戰(zhàn)俊澎 鄒德穎 常江 楊馨 郭珣 張凱 劉益辛 胡盼 盧士英 李巖松 柳增善 任洪林

摘要：以小鼠脾臟cDNA為模板，用降落PCR擴(kuò)增IL-1Ra基因片段，IL-1Ra基因片段長約為537 bp。將IL-1Ra擴(kuò)增片段和原核表達(dá)載體pET-30a（+）連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，在37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，重組表達(dá)的小鼠IL-1Ra蛋白的分子質(zhì)量為19 ku。用純度較好的小鼠IL-1Ra重組蛋白免疫兔子，制備特異性多克隆抗體;測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)達(dá)到1 ∶4 096 000。經(jīng)Western-Blot鑒定該抗體可與Raw264.7細(xì)胞中表達(dá)的小鼠IL-1Ra天然蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western-Blot檢測(cè)表明布魯氏菌S2弱毒株感染Raw264.7細(xì)胞（小鼠單核巨噬細(xì)胞）后小鼠IL-1Ra上調(diào)表達(dá)。本研究成功制備了小鼠IL-1Ra重組蛋白和兔抗多克隆抗體，為深入探討小鼠IL-1Ra與布魯氏菌感染之間的關(guān)系提供工具。

關(guān)鍵詞：小鼠;IL-1Ra;原核表達(dá);多克隆抗體;IL-1Ra重組蛋白

中圖分類號(hào)：S858.91 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）09-0037-06

白介素-1（IL-1）家族是最早報(bào)道的細(xì)胞因子家族之一，由8個(gè)細(xì)胞因子（IL-1β、IL-1α、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-37）和3個(gè)受體拮抗劑（IL-1Ra、IL-36Ra、IL-38）組成[1]。IL-1Ra是IL-1的1個(gè)結(jié)構(gòu)變體，與 IL-1R 結(jié)合的親和力幾乎與IL-1相同，但不能激活細(xì)胞[2-3]。盡管IL-1及IL-1Ra與 IL-1RⅠ 具有相似的親和力，但是由于少數(shù)IL-1與IL-1RⅠ結(jié)合便足以完全激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且多數(shù)細(xì)胞中IL-1RⅠ表達(dá)水平較高，在表達(dá) IL-1Ra 的細(xì)胞中至少需要100～1 000倍過量的IL-1Ra才能抑制50%的IL-1反應(yīng)[4-5]。IL-1Ra 包括4個(gè)亞型，1個(gè)分泌型（sIL-Ra1）和3個(gè)胞內(nèi)型（icIL-1Ra1、icIL-1Ra2、icIL-1Ra3），其中sIL-Ra1和icIL-1Ra1與IL-1R結(jié)合良好，而icIL-1Ra3與受體結(jié)合能力較弱[6]。IL-1Ra可以減輕被注射脂多糖（LPS）的兔子產(chǎn)生嚴(yán)重的低血壓，并在免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的炎癥性腸病動(dòng)物模型中減輕IL-1介導(dǎo)的腸道炎癥和壞死，證明IL-1Ra在一些病理情況下有助于逆轉(zhuǎn)IL-1所引起的炎癥反應(yīng)[7-8]。

IL-1β與IL-1Ra已經(jīng)證明在維持腸道穩(wěn)態(tài)，炎癥性腸?。↖BD）和炎癥性結(jié)直腸癌（CRC）的發(fā)病機(jī)制中存在2種不同的甚至相反的功能[9-10]。過量的IL-1釋放會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及自身免疫類疾病[11]。而IL-1Ra重組蛋白與不同藥物聯(lián)用可以有效治療一些疾病，目前IL-1Ra也可應(yīng)用于基因治療[12]。目前已有研究證明，IL-1Ra重組蛋白對(duì)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是有效果的[13]。筆者所在課題組前期通過構(gòu)建布魯氏菌強(qiáng)毒株、弱毒株感染綿羊白細(xì)胞層抑制性消減雜交（SSH）cDNA文庫，篩選到2種差異表達(dá)的基因——IL-1β和 IL-1Ra，并證明了布魯氏菌S2疫苗株與野毒株感染可引起這2個(gè)基因差異表達(dá)[14]。且目前國內(nèi)外未見同時(shí)針對(duì)IL-1β及IL-1Ra與布魯氏菌之間關(guān)系的研究報(bào)道，因此對(duì)IL-1Ra分子特征與生理病理功能的研究將有助于探究其與布魯氏菌感染之間的關(guān)系。

本研究擬通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-Ra并進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，免疫動(dòng)物制備抗小鼠IL-1Ra重組蛋白的多克隆抗體，以期探究小鼠IL-1Ra與布魯氏菌感染之間的關(guān)系。

1 材料與方法

試驗(yàn)在吉林大學(xué)人獸共患病研究所細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為2020年7月至2021年9月。

1.1 材料

布魯氏菌S2弱毒株、原核表達(dá)載體pET-30a（+），大腸桿菌BL21（DE3）和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Raw264.7細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;SPF級(jí)雌性兔子購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司;TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，ES-Taq酶，DL2000 DNA maker，限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ，T 4 DNA 連接酶和pMDTM18-T Vector Cloning Kit均購自TakaRa公司;質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司;彩虹預(yù)染蛋白marker和M5 HiPer ECL Western HRP Substrate（超敏ECL發(fā)光液）購自北京聚合美生物科技有限公司;弗氏不完全和弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司;TMB顯色液A液和B液購自北京梅科萬德生物科技有限公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自安諾倫生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

鼠源IL-1Ra基因的CDS序列（登錄號(hào)：NM 001039701.3）來源于NCBI數(shù)據(jù)庫。引物序列如下：上游引物，5′-GGAATTCCATATGCGCCCTTCTGGGAAAAGACCCTGCAAGATGCAAGCCTTCA-3′;下游引物，5′-CCGCTCGAGCTAATGGTGATGGTGATGATGTTGGTCTTCCTGGAAGTAGAACTT-3′（下劃線部分分別為NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。引物合成自吉林省庫美生物科技有限公司。

1.3 目的片段的擴(kuò)增

用TRIzol法提取小鼠脾臟總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80 ℃分裝，保存。以小鼠脾臟cDNA為模板，降落PCR擴(kuò)增得到小鼠IL-1Ra基因的CDS區(qū)序列。PCR反應(yīng)總體系為 20 μL：模板2 μL，2×Es Taq MasterMix（Dye） 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH 2O 6 μL。降落PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 7 min;95 ℃ 1 min、72 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，每1個(gè)循環(huán)降低1 ℃，共23個(gè)循環(huán);94 ℃ 1 min、60 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，共25個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證產(chǎn)物正確后，用膠回收試劑盒回收目的片段。將純化好的目的片段與pMD-18T載體連接后轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用西林瓶涂布于含有氨芐的LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，將鑒定正確的菌株送去測(cè)序，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pMD-18T-Ra。3C7D4F95-0118-493B-927E-EE6BECA5C702

1.4 pET-30a-Ra重組質(zhì)粒的構(gòu)建

從測(cè)序正確的重組菌株和保種的pET-30a（+）菌株中提取質(zhì)粒。將pMD-18T-Ra質(zhì)粒和 pET-30a（+） 空質(zhì)粒分別用NdeⅠ和XhoⅠ這2種限制性核酸內(nèi)切酶在37 ℃進(jìn)行雙酶切5 h，利用T 4 DNA連接酶將IL-1Ra與pET-30a（+）載體 16 ℃ 過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用西林瓶涂布于含有卡那霉素的LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，取正確的重組質(zhì)粒進(jìn)一步用NdeⅠ和xhoⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將鑒定正確的菌液送去測(cè)序，將正確的質(zhì)粒命名為pET-30a-Ra。

1.5 IL-1Ra重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將重組克隆質(zhì)粒pET-30a-Ra轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，用西林瓶涂布于含有卡那霉素的LB固體平板上，挑取單克隆菌株，接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并測(cè)序。小鼠IL-1Ra表達(dá)菌分別在37 ℃和16 ℃，加入終濃度為1 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）對(duì)菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。一段時(shí)間后收集菌體重懸（緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl（pH值7.6）、10%甘油、0.5 mol/L NaCl、10 mmol/L咪唑）后并超聲破碎，分別對(duì)上清和包涵體進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠（SDS-PAGE）電泳，分析目的蛋白表達(dá)形式，確定目的蛋白上清表達(dá)的最佳表達(dá)條件。

1.6 IL-1Ra重組蛋白的純化

將pET-30a-Ra陽性菌液以1 ∶100接種至 1 L 含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，按照“1.5”節(jié)誘導(dǎo)表達(dá)步驟進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。超聲破碎后的細(xì)菌裂解液12 000 r/min離心40 min，取上清與 Ni-NTA Beads 于4 ℃孵育結(jié)合1 h，分別用含有不同咪唑濃度（40、60、80、150、250 mmol/L）的洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl（pH值7.6）、10%甘油、0.5 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑）進(jìn)行梯度洗脫，分別收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，以確定將目的蛋白洗脫下來的緩沖液咪唑濃度。純化好的蛋白裝進(jìn)透析袋中，在磷酸緩沖鹽溶液（PBS緩沖液）中24 h內(nèi)透析4次，PEG2000濃縮后用BCA標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度為1.2 mg/mL。

1.7 多克隆抗體制備

免疫前耳緣靜脈采集陽性血清，將重組IL-1Ra蛋白采用背部皮下多點(diǎn)注射的方式免疫新西蘭大白兔，每次間隔7 d，共免疫5次。初次免疫時(shí)800 μg重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合均勻，之后的加強(qiáng)免疫用400 μg重組蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻，5次免疫后3 d耳緣靜脈采集血液分離血清。

1.8 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定采集分離血清中的抗體效價(jià)。用重組IL-1Ra蛋白? 5 μg/mL 100 μL/孔包被ELISA酶標(biāo)板，37 ℃培養(yǎng)箱包被2 h;PBST洗滌3次，5%脫脂乳（5 g脫脂奶粉溶解于100 mL PBST中） 200 μL/孔，37 ℃封閉 1 h;PBST洗滌3次，將兔抗IL-1Ra多克隆抗體進(jìn)行倍比稀釋，免疫前血清作為對(duì)照的陰性血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h;PBST洗滌3次，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體1 ∶4 000倍稀釋，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h;PBST洗滌3次，將TMB顯色A液和B液等體積混合，100 μL/孔，37 ℃避光 8 min，加入終止液，50 μL/孔，立即使用酶標(biāo)儀450 nm波長處測(cè)量D值。

1.9 多克隆抗體反應(yīng)原性鑒定

收集Raw264.7細(xì)胞沉淀，用混合好的RIPA裂解液（1%PMSF）裂解細(xì)胞，4 ℃ 10 000 r/min 離心10 min，吸取上清后加入蛋白上樣緩沖液，煮沸 10 min，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，將PVDF浸沒在5%脫脂乳（5 g脫脂奶粉溶解于100 mL TBST中）中在水平搖床上室溫封閉2 h，將多克隆抗體1 ∶500倍稀釋作為一抗，4 ℃ 過夜孵育，TBST洗滌3次，每次10 min;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體1 ∶5 000倍稀釋作為二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，每次10 min;超敏ECL發(fā)光液顯色。

1.10 布魯氏菌S2弱毒株感染宿主細(xì)胞后對(duì)小鼠IL-1Ra表達(dá)的影響

以細(xì)胞數(shù) ∶細(xì)菌數(shù)=1 ∶100的劑量感染Raw264.7細(xì)胞，并以PBS組為對(duì)照組，收集0、4、8、12、24 h樣品，用qPCR檢測(cè)小鼠IL-1Ra基因的mRNA水平變化，用蛋白質(zhì)印跡法（Western-Blot）檢測(cè)小鼠IL-1Ra蛋白表達(dá)水平變化。引物序列見表1。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。采用2-ΔΔC T法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1分別表示在0.05、0.01、0.001、0.000 1水平差異顯著，分別用*、**、***、****表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠IL-1Ra基因擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳顯示，在537 bp處有明亮的條帶（圖1），與預(yù)期大小相符。

2.2 pET-30a-Ra重組質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)重組質(zhì)粒pET-30a-Ra經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，可以看到1條5 400 bp的條帶和1條537 bp 的條帶（圖2），片段大小符合預(yù)期，經(jīng)測(cè)序表明重組質(zhì)粒與目的基因序列比對(duì)完全一致，證明pET-30a-Ra原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。3C7D4F95-0118-493B-927E-EE6BECA5C702

2.3 IL-1Ra重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

從圖3可以看出，重組蛋白在37、 16 ℃均能誘導(dǎo)表達(dá)且重組蛋白在上清中的表達(dá)量都高于包涵體， 但是37 ℃時(shí)重組蛋白的表達(dá)量高，因此誘導(dǎo)條件確定為終濃度1 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo) 8 h，此時(shí)重組蛋白主要以上清形式表達(dá)，分子量約為19 ku。

2.4 IL-1Ra重組蛋白的純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，用40 mmol/L咪唑洗3遍后再用60 mmol/L咪唑洗2遍，對(duì)雜蛋白的洗滌效果最好，最后用250 mmol/L咪唑可以將重組蛋白完全洗脫下來，此時(shí)重組蛋白的純度較好（圖4）。

2.5 多克隆抗體的制備及抗體效價(jià)的測(cè)定

利用純化的IL-1Ra重組蛋白免疫兔子制備多克隆抗體，采用間接ELISA法測(cè)定5次免疫后多克隆抗體的效價(jià)已經(jīng)達(dá)到1 ∶4 096 000（圖5），表明純化的IL-1Ra重組蛋白能夠誘導(dǎo)新西蘭大白兔產(chǎn)生高效價(jià)的抗體。

2.6 多克隆抗體反應(yīng)原性鑒定

Western-Blot 結(jié)果顯示，制備的多克隆抗體能夠很好地識(shí)別Raw264.7中表達(dá)的天然IL-1Ra蛋白（圖6），該抗體可以用于檢測(cè)布魯氏菌感染Raw264.7細(xì)胞后IL-1Ra蛋白的變化。

2.7 布魯氏菌S2弱毒株感染宿主細(xì)胞后對(duì)小鼠IL-1Ra表達(dá)的影響

運(yùn)用qPCR技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠IL-1Ra基因mRNA表達(dá)水平變化，與PBS組相比，8、12、24 h 小鼠IL-1Ra基因表達(dá)量顯著升高，在24 h時(shí)達(dá)到峰值（圖7）。Western-Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PBS組相比，4、8、12、24 h小鼠IL-1Ra蛋白的表達(dá)量均顯著升高，其上升趨勢(shì)與mRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)果一致，與預(yù)期結(jié)果相符（圖8、圖9）。

3 討論與結(jié)論

IL-1與IL-1Ra的平衡在炎癥性腸?。↖BD）中起重要作用，在疾病早期IL-1就在結(jié)腸中產(chǎn)生，且IL-1水平與組織炎癥程度相關(guān)，在炎癥消退之前，結(jié)腸中IL-1Ra的水平是IL-1的10倍[15]。在該動(dòng)物模型中，加入IL-1Ra的中和抗體會(huì)導(dǎo)致炎癥延長和死亡率增加，表明了內(nèi)源性IL-1Ra抗炎的重要性，且外源加入IL-1Ra重組蛋白可以抑制炎癥[16-17]。大量IBD動(dòng)物模型的研究表明，IL-1 和IL-1Ra的差異表達(dá)與IBD之間存在一定的相關(guān)性，且隨著病情的好轉(zhuǎn)，IL-1、IL-1Ra表達(dá)異常也得到緩解。筆者所在課題組前期通過構(gòu)建布魯氏菌強(qiáng)毒株、弱毒株感染綿羊白細(xì)胞層抑制性消減雜交（SSH）cDNA文庫，篩選到差異表達(dá)基因IL-1β與IL-1Ra[12]，并且建立了IL-1β及其拮抗因子的熒光定量PCR檢測(cè)方法[18]，雙熒光ELISA檢測(cè)方法[19]和雙T線膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法[20]，初步探討了IL-1β與IL-1Ra之間關(guān)系對(duì)布魯氏菌病自然感染與疫苗免疫的鑒別診斷作用，提示 IL-1Ra 與布魯氏菌感染之間可能存在某種聯(lián)系。因此，為了建立區(qū)別鑒定布魯氏菌病自然感染與疫苗免疫的檢測(cè)方法，掌握IL-1Ra分子特征與生理病理功能至關(guān)重要。

本研究針對(duì)小鼠的IL-1Ra基因構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-30a-Ra，成功獲得了可溶性表達(dá)的小鼠IL-1Ra重組蛋白，通過鎳柱純化后，經(jīng) SDS-PAGE 驗(yàn)證獲得純度較好的重組蛋白。將純化后的重組蛋白作為免疫原免疫兔子獲得多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA測(cè)定，兔抗多克隆抗體效價(jià)能夠達(dá)到1 ∶4 096 000，經(jīng)過Western-Blot檢測(cè)結(jié)果表明，多克隆抗體能夠特異性識(shí)別Raw264.7細(xì)胞中表達(dá)的天然IL-1Ra蛋白，可用于檢測(cè)布魯氏菌弱毒株感染Raw264.7細(xì)胞后小鼠IL-1Ra的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究小鼠IL-1Ra與布魯氏菌感染的關(guān)系提供了良好的試驗(yàn)材料。

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