楊惠芳，湯蕊，羅雪，，高慶軍，陳星宏，趙代偉，4

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550000；2.貴州省畢節(jié)市第一人民醫(yī)院甲狀腺外科，貴州 畢節(jié) 551700；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院甲狀腺外科，貴州 貴陽 550000；4.貴州省第二人民醫(yī)院甲狀腺外科，貴州 貴陽 550004）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最常見的病理組織學(xué)類型，約占甲狀腺癌（thyroid carcinoma， TC） 的80% 以上[1]，近年來其發(fā)病率以每年4%的速度上升[2]。多數(shù)的PTC 患者通過手術(shù)治療、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH） 抑制治療及131I治療后可達(dá)到臨床治愈，但侵襲性較高的PTC 患者其5年復(fù)發(fā)率約5%[3]，且晚期PTC 通常預(yù)后不良[4]。PTC 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不清楚，但已發(fā)現(xiàn)不少危險(xiǎn)因素與PTC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括遺傳、環(huán)境暴露、表觀遺傳改變等[5-6]。因此，深入探討PTC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理對(duì)于尋求新的防治靶點(diǎn)有著重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNAs （long non-coding RNA，lncRNA）在調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。其中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA FoxP4-AS1（lncRNA FoxP4-AS1） 是位于6 號(hào)染色體的基因間lncRNA，與FoxP4 反向頭尾分布，但外顯子無互補(bǔ)區(qū)域，含588 個(gè)堿基對(duì)[7-8]。lncRNA FoxP4-AS1 首次在結(jié)直腸癌中被發(fā)現(xiàn)[9]，此后，人們?cè)诙喾N腫瘤中發(fā)現(xiàn)FoxP4-AS1 的表達(dá)，包括骨肉瘤[10]、胃癌[11]、前列腺癌[12]、宮頸癌[13]、鼻咽癌[14]、食管鱗狀細(xì)胞癌[15]以及胰腺導(dǎo)管腺癌[16]等，且FoxP4-AS1 在腫瘤中高表達(dá)，預(yù)示著預(yù)后不良。而課題組前期研究[17]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxP4-AS1 在PTC 中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)是PTC 區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但FoxP4-AS1 對(duì)PTC 細(xì)胞生物學(xué)的影響及其作用機(jī)理目前尚不清楚。因此，本研究旨在通過慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)探究lncRNA FoxP4-AS1 對(duì)PTC 細(xì)胞（TPC-1、K1 細(xì)胞） 生物學(xué)行為的影響，及其潛在的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1（武漢普諾賽生命科技有限公司），人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1 及人正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy-ori3-1（上海市長(zhǎng)海醫(yī)院）； RPMI 1640 培養(yǎng)基和DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；6 孔、24 孔組織培養(yǎng)板（康寧公司，美國(guó)）；過表達(dá)慢病毒（上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，GOSL0262738，中國(guó)）；TRIzol（Ambion，美國(guó)）；ECL 顯色試劑盒、nanodrop 2000（Thermo Fisher， 美 國(guó)）； LnRcute LncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、LnRcute LncRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（天根生化科技有限公司，中國(guó)北京）；CFX Connect 檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-rad，美國(guó)）；CCK-8 試劑盒（APE×BIO 公司，美國(guó)）；甲醇、4%多聚甲醛、蘇木素（Servicebio，中國(guó)武漢）；EdU 檢測(cè)試劑盒（Ribobio，中國(guó)廣州）；DAPI（Solarbio，中國(guó)北京）；周期試劑盒（凱基生物，中國(guó)）；流式細(xì)胞儀（Beckman，美國(guó)）；Transwell 小室、基質(zhì)膠（Corning 公司，美國(guó)）；抗體（貴州華遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 人PTC 細(xì)胞TPC-1 和人正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy-ori3-1 培養(yǎng)在RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清、0.1 mg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素）中，人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞K1 培養(yǎng)在DMEM 完全培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清、0.1 mg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素）中，置于恒溫培養(yǎng)箱中（37 ℃、5% CO2）。將甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞（TPC-1、K1 細(xì)胞） 分別分為FoxP4-AS1組（轉(zhuǎn)染FoxP4-AS1 過表達(dá)慢病毒載體）和陰性對(duì)照組（negative control，NC 組）（轉(zhuǎn)染空載病毒）。慢病毒的構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司完成，其核苷酸序列為：FoxP4-AS1 組：GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC CCT GGT TTT CTG TGG AAA G； NC：CAC ACA TTC CAC AGG CTA GCT GCA CTT TGA TAA CAA TAA ACT C。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁，將配制好的病毒感染液（MOI=100，病毒滴度=1×108TU/mL）加入6 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h 后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，中途可換液。感染72 h 后（細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%），用嘌呤霉素（2 μg/mL）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效率。

1.2.2 RNA 提取及qRT-PCR TRIzol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA，Nanodrop 2000 測(cè)定RNA 的濃度和純度。取1 μg 總RNA，用LnRcute LncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，LnRcute LncRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒和CFX Connect 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。lncRNAFoxP4-AS1 的表達(dá)以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。FoxP4-AS1 引物及內(nèi)參引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成（表1）。 以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

表1 FoxP4-AS1引物及內(nèi)參引物序列Table 1 The primer sequences of FoxP4-AS1 and internal reference

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8 法） 細(xì)胞以5×103/孔的密度接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染0、1、2、3、4 d 后，將10 μL CCK-8 試劑加入每個(gè)孔中，在37 ℃下孵育1 h。使用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)0、1、2、3、4 d 的450 nm 處的吸光度。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 制備好細(xì)胞懸液后，以1 000 個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于六孔板中，每組設(shè)3 個(gè)平行復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 周左右肉眼可觀察到細(xì)胞克隆團(tuán)，棄去培養(yǎng)基，以PBS 洗3 次，甲醇固定細(xì)胞15 min，晾干后加入蘇木素染色30 min，晾干后掃描拍照，計(jì)數(shù)肉眼可見的細(xì)胞克隆團(tuán)。

1.2.5 EdU 實(shí)驗(yàn) 用EdU 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。用慢病毒或空載體轉(zhuǎn)染兩種PTC 細(xì)胞系，以20 000 個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種于24 孔板中，每組設(shè)3 個(gè)平行復(fù)孔。將50 μM EdU 標(biāo)記培養(yǎng)基加入到24 孔板中，置于培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中孵育2 h。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，甘氨酸（2 mg/mL） 洗滌殘留的甲醛，用0.5% Triton X-100 脫色搖床孵育10 min。PBS 清洗后，加入抗EdU 工作溶液在室溫避光染色30 min，然后用100 μL DAPI 在室溫孵育5 min 并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.6 細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn) 用Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲及遷移能力。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞消化，用無血清的RPMI 1640 或DMEM 培養(yǎng)基重懸，添加到涂有Matrigel 基質(zhì)膠的Transwell 上室（遷移試驗(yàn)不添加基質(zhì)膠）中，下室加入含10%血清的1640 或DMEM 培養(yǎng)基。小室置于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，輕輕除去膜上的細(xì)胞，膜下的細(xì)胞用甲醇固定，結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 制備好細(xì)胞懸液后，用PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞1 次（離心800 r/min，5 min），收集細(xì)胞行70%乙醇4 ℃過夜，再離心收集細(xì)胞，PBS 重懸，加入提前配制好的500 μL 碘化丙啶（propidium，PI）/核糖核酸酶A（Rnase A）（Rnase A∶PI=1∶9） 染色工作液，室溫避光染色30 min 后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.2.8 Western blot 收集細(xì)胞后，經(jīng)裂解液裂解，在4 ℃下離心12 000 r/min，30 min 提取蛋白。使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，40 μg 蛋白經(jīng)12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，在室溫條件下用5% 脫脂牛奶封閉2 h，再加入CDK4/cyclinD1 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST 洗去一抗，HRP 標(biāo)記 二抗（1∶5 000） 室 溫孵育1 h，TBST 洗3 次，通過ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH （1∶1 000） 作為內(nèi)參。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.2.9 皮下移植瘤模型的構(gòu)建 選取4～8 周齡雌性NOD-SCID 小鼠20 只，用耳標(biāo)鉗對(duì)小鼠標(biāo)記，隨機(jī)將小鼠分為4 組，每組5 只。消化細(xì)胞，用生理鹽水重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/mL，于小鼠背部皮下注射體積為0.2 mL 的單細(xì)胞懸液，接種后每5 天觀察1 次，選取適當(dāng)時(shí)間，將實(shí)驗(yàn)小鼠處死，取出腫瘤進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（倫理審批號(hào)：No1800829）。

1.2.10 FoxP4-AS1 在甲狀腺癌中的功能富集分析下載KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSEA 數(shù)據(jù)，對(duì)FoxP4-AS1 低表達(dá)和FoxP4-AS1 高表達(dá)的基因組之間的差異通路進(jìn)行了富集分析。統(tǒng)計(jì)出滿足標(biāo)準(zhǔn)（P<0.05）的相關(guān)信號(hào)通路，使用ggplot2 包可視化重要功能及通路。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

分別采用SPSS 22.0 和Graphpad Prism 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖，對(duì)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTC細(xì)胞中l(wèi)ncRNA FoxP4-AS1表達(dá)水平

通過qRT-PCR 檢測(cè)人PTC 細(xì)胞系（TPC-1、K1細(xì)胞）和人正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞（Nthy-ori3-1細(xì)胞） 中FoxP4-AS1 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：人PTC 細(xì)胞系TPC-1、K1 中FoxP4-AS1 的表達(dá)水平明顯低于人正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞Nthy-ori3-1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.660±0.078vs.1.000±0.000；0.523±0.006vs.1.000±0.000，均P<0.05）（圖1）。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA FoxP4-AS1表達(dá)Figure 1 qRT-PCR detection of lncRNA FoxP4-AS1 expression

2.2 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)果

為探討FoxP4-AS1 在PTC 細(xì)胞中的生物學(xué)功能，通過慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將FoxP4-AS1 過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染到TPC-1、K1 細(xì)胞中，qRT-PCR 檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效能。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FoxP4-AS1 過表達(dá)慢病毒（FoxP4-AS1 組） 后，TPC-1、K1 細(xì)胞的FoxP4-AS1表達(dá)水平明顯升高，與NC 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.440±0.026vs.1.000±0.000；0.273±0.021vs.1.000±0.000，均P<0.01）（圖2）。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果Figure 2 qRT-PCR detection of transfection effect

2.3 FoxP4-AS1對(duì)PTC細(xì)胞增殖能力的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8 法）、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、EdU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示：慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)FoxP4-AS1 后，TPC-1、K1 細(xì)胞的增殖能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）（圖3）。

圖3 細(xì)胞的增殖能力檢測(cè) A：CCK-8實(shí)驗(yàn)；B：細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)；C：EdU實(shí)驗(yàn)Figure 3 Detection of cell proliferative capacity A:CCK-8 assay;B:Colony formation assay;C:EdU incorporation assay

2.4 FoxP4-AS1 對(duì)PTC 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：使用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)FoxP4-AS1 后，與NC 組相比，TPC-1、K1 細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）（圖4）。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTC細(xì)胞的遷移和侵襲能力Figure 4 Transwell assay for detecting the migration and invasion abilities of PTC cells

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：通過轉(zhuǎn)染使TPC-1、K1 細(xì)胞的FoxP4-AS1 表達(dá)上調(diào)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞周期情況。結(jié)果顯示，過表達(dá)FoxP4-AS1 后，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖5）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PTC細(xì)胞的細(xì)胞周期Figure 5 Detection of cell cycle of PTC cells by flow cytometry

2.6 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)和LncTar網(wǎng)站的分析

GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)信息顯示，僅CDK4 在甲狀腺癌和癌旁（thyroid carcinoma，THCA） 中有較為明顯的差異，在CDK2 和CDK6 中無明顯差異。LncTar（http://www.cuilab.cn/lnctar）網(wǎng)站通過FASTA格式預(yù)測(cè)FoxP4-AS1 與CDK4 的潛在相互作用靶點(diǎn)，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxP4-AS1 與CDK4 存在多個(gè)潛在的相互作用靶點(diǎn)，且結(jié)合較牢固（圖6）。

圖6 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)和LncTar網(wǎng)站分析FoxP4-AS1與CDK4潛在的相互作用靶點(diǎn)Figure 6 Analysis of the potential interaction targets of FoxP4-AS1 and CDK4 using the GEPIA database and LncTar website

2.7 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的PTC細(xì)胞中CDK4/cyclinD1表達(dá)情況

通過慢病毒過表達(dá)TPC-1、K1 細(xì)胞中的FoxP4-AS1 表達(dá)水平，采用Western blot 檢測(cè)CDK4/cyclinD1表達(dá)情況。結(jié)果顯示，過表達(dá)FoxP4-AS1 后，CDK4/cyclinD1 明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖7）。

2.8 皮下移植瘤模型的構(gòu)建

NOD-SCID 小鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)的環(huán)境中，待小鼠適應(yīng)環(huán)境，5 d 后于皮下接種細(xì)胞，30 d 后處死小鼠，每5 天對(duì)小鼠及瘤體進(jìn)行觀察和測(cè)量。結(jié)果顯示：過表達(dá)FoxP4-AS1 后，皮下移植瘤大小及體積明顯縮小。HE 染色顯示：腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)稀疏，胞核形態(tài)各異，腫瘤為PTC。免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：過表達(dá)FoxP4-AS1 后，Ki-67表達(dá)明顯減少（圖8）。

圖8 皮下移植瘤實(shí)驗(yàn) A：瘤體大小及體積；B：HE染色（×100）；C：免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)Ki-67的表達(dá)（×100）Figure 8 Subcutaneous tumor transplantation model A:Tumor size and volume; B: HE staining (×100); C:The expression of Ki-67 detected by immunohistochemical staining(×100)

2.9 TC中FoxP4-AS1的功能富集分析

基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)FoxP4-AS1 低表達(dá)和FoxP4-AS1 高表達(dá)的基因組之間的差異通路進(jìn)行了GSEA 富集分析，PI3K-Akt-mTOR 通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)相互作用在FOXP4-AS1 低表達(dá)組中被富集（圖9A-D）；DNA 甲基化、氧化應(yīng)激通路等在FOXP4-AS1高表達(dá)組中被富集（圖9E-F）。

圖9 通路富集分析 A：PI3K-Akt-mTOR 通路；B：細(xì)胞周期；C：細(xì)胞凋亡；D：免疫調(diào)節(jié)相互作用；E：DNA 甲基化；F：氧化應(yīng)激通路Figure 9 Pathway enrichment analysis A: PI3K-Akt-mTOR pathway; B: Cell cycle; C: Apoptosis; D: Immunomodulatory interactions;E:DNA methylation;F:oxidative stress pathway

3 討 論

近年來隨著B 超、細(xì)針穿刺活檢技術(shù)的普及，PTC 的發(fā)病率逐年升高，且逐漸趨向年輕化[18]。盡管PTC 的治療手段取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但PTC 患者的復(fù)發(fā)率和癌癥相關(guān)病死率并沒有明顯改善[19]。因此，尋找PTC 有效的分子生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)是十分必要的。

lncRNA 是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子。它是一類長(zhǎng)度超過200 個(gè)核苷酸，大小在200 bp 到100 kb 之間，且無編碼蛋白質(zhì)能力的轉(zhuǎn)錄物[20]。許多研究表明lncRNA 對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[21]，通過多種方式參與調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過程，促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生與進(jìn)展[22]。研究[23]發(fā)現(xiàn)lncRNA 是多種生物調(diào)節(jié)活性的主要調(diào)控因子，如基因表達(dá)、劑量補(bǔ)償、等位基因印跡和基因組包裝等。隨著人們對(duì)lncRNA 研究的深入，越來越多的證據(jù)表明lncRNA 表達(dá)失調(diào)對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮至關(guān)重要的作用，它們的表達(dá)失調(diào)與惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[24-26]，lncRNA FoxP4-AS1是其中研究相對(duì)較少的基因。已有研究[9-16]證明FoxP4-AS1 在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，其高表達(dá)預(yù)示著預(yù)后不良。而在甲狀腺乳頭狀癌中，已有文獻(xiàn)[17]表明，F(xiàn)oxP4-AS1 在PTC 中表達(dá)明顯降低，其低表達(dá)是PTC 區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但其對(duì)PTC 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)理目前尚不明確。

因此，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究，首先通過qRT-PCR 檢測(cè)lncRNA FoxP4-AS1 在PTC 細(xì)胞和人甲狀腺正常濾泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平，通過慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)PTC 細(xì)胞（TPC-1 細(xì)胞和K1 細(xì)胞）進(jìn)行FoxP4-AS1 過表達(dá)，qRT-PCR 檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效能；同時(shí)探究FoxP4-AS1 對(duì)PTC 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。此外，通過生信分析預(yù)測(cè)FoxP4-AS1 與CDK4 之間的潛在作用靶點(diǎn)，并通過Western blot 進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxP4-AS1 在PTC 細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，這與湯蕊等[17]研究結(jié)果一致。過表達(dá)FoxP4-AS1 后，CCK-8 實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)均顯示FoxP4-AS1 組的增殖能力降低，這提示FoxP4-AS1 可抑制PTC 的增殖。同時(shí)EdU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在TPC-1 細(xì)胞和K1 細(xì)胞中，F(xiàn)oxP4-AS1 組的細(xì)胞數(shù)目（帶紅色熒光）較NC 組來說是減少的，說明上調(diào)FoxP4-AS1 表達(dá)可抑制兩種細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步證明FoxP4-AS1 能夠抑制PTC 細(xì)胞增殖。此外，上調(diào)FoxP4-AS1 后，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：兩種細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低，提示FoxP4-AS1 可以降低PTC 的侵襲性，可以作為PTC 的一個(gè)保護(hù)性因素。增殖作為癌細(xì)胞的重要特性，由于腫瘤細(xì)胞周期失控，增殖無極限性，是導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因[27]。因此我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PTC 細(xì)胞的周期，結(jié)果表明：過表達(dá)FoxP4-AS1 后，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。由于CDK 是調(diào)控細(xì)胞周期的一個(gè)關(guān)鍵物質(zhì)，它是通過對(duì)其他蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾來驅(qū)動(dòng)整個(gè)細(xì)胞周期的，而cyclin 具有調(diào)控CDK 的功能，且通常以cyclin/CDK 復(fù)合物的形式發(fā)揮作用，CDK 和cyclin 相互配合能更有效地控制整個(gè)細(xì)胞周期的全過程[28]。細(xì)胞周期的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致一系列的疾病，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病和中風(fēng)等[29-30]。因此，本研究使用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)CDK2/4/6 在THCA 中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)僅CDK4 在THCA 中的表達(dá)有差異，而CDK2 和CDK6 則沒有明顯差異，LncTar 網(wǎng)站分析顯示FoxP4-AS1 與CDK4 之間存在潛在的相互作用靶點(diǎn)，且結(jié)合較牢固，提示FoxP4-AS1 可能直接與CDK4 相互結(jié)合而發(fā)揮作用。因在細(xì)胞周期的調(diào)控過程中，CDK4 通常與cyclinD1 結(jié)合發(fā)揮作用[31]，因此，通過Western blot 實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)FoxP4-AS1 與CDK4 之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，上調(diào)FoxP4-AS1 后，CDK4/cyclinD1 表達(dá)減少，提示FoxP4-AS1 可能負(fù)向調(diào)控CDK4/cyclinD1，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。通過建立NOD-SCID 小鼠異種移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FoxP4-AS1 后，NOD-SCID 小鼠所成腫瘤的大小和體積均明顯降低，且Ki-67 表達(dá)減少，提示FoxP4-AS1可能作為一個(gè)保護(hù)性因素在PTC 中發(fā)揮作用。甲狀腺癌中FoxP4-AS1 的功能富集分析顯示，PI3KAkt-mTOR 通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)相互作用在FoxP4-AS1 低表達(dá)組中被富集，與細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。提示FoxP4-AS1 通過細(xì)胞周期發(fā)揮作用。

綜上所述，F(xiàn)oxP4-AS1 在PTC 中發(fā)揮抑癌基因作用，過表達(dá)FoxP4-AS1 后，CDK4/cyclinD1 表達(dá)減少，抑癌作用增強(qiáng)，F(xiàn)oxP4-AS1 在PTC 中可能通過負(fù)向調(diào)控CDK4/cyclinD1 的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用，且具有一定的抑制PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的能力，有望成為PTC 治療的潛在臨床靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。