魏譚偉

（武漢市普仁醫(yī)院眼科，湖北 武漢 430081）

先天性無(wú)虹膜癥（congenital aniridia）典型表現(xiàn)為虹膜組織部分或全部缺失或者高度發(fā)育不良，多為雙側(cè)發(fā)病，嚴(yán)重影響視功能，可伴有眼球震顫其他眼部并發(fā)癥，如先天性白內(nèi)障、青光眼及角膜混濁等，同時(shí)無(wú)虹膜導(dǎo)致的眩光引起黃斑及其附近視網(wǎng)膜發(fā)育不良也會(huì)加重視功能受損。據(jù)報(bào)道[1]，先天性無(wú)虹膜癥的發(fā)生率為1∶70 000，20 歲以下人群中發(fā)生率高達(dá)1∶47 000，發(fā)病無(wú)種族及性別差異。先天性無(wú)虹膜癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳，其中約1/3 為散發(fā)，2/3 有家族遺傳史，其中約85%為常染色體顯性遺傳，13%伴發(fā)于WAGR 綜合癥，該綜合癥表現(xiàn)為患者同時(shí)患有Wilms 腫瘤、先天性無(wú)虹膜、生殖器發(fā)育異常和智力發(fā)育遲緩，同時(shí)呈常染色體顯性遺傳；約2%為常染色隱性遺傳，常伴發(fā)于Gillespie's 綜合癥，表現(xiàn)為無(wú)虹膜、小腦共濟(jì)失調(diào)和智力發(fā)育遲緩[2]。先天性無(wú)虹膜癥主要與遺傳有關(guān)，其致病基因和基因突變位點(diǎn)相繼被發(fā)現(xiàn)。到目前為止，分子遺傳學(xué)的研究證明與先天性無(wú)虹膜癥有關(guān)的致病基因主要有PAX6 基因（人類(lèi)配對(duì)盒基因，paired box gene，OMIM607108，GenBank：AH014790）、FOXCl 基因（叉頭框轉(zhuǎn)錄因子C1，forkhead box C1，OMIM 601090，GenBank：NM_001453）、PITX2 基因（OMIM601542，GenBank：KR710429）、FOXE3 基因（叉頭框轉(zhuǎn)錄因子 E3，forkhead box E3，OMIM601094，GenBank：NC_000001）、NF1 基因（神經(jīng)纖維瘤蛋白1，neurofibromin 1，OMIM613113，GenBank：NC_000017）、OTX2 基因（鄰位齒狀同源盒基因，orthodenticle homeobox 2，OMIM600037，GenBank：NC_000014）等，約46 多個(gè)基因位點(diǎn)與先天性無(wú)虹膜癥有關(guān)。其中，最重要的的致病基因是PAX6 基因，80%～90%的先天性無(wú)虹膜癥與PAX6基因突變有關(guān)，它的很多基因位點(diǎn)已被定位，基因編碼蛋白質(zhì)的致病機(jī)制也被闡明，這使先天性無(wú)虹膜癥的分子診斷成為可能，也為臨床基因靶向治療先天性無(wú)虹膜癥提供了理論基礎(chǔ)。本文就PAX6 基因及其分子診斷方法作一綜述。

1 PAX6 基因概述

人類(lèi)PAX6 基因長(zhǎng)22 Kb，共有14 個(gè)外顯子，位于11P13 位置，在眼、鼻、大腦、內(nèi)分泌腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等的發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是眼部發(fā)育的主要控制基因。它的編碼產(chǎn)物屬于DNA 結(jié)合蛋白類(lèi)，由配對(duì)盒結(jié)構(gòu)域（paired domain，PD）和同源結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD）組成，PD 結(jié)構(gòu)域具有選擇性剪切功能，HD 結(jié)構(gòu)域則可以調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，在功能上二者都屬于高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，在眼部發(fā)育早期廣泛參與眼球各組織（包括視網(wǎng)膜、晶狀體、睫狀體、角膜、虹膜等）的正常發(fā)育和分化。而人類(lèi)眼部發(fā)育是在多種轉(zhuǎn)錄因子（eye-field transcription factors,EFTFs）共同調(diào)控作用下進(jìn)行的，所以當(dāng)PAX6基因發(fā)生突變時(shí)可導(dǎo)致PAX6 整體蛋白活性降低大約50%，并使PAX6 單倍體劑量嚴(yán)重不足，最終引發(fā)各種眼部發(fā)育異常，其中最常見(jiàn)的是先天性無(wú)虹膜癥。先天性無(wú)虹膜癥患者多為PAX6 基因單獨(dú)突變，個(gè)別患者突變涉及PAX6 基因和相鄰的WT1 基因，表現(xiàn)為先天性無(wú)虹膜伴腎母細(xì)胞瘤、泌尿生殖系統(tǒng)異常和精神發(fā)育遲緩[3]。PAX6 基因突變有多種形式，與表型嚴(yán)重程度相關(guān)。迄今為止已發(fā)現(xiàn)三百余種突變，有20%～40%患者攜帶PAX6 基因大片段缺失，目前發(fā)現(xiàn)的主要突變PAX6 基因見(jiàn)表1。

表1 人類(lèi)PAX6 基因突變

表1（續(xù)）

2 先天性無(wú)虹膜癥的分子診斷方法

遺傳病是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究的主要關(guān)注點(diǎn)，其中最重要的是尋找與研究人類(lèi)致病基因。通過(guò)研究人類(lèi)遺傳病可以將致病基因與臨床癥狀聯(lián)系起來(lái)，是闡明人類(lèi)基因功能最重要的方法之一，而且目前通過(guò)對(duì)遺傳病致病基因的研究，可以了解這些基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)的功能位點(diǎn)或功能區(qū)域，為未來(lái)基因遺傳病靶向治療提供理論基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)[38]，不同的分子遺傳性研究策略可發(fā)現(xiàn)無(wú)虹膜癥的致病基因，其中部分先天性無(wú)虹膜癥的主要致病原因是外顯子的缺失或基因拷貝數(shù)變化。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)及Southern 印跡雜交或熒光原位雜交等技術(shù)均可應(yīng)用于基因拷貝數(shù)檢測(cè)或外顯子缺失[39]。

2.1 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）MLPA 是檢測(cè)DNA 大片段拷貝數(shù)異常的最新方法，具有高通量、操作簡(jiǎn)單易行、可重復(fù)性高、結(jié)果簡(jiǎn)潔等優(yōu)點(diǎn)。MLPA的主要原理不是擴(kuò)增DNA 靶序列，而是通過(guò)PCR擴(kuò)增與DNA 靶序列雜交的探針，同時(shí)MLPA 的探針又?jǐn)y帶了側(cè)翼序列，該序列可以通過(guò)攜帶熒光的通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程只需要一對(duì)引物，就能達(dá)到同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)片段的目的。該實(shí)驗(yàn)主要有4 個(gè)基本步驟：①DNA 變性及與MLPA 探針的雜交反應(yīng)；②連接反應(yīng)；③探針的PCR 反應(yīng)；④擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳及數(shù)據(jù)分析。通過(guò)MLPA 技術(shù)可以提高檢測(cè)先天性無(wú)虹膜癥基因的拷貝數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)PAX6 基因的大片段丟失，在外顯子測(cè)序未發(fā)現(xiàn)基因突變的患者中應(yīng)用MLPA 檢測(cè)外顯子或基因片段單拷貝缺失可提高先天性無(wú)虹膜的分子診斷水平，提高臨床檢測(cè)先天性無(wú)虹膜癥家系突變基因的陽(yáng)性率。

2.2 家系連鎖分析 在家系內(nèi)，位于同一條染色體上2 個(gè)位點(diǎn)（致病基因與遺傳分子標(biāo)記）在減數(shù)分裂的過(guò)程中會(huì)發(fā)生交換與重組，染色體上的2 個(gè)位點(diǎn)間相距越遠(yuǎn)，發(fā)生遺傳重組的幾率越高，2 個(gè)位點(diǎn)在一起傳給后代的機(jī)會(huì)就越小。因此，可以利用家系中的遺傳分子標(biāo)記與疾病位點(diǎn)間的重組率來(lái)估算兩者之間的距離及連鎖程度。位點(diǎn)間的距離的大小可以用重組分?jǐn)?shù)進(jìn)行估計(jì)，它通常用θ 表示，θ 定義為重組配子數(shù)與總配子數(shù)的比值，其取值范圍是0～0.5。計(jì)算連鎖程度，目前最常用的計(jì)算方法是優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分（lod score，LODS）法，LOD 值代表兩位點(diǎn)連鎖的機(jī)率與不連鎖的機(jī)率比的對(duì)數(shù)值，LOD 值大于3 表示肯定連鎖，LOD 值小于-2 表示否定連鎖，LOD 值介于-2 與1 之間則需增加家系材料。依據(jù)家系連鎖分析的定位候選克隆是以二代或二代以上的家系材料為基礎(chǔ)，對(duì)家系成員進(jìn)行遺傳分子標(biāo)記基因分型后，根據(jù)家系中成員提供的減數(shù)分裂事件，對(duì)致病基因所在的區(qū)域進(jìn)行定位。家系連鎖分析對(duì)呈孟德?tīng)栠z傳、外顯率高的單基因遺傳病研究具有明顯的優(yōu)勢(shì)。己有研究表明[40]，該方法是尋找致病基因重要的方法之一。當(dāng)然，連鎖分析也有缺點(diǎn)，它需要完整的系譜材料，這就要求臨床盡可能對(duì)家系成員的樣本進(jìn)行采集。另外在計(jì)算時(shí)，需要給出很多參數(shù)，如基因頻率、群體發(fā)病率、外顯率等，如果參數(shù)設(shè)定與實(shí)際情況不符合，則可能會(huì)得出錯(cuò)誤結(jié)論?？傊?，家系連鎖分析可以提高先天遺傳性疾病候選致病基因的鑒定率，對(duì)先天性虹膜癥高危胎兒的產(chǎn)前診斷具有重大意義，有利于人類(lèi)優(yōu)生優(yōu)育的發(fā)展。

2.3 外顯子組測(cè)序 外顯子組是一個(gè)物種基因組中全部外顯子區(qū)域的總和，該區(qū)域包含著合成蛋白質(zhì)所需要的信息，涵蓋了與個(gè)體表型相關(guān)的大部分的功能性變異。外顯子組測(cè)序是以高效捕獲為前提，相對(duì)于全基因組測(cè)序，外顯子組測(cè)序的覆蓋度更深，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高。目前，外顯子組測(cè)序不僅在孟德?tīng)柤膊41]、歌舞伎面譜綜合征[42]、重型顱腦畸形[43]、家族低β-脂蛋白血癥[44]等研究中取得成功應(yīng)用，還發(fā)現(xiàn)了一些新的致病基因突變。這些結(jié)果表明外顯子組測(cè)序可用于尋找單基因疾病、復(fù)雜疾?。ㄈ缣悄虿?、肥胖癥等代謝綜合癥）、甚至是癌癥的致病基因或易感基因，但在先天性白內(nèi)障的研究中尚未得到應(yīng)用。外顯子組測(cè)序是一種選擇基因組的編碼序列的高效策略，相對(duì)于全基因組測(cè)序成本較低，它只對(duì)基因組的約1%測(cè)序，更加經(jīng)濟(jì)、高效，在相同預(yù)算情況下，可提供更高深度測(cè)序；同時(shí)它可以用來(lái)發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)的絕大部分的疾病相關(guān)變異，以及常見(jiàn)變異和頻率＜5%的低頻突變。因此，對(duì)某種特殊類(lèi)型及遺傳方式復(fù)雜的遺傳病，外顯子組測(cè)序是一種更好的嘗試，例如檢測(cè)阿爾茨海默病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的apoE4基因中的突變就是將內(nèi)含子中的一部分插入了蛋白[45]，這是其他檢測(cè)手段無(wú)法發(fā)現(xiàn)的。綜上，通過(guò)外顯子測(cè)序可以提高無(wú)虹膜癥PAX6 基因突變的發(fā)現(xiàn)率，為臨床遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供幫助。

3 總結(jié)

先天性無(wú)虹膜癥的分子診斷是基因靶向治療的前提，但目前仍面臨諸多困難，如先天性無(wú)虹膜癥的高度遺傳異質(zhì)性、遺傳方式多樣性、致病基因PAX6編碼蛋白質(zhì)的多樣性和臨床表現(xiàn)型的復(fù)雜性。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，先天性無(wú)虹膜癥的基因診斷和基因靶向治療終將成為可能。