高 策，黃建敏，蔣勇明，云艷芳，楊長(zhǎng)燕，陳海燕

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 百色 533000）

顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄（intracranial atherosclerotic stenosis，ICAS）是以進(jìn)行性脂質(zhì)沉積、纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的病理過程，既能緩慢加重血管狹窄，又能引起栓子脫落堵塞血管，導(dǎo)致腦血液循環(huán)障礙，現(xiàn)已經(jīng)成為缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）的重要病因[1]。隨著人們生活水平的提高，IS 發(fā)病率也在以每年8.7%的速率遞增[2]。IS 因具有高致殘率及致死率的特點(diǎn)，給患者及其家庭、社會(huì)帶來了極重的負(fù)擔(dān)。因此，探究ICAS 的致病機(jī)制對(duì)IS 防治具有重要意義。在動(dòng)脈粥樣硬化形成眾多機(jī)制學(xué)說中，慢性炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，其中白細(xì)胞介素-8（interleukin，IL-8）作為經(jīng)典炎癥趨化因子，不僅能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞在炎癥細(xì)胞的聚集，同時(shí)也能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，更易促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成[3]。目前臨床關(guān)于IL-8 基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化的研究相對(duì)較少，尤其是IL-8 基因啟動(dòng)子-251A/T 位點(diǎn)?；诖?，本研究主要探究IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)與ICAS 易感性的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料 選取2018 年10 月-2019 年10 月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的150 例ICAS 患者設(shè)為病例組，另選取同期健康體檢者150名設(shè)為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病例組患者符合1995年全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的ICAS 診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；②年齡＞55 歲；③臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①急性心肌梗死、凝血障礙致腦梗死患者；②自身免疫性疾病及嚴(yán)重肝、腎功能不全患者；③有外科手術(shù)、急慢性感染、創(chuàng)傷等病史；④大動(dòng)脈炎、顱內(nèi)感染、血管畸形、心源性栓塞者；⑤造影劑過敏等腦血管造影禁忌者。病例組男90 例，女60 例；年齡60～76 歲，平均年齡（67.51±7.56）歲。對(duì)照組男77 例，女73 例；年齡59～74 歲，平均年齡（66.52±6.78）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 抽取受試對(duì)象空腹外周靜脈血1.5 ml，應(yīng)用通用型動(dòng)物基因組DNA 提取試劑盒（北京肇科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）并嚴(yán)格按照操作說明書提取DNA，另應(yīng)用紫外分光光度儀及瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA 樣本純度，舍棄不合格的樣本。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 在PubMed 中檢索IL-8 基因的全序列，選取IL-8 基因在-251A/T 位點(diǎn)為靶點(diǎn)，應(yīng)用美國國家生物信息中心（NCBI）在線設(shè)計(jì)引物，通過上海生工生物工程有限公司合成引物，其上游引物為5-TGGCTGGCTTATCTTCACCATCA-3’，下游引物為5-TCAGGGCAAACCTGAGTCATCA-3’。

1.2.3 目的基因分型及測(cè)序 對(duì)選取的基因位點(diǎn)引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)在50 μl體系中進(jìn)行，其中包括上、下游引物各2 μl，基因組DNA 1 μl，金牌Mix（green）45 μl，ddH20 補(bǔ)足50 μl。擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃10 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，重復(fù)30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸1 min。對(duì)PCR 產(chǎn)物應(yīng)用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)其純度，并使用DNA 凝膠回收試劑盒對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。應(yīng)用ABI 公司DNA 測(cè)序儀（3730）測(cè)序，測(cè)序峰圖分析采用chromsa 軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)基因分型 對(duì)IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)峰型圖分析，檢測(cè)到AA、AT、TT 三種基因型，見圖1。經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，其符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，所選樣本具有代表性。

圖1 IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)峰型圖

2.2 IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)等位基因與基因型頻率分析 兩組等位基因及基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)等位基因及基因型分布比較[n（%）]

2.3 病例組IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)與ICAS 易感性分析 與AT+TT 基因型相比，AA 基因型的ICAS 發(fā)病的易感性風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=1.732，95%CI：1.013～2.961）。

3 討論

ICAS 是動(dòng)脈粥樣硬化重要病因，動(dòng)脈粥樣硬化除了進(jìn)展緩慢外，也會(huì)脫落形成血栓，當(dāng)堵塞重要腦供血區(qū)時(shí)，可能會(huì)危及生命。有研究表明[5]，ICAS 患病風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡增加而增加。Lu M 等[6]研究發(fā)現(xiàn),老年人群的頸動(dòng)脈斑塊進(jìn)展速度比年輕人群更快。ICAS 目前發(fā)病機(jī)理尚不明確，在眾多學(xué)說中，慢性炎癥學(xué)說越來越被臨床認(rèn)可。

作為經(jīng)典的炎癥趨化因子，IL-8 最早是由Yoshimur 通過刺激人單核細(xì)胞產(chǎn)生的具有中性粒細(xì)胞趨化功能的蛋白質(zhì)[7]，其位于第4 號(hào)染色體，包含4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子[8，9]。IL-8 主要是通過與受體結(jié)合，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[10]，其與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。An Z 等[11]研究顯示，在動(dòng)脈粥樣小鼠中血清IL-8 水平較高。另外，鄭曉麗等[12]應(yīng)用高脂動(dòng)脈硬化模型檢測(cè)不同時(shí)期IL-8 的含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化的早期IL-8 水平明顯升高。Kis Z 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IL-8 表達(dá)量在非心源性腦卒中患者中明顯高于健康人群。另外，Marino F 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在有頸動(dòng)脈斑塊的患者中外周循環(huán)和斑塊內(nèi)IL-8 均呈高表達(dá)。IL-8 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制是多方面的，其中Tang XE 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IL-8 通過增加miR-183 的表達(dá)，從而有效抑制膽固醇外流。應(yīng)用IL-8 單克隆抗體可能為早期防治ICAS 提供了新的思路，Yang H 等[16]通過在兔動(dòng)脈粥樣硬化模型中使用超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）傳遞IL-8 單克隆抗體，在進(jìn)行靶向?qū)Ρ仍鰪?qiáng)超聲檢查后發(fā)現(xiàn)，UTMD 傳遞的IL-8 單克隆抗體可減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的炎癥，提示UTMD 是一種新穎有效的斑塊穩(wěn)定方法。隨著單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）逐漸興起，IL-8 基因多態(tài)性的研究也在不斷的深入，尤其是在腸炎、腫瘤等方面的研究[17]。但I(xiàn)L-8 基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化的研究相對(duì)較少，尤其是IL-8 基因-251A/T 位于啟動(dòng)子序列。

本研究通過分析病例組與對(duì)照組在IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)基因型與基因頻率，發(fā)現(xiàn)兩組在基因頻率分布及基因型分布均具有差異性，其中病例組純合子AA 基因型高于對(duì)照組，且病例組中AA 純合子能增加ICAS 發(fā)病的易感性，提示AA 基因型可能是ICAS 易感基因型。IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)位于啟動(dòng)子序列，其可能通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，從而影響IL-8 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成，同時(shí)也證實(shí)了IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，尤其是在冠狀動(dòng)脈疾病方面。Zhang Q 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，顯性（AA+AT vs TT）基因型模型IL-8 基因-251A/T 多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)（OR=1.48）。另外，Zhang X 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，IL-8 基因-251A/T 多態(tài)性與急性冠狀動(dòng)脈綜合征的敏感性增加相關(guān)（P=0.004，OR=1.30，95%CI：1.12～1.53），在急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者中IL-8 含量明顯升高，證實(shí)了IL-8 基因-251A/T 可能會(huì)影響IL-8 的表達(dá)。以上研究均提示，IL-8 基因-251A/T多態(tài)性與冠心病存在相關(guān)性。

綜上所述，IL-8 基因-251A/T 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可能與ICAS 發(fā)病易感性有關(guān)。