李靜 謝鵬宇 于天飛 柳芳芳 尹海暢 于志丹

摘要：為獲得番鴨細(xì)小病毒（muscovy duck parvovirus，MDPV）重組結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3，本研究以含有MDPV YL08株VP1基因的重組載體pET-32a-VP1為PCR擴(kuò)增模板，分別亞克隆VP2、VP3基因。構(gòu)建了重組載體 pGEX-6p-VP2、pGEX-6p-VP3并將它們轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta（DE3）中，分別構(gòu)建了重組菌株pGEX-6p-VP2/Rosetta（DE3）和pGEX-6p-VP3/Rosetta（DE3）。2種重組菌株在IPTG誘導(dǎo)下分別獲得了重組蛋白GST-VP2和GST-VP3，分子質(zhì)量分別為91、86 ku。Western blot分析結(jié)果表明，重組蛋白GST-VP2和GST-VP3可特異性結(jié)合GST-tag單克隆抗體和MDPV感染番鴨血清，免疫反應(yīng)性良好。Dot-ELISA比較分析結(jié)果表明，在等質(zhì)量條件下，GST-VP2的免疫反應(yīng)性強(qiáng)于GST-VP3。

關(guān)鍵詞：番鴨細(xì)小病毒;VP2;VP3;原核表達(dá);免疫反應(yīng)性

中圖分類號(hào)： S852.65+7? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）09-0169-04

番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）主要侵害3周齡以內(nèi)的雛番鴨，引起番鴨細(xì)小病毒病，國(guó)內(nèi)亦稱番鴨“三周病”[1-2]。我國(guó)動(dòng)物醫(yī)學(xué)專家林世棠于1991年最先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了該病發(fā)生[3]。番鴨細(xì)小病毒病發(fā)病率為40%～50%，死亡率在50%～80%之間，對(duì)番鴨飼養(yǎng)業(yè)的危害極大[4]。MDPV和親緣關(guān)系密切的鵝細(xì)小病毒（goose parvovirus，GPV）一同被列為細(xì)小病毒科（Parvoviridae）依賴病毒屬（Dependovirus）雁形目依賴細(xì)小病毒1（Anseriform dependoparvovirus 1）[5]。MDPV是1 種單鏈DNA病毒，無囊膜，基因組大小為5 132 nt，兩端為末端倒置重復(fù)序列（ITR）[6]。MDPV基因組有左、右2個(gè)開放閱讀框，以重疊基因的形式利用轉(zhuǎn)錄本可變剪接方式分別編碼轉(zhuǎn)譯非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）和結(jié)構(gòu)蛋白（VP）。已有研究表明，NS參與病毒復(fù)制，調(diào)控病毒基因表達(dá)[7]。VP1、VP2和VP3等3 種結(jié)構(gòu)蛋白以約1 ∶1 ∶8的比例組裝病毒衣殼[8]。已有研究表明，VP2為重要免疫原性蛋白[9]。本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得MDPV YL08株VP2、VP3重組蛋白，以期為MDPV病毒相關(guān)蛋白功能研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

含有MDPV YL08株全長(zhǎng)VP1基因的重組載體pET-32a-VP1[10]、原核表達(dá)載體pGEX-6p-1、感受態(tài)大腸桿菌DH5α和Rosetta（DE3）由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)研究室制備或保存。

1.2 主要分子生物學(xué)試劑

T 4 DNA連接酶、BamHⅠ和XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的GST-tag單克隆抗體購自Thermo Fisher公司。HRP-兔抗鴨IgY IgG（H+L）購自上海銘修生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年10月至2021年2月在齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)研究室進(jìn)行。

1.4 引物設(shè)計(jì)

參照MDPV YL08株VP1基因序列（GenBank登錄號(hào)：KU589295），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了3條特異性引物，由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。

VP2F：5′-CGCGGATCCACGGCTCCTGCTAAAAAG-3′（劃線處為BamHⅠ位點(diǎn)）;

VP3F：5′-CGCGGATCCATGGCAGAGGGAGGAAG-3′（劃線處為BamHⅠ位點(diǎn)）;

VPR：5′-GGCCGCTCGAGTTACAGATTCTGAGTC-3′（劃線處為XhoⅠ位點(diǎn)）。

1.5 基因片段擴(kuò)增及回收純化

VP2基因PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2 μL 1 ∶10 000稀釋的pET-32a-VP1，4 μL dNTPs，5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 上游引物VP2F（25 pmol/μL），1 μL 下游引物VPR（25 pmol/μL），1 μL ExTaq酶（5 U/μL），36 μL 無菌去離子水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4.0 ℃ 5 min;94.0 ℃ 90 s，30.0 ℃ 90 s，72.0 ℃ 3 min，35 個(gè)循環(huán);72.0 ℃ 7 min;4.0 ℃終止反應(yīng)。

VP3基因PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2 μL 1 ∶10 000稀釋的pET-32a-VP1，4 μL d NTPs，5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 上游引物VP3F（25 pmol/μL），1 μL 下游引物VPR（25 pmol/μL），1 μL ExTaq酶（5 U/μL），36 μL 無菌去離子水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4.0 ℃ 5 min;94.0 ℃ 90 s，57.0 ℃ 90 s，72.0 ℃ 3 min，35 個(gè)循環(huán);72.0 ℃ 7 min，4.0 ℃終止反應(yīng)。

上述2種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。按照Omega公司DNA膠回收試劑盒說明書操作流程回收純化VP2、VP3基因PCR擴(kuò)增片段。

1.6 重組載體pGEX-6p-VP2和pGEX-6p-VP3的構(gòu)建

膠回收BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后的VP2、VP3基因PCR擴(kuò)增片段和表達(dá)載體pGEX-6p-1。分別在含有VP2/pGEX-6p-1和VP3/pGEX-6p-1的連接體系中加入T 4 DNA連接酶，于16 ℃的溫度下連接過夜。連接產(chǎn)物VP2/pGEX-6p-1和VP3/pGEX-6p-1分別轉(zhuǎn)化DH5α。挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化后的DH5α菌落于LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素，100 μg/mL）中，37 ℃溫度下培養(yǎng)14 h，按照Omega公司質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作流程提取質(zhì)粒。酶切鑒定并測(cè)序驗(yàn)證外源基因插入的準(zhǔn)確性。獲得的重組載體分別命名為pGEX-6p-VP2、pGEX-6p-VP3。B34FDA31-1A06-492A-ACC5-3C31F209EC5F

1.7 重組蛋白GST-VP2和GST-VP3的誘導(dǎo)表達(dá)

分別將pGEX-6p-VP2和pGEX-6p-VP3轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Rosetta（DE3），制備重組菌pGEX-6p-VP2/Rosetta（DE3）、pGEX-6p-VP3/Rosetta（DE3）。按照1 ∶100的比例分別將pGEX-6p-VP2/Rosetta（DE3）、pGEX-6p-VP3/Rosetta（DE3）接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素，100 μg/mL）的中，220 r/min、37 ℃溫度下繼續(xù)培養(yǎng)至適宜的誘導(dǎo)表達(dá)濃度（D 600 nm=0.5～0.6）時(shí)，加入IPTG使其在整個(gè)誘導(dǎo)體系中的濃度為 1.0 mmol/L，37 ℃溫度下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，間隔1 h取樣。各個(gè)時(shí)間段獲得的菌液樣品以8 000 g/min離心5 min，棄去上清液。以菌體沉淀濕質(zhì)量計(jì)算，按照30 μL/mg的比例用PBS重懸菌體沉淀。通過SDS-PAGE方法檢測(cè)重組蛋白GST-VP2和 GST-VP3 表達(dá)情況。

1.8 重組蛋白GST-VP2和GST-VP3的純化及鑒定

按照文獻(xiàn)[11]所述方法分別純化重組蛋白 GST-VP2 和GST-VP3，Bradford法測(cè)定蛋白濃度[12]。純化的GST-VP2和GST-VP3轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。將含有轉(zhuǎn)印蛋白的膜片置于5%脫脂乳溶液中，于4 ℃溫度下封閉過夜。37 ℃溫度下置于PBS（1 ∶100）稀釋的HRP標(biāo)記抗GST-tag單克隆抗體溶液中孵育2 h，PBST溶液洗滌3 次后以4-CN作為酶促反應(yīng)底物進(jìn)行顯色。

1.9 重組蛋白GST-VP2、GST-VP3的免疫反應(yīng)性

按照“1.8”節(jié)中的操作方法對(duì)重組蛋白GST-VP2和GST-VP3進(jìn)行轉(zhuǎn)印和封閉。封閉后的含有轉(zhuǎn)印蛋白的硝酸纖維素膜在37 ℃溫度下依次置于PBS稀釋（1 ∶200）的MDPV陽性血清中作用2 h、PBS稀釋（1 ∶1 000）的HRP-兔抗鴨IgY IgG（H+L）中作用1 h，PBST溶液洗滌3 次后以4-CN作為酶促反應(yīng)底物進(jìn)行顯色。

1.10 Dot-ELISA比較重組蛋白GST-VP2和 GST-VP3的免疫反應(yīng)性

將GST-VP2和GST-VP3分別以1 000、100、10、1 ng/點(diǎn)的包被量直接點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，一抗使用PBS稀釋（1 ∶200）MDPV陽性血清，酶標(biāo)二抗使用PBS稀釋（1 ∶1 000）的HRP-兔抗鴨IgY IgG（H+L），具體操作步驟參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDPV YL08株VP2、VP3基因的PCR擴(kuò)增

通過PCR擴(kuò)增，分別亞克隆獲得了與預(yù)期大小符合的1 870 bp（VP2）和1 610 bp（VP3）的DNA片段，PCR的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。

2.2 重組載體pGEX-6p-VP2、pGEX-6p-VP3的酶切鑒定

酶切鑒定結(jié)果表明，pGEX-6p-VP2經(jīng)XhoⅠ酶切得到約6 800 bp的條帶（表達(dá)載體pGEX-6p-1和VP2基因片段大小之和），經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切得到約4 900 bp載體條帶和1 900 bp的VP2基因片段條帶;單酶切pGEX-6p-VP3得到約6 500 bp的條帶（表達(dá)載體pGEX-6p-1和VP3基因片段大小之和）、雙酶切pGEX-6p-VP3得到約4 900 bp的載體條帶和1 600 bp的VP3基因片段。由圖2可知，上述酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果表明，VP2、VP3基因已正確插入至原核表達(dá)載體pGEX-6p-1中。

2.3 重組蛋白GST-VP2、GST-VP3的表達(dá)

SDS-PAGE結(jié)果，由圖3可知，IPTG誘導(dǎo)后，pGEX-6p-VP2/Rosetta（DE3）和pGEX-6p-VP3/Rosetta（DE3）可分別表達(dá)出符合預(yù)期大小的91 ku和86 ku的目的蛋白條帶（白色箭頭所示）。

2.4 重組蛋白GST-VP2、GST-VP3的純化及鑒定

由GST-VP2和GST-VP3純化結(jié)果（圖4），Bradford法檢測(cè)GST-VP2和GST-VP3的濃度分別為0.77、0.63 mg/mL。GST-VP2和GST-VP3可與HRP標(biāo)記抗GST-tag單克隆抗體特異性結(jié)合，說明獲得的2種蛋白為融合于GST標(biāo)簽的重組蛋白。

2.5 重組蛋白GST-VP2、GST-VP3的免疫反應(yīng)性

由Western blot結(jié)果（圖5）可知，GST不與MDPV感染番鴨血清結(jié)合，硝酸纖維素膜對(duì)應(yīng)位置無代表陽性反應(yīng)的深色條帶;重組蛋白GST-VP2、GST-VP3可與MDPV陽性血清特異性結(jié)合，硝酸纖維素膜對(duì)應(yīng)位置上顯示出明顯深色條帶，免疫反應(yīng)性良好。

2.6 Dot-ELISA比較重組蛋白GST-VP2和 GST-VP3的免疫反應(yīng)性

重組蛋白GST-VP2和GST-VP3在抗原包被量為1 000、100、10 ng/點(diǎn)時(shí)，均可與MDPV陽性血清發(fā)生特異性的結(jié)合，形成清晰的陽性反應(yīng)斑點(diǎn);抗原包被量在1 ng/點(diǎn)時(shí)，GST-VP3幾乎無可見斑點(diǎn)，GST-VP2仍可見陽性反應(yīng)斑點(diǎn)（圖6） ，表明重組蛋白GST-VP2的免疫反應(yīng)性強(qiáng)于GST-VP3。

3 討論與結(jié)論

MDPV YL08株為2008年筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的1株新型MPDV，重組分析表明其可能起源于不同的MDPV之間的重組[14]。這些新型重組毒株的出現(xiàn)，提示我們?cè)谂R床上應(yīng)持續(xù)監(jiān)測(cè)、探索番鴨細(xì)小病毒病的流行病學(xué)及臨床進(jìn)化。Wang等通過原核系統(tǒng)表達(dá)獲得了MDPV VP1蛋白氨基端的含有198個(gè)氨基酸的重組蛋白，并以此重組蛋白作為檢測(cè)抗原通過Western blot檢測(cè)了臨床血清樣本，檢測(cè)結(jié)果表明，能與該重組蛋白特異性結(jié)合的抗體最早出現(xiàn)于番鴨感染MDPV之后的第6周[15]。據(jù)此認(rèn)為，基于VP蛋白的診斷抗原可用于檢測(cè)MDPV晚期感染。通過桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)的MDPV VP2和VP3蛋白亦具有良好的抗原性，可作為診斷抗原[16]。真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白相較于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白具有更為完善的糖基化等修飾過程，但表達(dá)試驗(yàn)操作步驟復(fù)雜、成本較高，如果原核表達(dá)的蛋白就能滿足免疫反應(yīng)性等要求，采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白更具有時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本優(yōu)勢(shì)。Dot-ELISA分析中，重組蛋白GST-VP2的免疫反應(yīng)性強(qiáng)于GST-VP3，這可能是因?yàn)閂P2蛋白比VP3蛋白的分子量更大，理論上含有更多的抗原表位。本研究獲得了原核表達(dá)的抗原性良好的MDPV 重組VP2、VP3蛋白，可為MDPV病毒蛋白功能研究奠定一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。B34FDA31-1A06-492A-ACC5-3C31F209EC5F

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