岳 敏，趙 威，王 濤，李明杰，王冰冰，韓 甜，齊永華*，劉興友*

(1.河南科技學院動物科技學院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)學院生物與醫(yī)藥現代產業(yè)學院，河南新鄉(xiāng) 453003)

鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)中的yibT是一種未鑒定功能的蛋白，目前鮮有報道。Fukuyama Y等[1]發(fā)現yibT是一類血清型生物標志物，與外膜脂多糖的O抗原存在聯(lián)系。司海明等[2]研究指出大腸埃希氏菌中yibT基因的缺失會提高其菌體的正丁醇耐受性，其表型來自于yibT基因調控外膜的脂肪酸構成。Ormsby M J等[3]也證實了經抗菌劑丙酸處理過的大腸埃希氏菌的yibT基因的轉錄組水平表達顯著上調。

群體感應信號誘導劑通過運動調節(jié)因子mspR刺激大腸埃希氏菌生物膜的形成，該調節(jié)因子誘導yncC/mcbR介導的假定轉錄因子的表達。yncC基因抑制周質蛋白ybiM基因的表達，從而防止了莢膜異多糖酸的過量生產，并阻止ybiM抑制生物膜的形成[4]。ycfR/BhsA通過應力反應元件和表面疏水性影響大腸埃希氏菌生物膜的形成。ycfR基因的缺失使大腸埃希氏菌的生物膜形成能力提高5倍以上，ycfR基因的缺失導致生物膜形成能力增強的原因似乎是吲哚合成減少而引起的，ycfR通過減少細胞聚集和細胞表面黏附，影響信號分子的濃度以及干擾應激反應來參與大腸埃希氏菌K-12生物膜的形成[5]，且ycfR似乎是一種多重抗逆性蛋白，敲除ycfR基因使菌體細胞對酸處理、熱處理，過氧化氫壓力和鎘更加敏感。bcsC是一類纖維素酶操縱基因，參與介導細菌生物膜的形成及細胞凝集作用[6]。利用SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)查詢其同源建模報告可知，glgS基因與yibT基因具有同源性，但glgS是一類糖原合成蛋白，主要參與調節(jié)細菌運動性、黏附性以及生物膜的形成[7]。課題組前期研究發(fā)現[8]，yibT蛋白可能參與調控沙門氏菌的生物膜形成，并在膜依賴的抗菌藥物遞送體系構建和表征過程中發(fā)揮重要作用，十分有必要探索和闡明其在沙門氏菌生成過程中的生物學作用和分子調控機制，為找尋新的藥物作用靶點奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌菌株和培養(yǎng)條件 鼠傷寒沙門氏菌CVCC541是一種從雞體內分離的野生型臨床菌株(wild type，WT)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察研究所提供，文中統(tǒng)一命名為WT；鼠傷寒沙門氏菌yibT基因敲除株命名為WTΔyibT；WT的yibT過表達菌株命名為WT/pyibT；WTΔyibT的回補株命名為WTΔyibT/pyibT，培養(yǎng)條件為37 ℃、180 r/min，培養(yǎng)16 h～24 h。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產品，其他相關試劑均為國產分析純，北京索萊寶科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 立式高壓蒸汽滅菌器(HC014-11-018-01)、低溫高速離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產品；電子分析天平(FA1004)，奧豪斯貿易(上海)有限公司產品；熒光定量PCR儀(Quant Studio Q6)，美國ABI生物公司產品。

1.1.4 引物設計 試驗相關基因引物采用Primer premier 6.0進行設計，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列詳見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

1.2 方法

1.2.1 菌體總RNA提取 取沙門氏菌的過夜培養(yǎng)物，以1 200 r/min離心2 min，棄掉培養(yǎng)基。漩渦振蕩使EP管中的菌體松散，加入100 μL新鮮制備的裂解溶液到1.5 mL EP管中，振蕩混勻。將振蕩混勻的細菌置于室溫放置約5 min，加入350 μL RNA裂解液至樣品中震蕩混勻，以12 000 r/min離心2 min。將上清液移至新的EP管中。加入250 μL的無水乙醇至細菌裂解液中，振蕩混勻。RNA過濾柱放入2 mL收集管中，將上述裂解液轉移至RNA過濾柱中，離心2 min，棄掉廢液。將RNA過濾柱放回原來的收集管中，加入500 μL RNA洗脫溶液，離心1 min，丟棄溶液。將新鮮配制的82 μL 脫氧核糖核酸酶Ⅰ溶液加至RNA過濾柱中心，置于室溫反應15 min。加入500 μL RNA洗脫溶液到RNA過濾柱中，1 200 r/min離心1 min，丟棄溶液。將RNA過濾柱重新放回收集管中，加入600 μL RNA Ⅱ號洗脫液，1 200 r/min離心1 min，丟棄溶液，重復1次。將RNA過濾柱放回收集管，以1 200 r/min離心3 min，置于超凈臺10 min以達到完全揮發(fā)殘存乙醇。將RNA過濾柱置入新的1.5 mL離心管，加入30 μL超純水到RNA過濾柱濾膜的正中心，室溫靜置2 min，以1 200 r/min離心1 min回收RNA，樣品存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA第一鏈的合成 以RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈：取5.0 μL RNA，加入4.0 μL 5 × Prime Script RT Master Mix、11 μL滅菌純水。反轉錄程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 10 s，反轉錄合成的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實時熒光定量PCR 取反轉錄后的2 μL cDNA為模板，10 μL 2 × TB Green Premix EXTaqⅡ，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ，0.8 μL 上游引物和下游引物(引物序列見表1)，6 μL滅菌純水，進行熒光定量PCR反應。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)；熔解曲線階段：60 ℃ 15 s，95 ℃ 1 s。

1.2.4YibT對ABC轉運系統(tǒng)的影響 細菌細胞外膜的主要組成成分為脂多糖LPS，以lptA-G為主的Lpt轉運系統(tǒng)從內膜轉運脂多糖至細菌外膜。為了進一步研究yibT與脂多糖轉運是否存在聯(lián)系，分別提取了WT、WTΔyibT、WTΔyibT/pyibT的RNA并進行反轉錄， RT-qPCR以檢測WT、WTΔyibT、WTΔyibT/pyibT中的Lpt轉運蛋白的mRNA表達水平(引物序列詳見表1)。RT-qPCR使用SYBR○RPremix ExTaqⅡ進行檢測，使用ΔΔCt法確定相關基因的表達水平。

1.2.5 鼠傷寒沙門氏菌生物膜形成調控因子的轉錄組水平檢測 課題組前期研究發(fā)現[8]，yibT基因的缺失會導致細菌運動性增強，生物膜形成能力減弱。csgD為鼠傷寒沙門氏菌生物膜形成的中央調控因子，并且csgD和它的啟動子rpoS均負向調控細菌的運動性。故利用RT-qPCR技術檢測WT、WTΔyibT、WTΔyibT/pyibT中的csgD、rpoS的mRNA表達水平，探討yibT在轉錄組層面是否影響csgD的表達。

1.2.6YibT基因調控通路分析 為了進一步確證yibT的分子調控路徑，筆者借助STITCH蛋白互作網絡工具獲得了yibT基因的相互作用網絡圖。使用信息源的默認設置和默認置信度(中等，0.4)；兩個基因或蛋白質之間存在預測鏈接的可能性，從而形成一個包含輸入基因和可與其極關聯(lián)的其他基因的互作模擬網絡[9]。使用STITCH分析了yibT可能涉及到的基因調控通路，并利用RT-qPCR技術檢測分析了相關重要基因的mRNA表達水平。

2 結果

2.1 YibT對lptA-G脂多糖轉運系統(tǒng)mRNA表達水平的影響

脂多糖由膜內轉運至膜外需要Lpt轉運系統(tǒng)的參與，該系統(tǒng)是由細胞內的7種蛋白lptA-G組成。本研究采用RT-qPCR測定了WT、WTΔyibT、WTΔyibT/pyibT不同菌株中的lptA-G的mRNA表達水平(圖1)，當yibT基因敲除后，沙門氏菌中l(wèi)ptA-G的mRNA表達水平全部下調，其中的lptB下調最為顯著，揭示了yibT可能參與了Lpt轉運系統(tǒng)的調控過程。

圖1 轉運蛋白lptA-G的mRNA表達水平

2.2 YibT對csgD和rpoS的mRNA表達水平的影響

鼠傷寒沙門氏菌的生物膜形成主要受csgD的調控，該蛋白屬于luxR家族，csgD受到σ因子rpoS的調控，并且csgD還參與多個調控路徑。由圖2可知，yibT的缺失會導致csgD和rpoS的mRNA表達水平下調；當yibT被過表達后，csgD和rpoS的mRNA表達水平明顯上調，說明yibT與csgD在轉錄組水平的關系密切，相互間存在直接的調控關系。

圖2 不同菌株中CsgD、rpoS的mRNA表達水平

2.3 YibT基因互作關系預測分析

如圖3A所示，基于STITCH數據庫預測發(fā)現，yibT參與很多基因的調控路徑。yahO是關聯(lián)基因群的中心點，yibT處于其中并與yahO調控關系密切。在yahO的基因簇中，黑色圓圈標記的基因yncC/msbR、yjfY、bcsC、ycfR/bhsA、yjfO、yccJ都是與生物膜形成相關的基因，黑色的虛線框標明與yahO基因簇相鄰的wzzO抗原合成基因簇和Bcs纖維素操縱子家族。本研究選取了yahO、ydgH、wzzE作為檢測靶標，進行了mRNA表達水平測定。由圖4可知，與對照組相比，WTΔyibT菌體內的yahO、ydgH、wzzE基因表達水平顯著下調，如此表明，yibT參與了相鄰基因表達的調控。為了探討yibT與csgD的機制，同樣使用STITCH預測研究yibT與csgD的基因互作關系。如圖3B所示，實心圈為已被證實的調控路徑，虛線圈中的是未被驗證的通路。RpoS參與csgD和agfA表達的調控，而Hnr和uspB是rpoS的啟動子，YecF與未知功能蛋白yibT存在相互調控關系。由圖4可知，當敲除掉沙門氏菌中yibT基因后，導致yecF和uspB的mRNA表達水平均不同程度的下降，由此證明yibT可能處于yecF和uspB的上游，并參與上述蛋白表達的調控。

圖3 STITCH網絡分析的yibT基因互作圖

圖4 yibT關聯(lián)基因的mRNA表達水平

3 討論

在鼠傷寒沙門氏菌中，yibT是一個未知功能蛋白，本研究前期證實yibT可能參與鼠傷寒沙門氏菌外膜形成的調控，而細菌外膜的主要成分是脂多糖，脂多糖合成和轉運過程中會影響沙門氏菌生物膜的形成[10-11]。本研究證實當沙門氏菌中的yibT基因被缺失后，lptA-G的轉錄表達水平均呈現不同程度的下調(P<0.05)，其中l(wèi)ptB下調最為明顯(P<0.01)。Botos等研究發(fā)現由細胞質蛋白lptB為主，多個lptE、lptF為輔構成了為Lpt轉運系統(tǒng)提供動力的ABC轉運蛋白，其利用水解ATP功能為整個Lpt系統(tǒng)提供能量，其中l(wèi)ptB為轉運系統(tǒng)的分子馬達[12]。由此說明，yibT可能參與調節(jié)Lpt轉運過程，yibT基因的缺失會導致脂多糖LPS的轉運能力下降。yahO與ydgH是具有相同的DUF1471結構域的未知功能基因，而DUF1471結構域涉及到生物膜的形成以及應激反應。Eletsky A等[13]研究了沙門氏菌蛋白yahO的DUF1471結構域的功能，發(fā)現yahO基因與ycfR/BhsA、ybiM/McbA、yjfO/BsmA或ycfR關系密切，且與應激反應和生物膜形成有關。Nakamura A等[14]研究表明yahO和yjbJ的特定氨基酸被替換后直接影響生物膜的形成。鼠傷寒沙門氏菌LT2中的yahO與ydgO具有互作關系，與yahO基因有關聯(lián)的基因簇(yifY、yncC/msbR、yccJ、ycfR/bhsA、yjfO、bcsC)也均與生物膜的形成有關，而yibT也在其基因簇中，由此推測yibT會調節(jié)沙門氏菌的生物膜形成。實時熒光定量PCR結果證實，yibT缺失后沙門氏菌的ydgH、yahO的mRNA表達水平均出現不同程度下調現象(P<0.05)，提示yibT極有可能也具有DUF1471結構域并且與菌體生物膜的形成有關。WzzE為O抗原調節(jié)蛋白，調節(jié)O抗原糖鏈的長度，核心寡糖和O抗原會增加菌體細胞膜的親水性。有研究表明，在大腸埃希氏菌中，脂多糖和O抗原是介導細菌與無機表面結合的關鍵組分[15]。Djordjevic D等[16]研究發(fā)現，yibT可以作為特異性的血清型生物標記，與O抗原關系密切。因此我們推測，WTΔyibT疏水性的增強很有可能與O抗原和核心寡糖的合成減少而導致菌體表面親水性基團喪失有關。此外，研究表明yibT基因的缺失也導致鼠傷寒沙門氏菌擁有了更強的外環(huán)境耐受力。由此可知，yibT通過影響LPS的轉運能力，改變菌體細胞膜結構特征而發(fā)揮其生物學功能。

相關研究表明[17]，csgD是一個參與調控菌體生物膜形成的全局調節(jié)因子。如圖2所示，WT、WTΔyibT、WTΔyibT/pyibT以及WT/pyibT的csgD及其啟動子rpoS的mRNA表達水平的變化可初步證實yibT通過影響csgD或其啟動子σ因子rpoS來調控鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成能力。進一步的基因互作分析結果也表明，rpoS的啟動子uspB以及與其相鄰的未知基因yecF的表達水平均不同程度的下調(P<0.05)。綜上所述，本研究初步證實，未表征功能蛋白yibT通過調控脂多糖的合成與轉運來影響鼠傷寒沙門氏菌的細胞外膜結構與功能，通過介導全局調控因子csgD的表達以調控鼠傷寒沙門氏菌生物膜的形成，結合yibT的生物學特性，我們推測，yibT極可能是一種全局轉錄調控因子或具有DNA聚合酶的特性，介導菌體DNA的復制過程，參與鼠傷寒沙門氏菌的多種生物學過程的調控。本研究認為yibT可能是一個抗菌藥物作用的新靶點，將為新型抗菌藥物的開發(fā)提供一條新思路。