”。圖 1(B) 為提取時(shí)間對(duì)槐角苷得率的影響結(jié)果，槐角苷得率40 min后達(dá)到最大。

(3)提取液固比：準(zhǔn)確稱取4份槐角粉末，每份約 20 g，提取液固比分別設(shè)定為 4∶1、6∶1、8∶1、10∶1 mL/g，其他處理同“(1)乙醇濃度”。圖 1(C) 顯示了不同超聲提取液固比對(duì)槐角苷得率的影響結(jié)果，當(dāng)液固比8∶1時(shí)，槐角苷得率達(dá)到最大。

(4)提取溫度：準(zhǔn)確稱取4份槐角粉末，每份約 20 g，提取溫度分別設(shè)定為0～10、10～20、20～30、30～40℃，其他處理同“(1)乙醇濃度”。圖 1(D) 顯示了不同提取溫度對(duì)槐角苷得率的影響結(jié)果，隨著提取溫度上升，槐角苷得率增大。

(5)提取次數(shù)：提取次數(shù)考察結(jié)果見表1，提取兩次以后槐角苷提取率差別不大，考慮提取成本，確定超聲提取次數(shù)為2次。

表1 超聲提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

2.2.2 超聲提取正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素考察結(jié)果，設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交試驗(yàn)來優(yōu)化最佳工藝參數(shù)，超聲正交試驗(yàn)因素水平見表2，以槐角苷得率為指標(biāo)，探索不同因素影響槐角苷得率的主次順序以及最佳提取工藝參數(shù)。

超聲提取正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表3和表4。綜合表3的極差及表4的方差分析可知，影響超聲提取槐角苷得率和純度的主次因素為：A(料液比)>B(超聲時(shí)間)>D(乙醇濃度)>C(提取溫度)，乙醇濃度具有顯著影響。綜合直觀分析和方差分析可以確定槐角苷超聲提取的最佳工藝條件為A2B1C1D3，即料液比8∶1 mL/g，提取時(shí)間為30 min，提取溫度10～20 ℃，乙醇濃度80%。

圖1 超聲提取乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、液固比(C)、提取溫度(D)對(duì)槐角苷得率的影響

表2 超聲正交試驗(yàn)因素水平

表3 超聲提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表 4 超聲提取方差分析

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)“ 2.2.2”項(xiàng)得出的最佳工藝條件提取，驗(yàn)證3次試驗(yàn)的槐角苷得率分別為：5.27%、5.11%、5.22 %，純度分別為：4.9%、4.9%、4.8%，相對(duì)偏差分別為：RSD=1.6%、RSD=1.2%，說明試驗(yàn)結(jié)果可靠，工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好。

3 討論

考慮到槐角苷不溶于水，微溶于乙醇、甲醇，甲醇有毒，考慮工業(yè)化生產(chǎn)，因此選擇提取溶劑為乙醇，預(yù)實(shí)驗(yàn)還考察了相同條件下的回流提取法，其操作復(fù)雜，槐角苷提取率、得率均明顯低于超聲提取法，且高溫提取易提出雜質(zhì)，也不利于后續(xù)槐角苷的分離純化。

超聲提取為一種先進(jìn)的提取方法，具有無需高溫、操作簡(jiǎn)單、提取率高、適用性廣、耗能少、工藝成本低等特點(diǎn)，本研究確定超聲提取法提取槐角苷的最佳參數(shù)條件為：料液比8∶1 mL/g、提取時(shí)間為30 min、提取溫度10～20 ℃、乙醇濃度80%，提取2次，在該工藝條件下槐角苷得率為5.2%，提取率可達(dá)到95%以上。該方法具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，為槐角中槐角苷的提取工藝改良提供了理論參考。