桂慧慧，劉 霞

（深圳市第二人民醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518000）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是一種常見的癌癥。近年來，隨著吸煙、高血壓和肥胖等腎細(xì)胞癌危險因素的增加，以及成像技術(shù)的提高，該病的發(fā)病率呈增加趨勢[1，2]。大多數(shù)成人腎臟腫瘤是腎透明細(xì)胞癌[3-5]，為目前最常見的腎癌類型之一，大約占所有腎臟腫瘤的75%[6]。腎透明細(xì)胞癌晚期預(yù)后很差[7-9]，尋找與腎透明細(xì)胞癌密切相關(guān)并具有診斷和治療意義的基因尤為重要。MYH10 是NMMHC-ⅡB 蛋白的編碼基因。研究表明[10]，MYH10 在乳腺癌、膠質(zhì)瘤和腦膜瘤中的表達(dá)增多。當(dāng)MYH10 表達(dá)降低時，增加了NPC 細(xì)胞的遷移和侵襲；此外，惡性轉(zhuǎn)化通常伴隨著細(xì)胞骨架的破壞，MYH10 可以保持細(xì)胞骨架的完整性和穩(wěn)定性，恢復(fù)細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)可以逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化表型，即細(xì)胞形狀、細(xì)胞粘附、飽和密度，這可能是MYH10 的抗癌機制[11-14]。但該基因在腎透明細(xì)胞癌中的作用目前較少報道?；诖?，本研究旨在通過生物信息學(xué)方法探討MYH10 與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 MYH10 在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況 UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）[15]是一個有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘工具，主要是基于TCGA 數(shù)據(jù)庫的在線分析和挖掘。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析MYH10 在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況。檢索條件如下：①在Enter genesymbol 輸入MYH10；②TCGA dataset Select cancer 欄選擇Head and Neck squamous cell carcinoma，點擊Explore；③Links for analysis 選擇Expression 及Survival plots，individual cancer stages。

1.2 MYH10 與腎透明細(xì)胞癌及免疫檢查點基因的關(guān)系 GEPIA 數(shù)據(jù)庫是一個高度可視化數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫整合了TCGA 癌癥大數(shù)據(jù)和GTEx 正常組織大數(shù)據(jù)[16]。運用該數(shù)據(jù)庫分析MYH10 表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者的預(yù)后，分析其與免疫檢查點基因之間的相關(guān)性。檢索條件如下：①在Enter gene name 檢索欄輸入MYH10，點擊GEPIA，再選擇individual cancer stages 檢索腫瘤分期與MYH10 表達(dá)量之間的關(guān)系；②Survival 選擇Survival plots；③Datasets Selection（Cancer name）選擇腎透明細(xì)胞癌。

1.3 MYH10 基因在腎透明細(xì)胞癌中共表達(dá)基因篩選Oncomine 數(shù)據(jù)庫（www.oncomine.org）是一個集成的在線癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫，用于DNA 或RNA 序列分析[17]。檢索MYH10 基因在腎透明細(xì)胞癌中與其共表達(dá)基因：①Gene：MYH10；②Analysis Type：Coexpression Analysis。選擇腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集后出現(xiàn)與MYH10 有共表達(dá)的基因。

1.4 腎透明細(xì)胞癌內(nèi)MYH10 基因與6 種免疫細(xì)胞的關(guān)系 TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是利用RNA-seq 表達(dá)譜數(shù)據(jù)檢測腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤情況[18]。TIMER 提供（CD4+T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）6 種免疫細(xì)胞的浸潤情況。利用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析腎透明細(xì)胞癌內(nèi)MYH10 基因表達(dá)和6 種免疫細(xì)胞浸潤比例的關(guān)系。檢索條件如下：①點擊SCNA，在Cancer Types：選擇腎透明細(xì)胞癌；②Gene symbol：輸入MYH10，點擊Submit，點擊correlation 輸入MYH10 和RAB3A 查兩基因相關(guān)性。

1.5 MYH10 蛋白與其他蛋白的相互作用 STRING 11.0（https://string-db.org/）是研究蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，可進(jìn)行已知蛋白與預(yù)測蛋白之間的相互作用分析，包括直接相互作用和間接相互作用。本研究利用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫分析MYH10 蛋白與其他蛋白的相互作用，檢索條件如下：①數(shù)據(jù)庫中輸入“MYH10”；②在List Of Name 下方的Orginsim 選擇Homo sapiens；③最后點擊SEARCH 進(jìn)行構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 24.0 軟件分析MYH10表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，Spearman 相關(guān)系數(shù)分析GEPIA 數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)相關(guān)性。采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析生存率，Log-rank 檢驗估計生存率的差異。通過TIMER 數(shù)據(jù)庫中的GENE 模塊分析基因與免疫浸潤水平的關(guān)系。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MYH10 基因在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及預(yù)后腎透明細(xì)胞癌組織中MYH10 表達(dá)水平低于正常組織（P＜0.05）；MYH10 低表達(dá)與患者低生存率有關(guān)（P＜0.05），見圖1。

圖1 MYH10 基因在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及預(yù)后

2.2 MYH10 表達(dá)及MYH10 啟動子甲基化在腎透明細(xì)胞癌中與腫瘤分級的關(guān)系 MYH10 過表達(dá)與腫瘤分級相關(guān)，并且隨分級增高M(jìn)YH10 表達(dá)降低（P＜0.05）；MYH10 啟動子甲基化在腎透明細(xì)胞癌和正常組織中的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 MYH10 表達(dá)及MYH10 啟動子甲基化在腎透明細(xì)胞癌中與腫瘤分級的關(guān)系

2.3 MYH10 與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系 MYH10 的表達(dá)與B 細(xì)胞（P=4.23e-02）、CD4+T 細(xì)胞（P=1.42e-13）、巨噬細(xì)胞（P=3.71e-10）、中性粒細(xì)胞（P=9.66e-04）、樹突狀細(xì)胞（P=2.16e-1204）的浸潤呈正相關(guān)，與CD8+T 細(xì)胞（P=2.26e-01）的浸潤無關(guān)，見圖3。

圖3 MYH10 與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

2.4 腎透明細(xì)胞癌中與MYH10 共表達(dá)的基因及其富集分析 使用搜索得到的MYH10 共表達(dá)基因在metascape 中進(jìn)行富集，發(fā)現(xiàn)在通過生物過程富集后與在分化過程中調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、肽基酪氨酸磷酸化、細(xì)胞粘附的正向調(diào)節(jié)有關(guān)；細(xì)胞成分富集后與液泡溶解、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、粘附結(jié)有關(guān)；分子功能富集后與單價無機陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等有關(guān)；KEGG 通路富集后與胰島素分泌有關(guān)，見圖4、表1。

表1 腎透明細(xì)胞癌中與MYH10 共表達(dá)的基因富集結(jié)果

圖4 腎透明細(xì)胞癌中與MYH10 共表達(dá)的基因及其富集分析

2.5 MYH10 基因表達(dá)水平與上下游蛋白質(zhì)間的相互調(diào)控作用 利用通過STRING 數(shù)據(jù)庫得到MYH10蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，PPI 富集的分別為MYL6B、MYL6、MYL9、MYL12B、CDC42、MYL1、MYLPF、MYH9、MYL2、MYLK，見圖5。

圖5 MYH10 蛋白水平與上下游蛋白調(diào)控間的相互關(guān)系

3 討論

腎細(xì)胞癌最常見的亞型之一是腎透明細(xì)胞癌，其特征是復(fù)發(fā)率和死亡率高[19]，對放療和化療的反應(yīng)較差[20]。盡管在腎透明細(xì)胞癌的檢測和治療方面取得了許多進(jìn)展，但大多數(shù)患者確診時已處于晚期，因此迫切需要研究出新的篩查基因或治療靶點，以實現(xiàn)該病的早期發(fā)現(xiàn)與治療。MYH10 基因參與編碼NMMHC-ⅡB，在哺乳動物線粒體DNA 維持中起著非常重要的作用[21]。據(jù)報道[22]，MYH10 可能可以作為膀胱尿路上皮癌新的治療靶點。另有研究證明[23]，MYH10 誘導(dǎo)MYH9 表達(dá)并通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲。沉默人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的MYH10 后發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路會受到一定程度的抑制[24]。在結(jié)直腸腫瘤組織中MYH10 表達(dá)明顯增高，可以作為診斷結(jié)直腸腫瘤的候選生物標(biāo)志物之一[25]。但MYH10 在腎透明細(xì)胞癌中的作用目前較少報道，本研究旨在通過多種數(shù)據(jù)庫預(yù)測MYH10 在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，尋找MYH10 在腎透明細(xì)胞癌中的機制，以期發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌新的治療方案和靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)，MYH10 在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)減少，提示MYH10 的低表達(dá)與總體率相關(guān)，推測MYH10 在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。另外，UNCLAN 和GEPIA 數(shù)據(jù)庫中均顯示MYH10 與腎透明細(xì)胞癌腫瘤分級有關(guān)，且隨著分級增高，差異越大；隨后用UNCLAN 預(yù)測MYH10 基因啟動子甲基化，發(fā)現(xiàn)在腎透明細(xì)胞癌中甲基化程度高于正常組織（P＜0.05）。本研究還顯示，MYH10 的表達(dá)與B 細(xì)胞（P=4.23e-02）、CD4+T 細(xì)胞（P=1.42e-13）、巨噬細(xì)胞（P=3.71e-10）、中性粒細(xì)胞（P=9.66e-04）、樹突狀細(xì)胞（P=2.16e-1204）的浸潤呈正相關(guān)，與CD8+T 細(xì)胞（P=2.26e-01）的浸潤無關(guān)，提示MYH10 與炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)，繼而影響患者的臨床結(jié)局。

本研究發(fā)現(xiàn)，MYH10 和RAB3A 的表達(dá)密切相關(guān)。為了探索識別出的與MYH10 共表達(dá)的基因可能的信號通路，本研究在Metascape 進(jìn)行了富集，發(fā)現(xiàn)生物過程富集與在分化過程中調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、肽基酪氨酸磷酸化、細(xì)胞粘附的正向調(diào)節(jié)有關(guān)；細(xì)胞成分富集后與液泡溶解、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、粘附結(jié)有關(guān)、分子功能富集后與單價無機陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等有關(guān)；KEGG 通路富集后與胰島素分泌相關(guān)，這些將有利于探索MYH10 參與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的過程。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)MYH10 與多個蛋白存在著共表達(dá)關(guān)系，存在多個相互作用節(jié)點，通過探索MYH10 的上下游調(diào)控蛋白對腎透明細(xì)胞癌的機制研究具有重要價值。

綜上所述，MYH10 在腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)，且與患者預(yù)后相關(guān)；其參與炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞浸潤，MYH10 啟動子的甲基化，共表達(dá)基因，相互作用蛋白都可以成為下一步探索方向，可以更加深入的研究MYH10 慘與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展機制，未來可能可以將MYH10 作為腎透明細(xì)胞癌預(yù)測標(biāo)志物及新的治療靶點。