杜炎斌，袁麗英，東 笑，王貴平，3，賈愛(ài)卿，3*

(1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東廣州 511400；2.廣東省養(yǎng)豬與豬病防控技術(shù)研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511400；3.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣東廣州 511400)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是豬場(chǎng)常見(jiàn)的革蘭氏陰性桿菌，HPS在世界范圍內(nèi)分布廣泛，包括美國(guó)、德國(guó)、西班牙、日本等國(guó)家均有報(bào)道，該病原具有15個(gè)血清型，包括部分未確定血清型菌株，其中我國(guó)流行的主要血清型為4型、5型和13型[1-4]。HPS可通過(guò)直接接觸、間接接觸及污染物傳播。臨床中仔豬常見(jiàn)HPS與豬鏈球菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌等混合感染病例，或豬感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型等免疫抑制性疾病后繼發(fā)。此外，HPS病的暴發(fā)可由很多原因引起，常見(jiàn)的有接種疫苗、長(zhǎng)途運(yùn)輸、轉(zhuǎn)群、天氣驟變、通風(fēng)不良等均可引其仔豬應(yīng)激，導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低，從而引起發(fā)病[5]。發(fā)病仔豬常出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、關(guān)節(jié)腫大，剖檢多見(jiàn)關(guān)節(jié)、胸腔、腹腔有纖維素性滲出物，病死率達(dá)30%～50%[6-7]。

2020年12月廣東省英德市某豬場(chǎng)部分仔豬出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫大等癥狀，送檢部分病料進(jìn)行病原檢測(cè)。初步判斷其臨床癥狀與副豬嗜血桿菌感染病例較符合。本試驗(yàn)對(duì)該規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)病豬進(jìn)行病毒抗原檢測(cè)、病原菌分離，結(jié)合PCR鑒定及藥敏試驗(yàn)等，為該規(guī)模化豬場(chǎng)科學(xué)防控副豬嗜血桿菌病提供科學(xué)指導(dǎo)，提高經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 英德市某規(guī)?；i場(chǎng)關(guān)節(jié)腫大并伴有明顯呼吸困難的2頭37日齡仔豬。

1.1.2 試劑 胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、輔酶Ⅰ、新生牛血清、結(jié)晶紫草酸鹽溶液、碘液、950 mL/L乙醇脫色液、沙黃復(fù)染液、滅菌生理鹽水、DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；藥敏試紙，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；金黃色葡萄球菌，廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司保存。

1.1.3 儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱，上海篤特科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；C1000PCR儀、電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)，上海天能公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡，重慶奧特光學(xué)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物序列 HPS 16S rRNA引物序列，豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circo virus type 2，PCV2)引物、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)美洲型、歐洲型通用鑒定引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 檢測(cè)引物序列

1.2 方法

1.2.1 病豬剖檢觀察 病死仔豬剖檢，剖檢過(guò)程中記錄特征性病理變化，采集病料。

1.2.2 核酸提取及病毒PCR鑒定 按照病毒DNA/RNA共提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，將仔豬肺臟研磨處理，提取肺臟與血液樣品中病毒核酸，部分核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型PCR鑒定；豬繁殖與呼吸綜合征病毒擴(kuò)增預(yù)期目的片段大小為658 bp，豬圓環(huán)病毒2型擴(kuò)增預(yù)期目的片段大小為352 bp。

1.2.3 細(xì)菌的分離純化 無(wú)菌分別取病豬的肺臟、關(guān)節(jié)液、心包液于胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基(trypticase soy agar，TSA)平板上進(jìn)行劃線接種。組織表面酒精消毒后，形成創(chuàng)面，滅菌棉簽蘸取組織液涂布平板，培養(yǎng)基為含50 mL/L血清、0.1 mg/mL NAD的TSA培養(yǎng)基，完成后置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h；觀察菌落生長(zhǎng)情況，挑取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)；菌落接種于含50 mL/L血清、0.1 mg/mL NAD的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(trypticase soy broth，TSB)中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)12 h，菌液進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。

1.2.4 分離菌株衛(wèi)星試驗(yàn)及生化鑒定 于含50 mL/L血清、不含NAD的TSA平板上，沿豎直方向劃線培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，另取該分離菌株沿金黃色葡萄球菌劃線的垂直方向劃線，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察是否出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。

將分離純化得到的菌株按說(shuō)明書(shū)要求，分別接種于含NAD的各生化鑒定管中，包括葡萄糖、氧化酶、硝酸還原酶、接觸酶、脲酶、果糖、甘露醇和吲哚等生化鑒定管，對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.5 PCR鑒定及測(cè)序 按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行細(xì)菌核酸提取，使用HPS 16S rRNA基因擴(kuò)增引物，預(yù)期目的條帶大小為822 bp。PCR鑒定反應(yīng)體系為20 μL，包括TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法(Kirby-Bauer disc agar diffusion method，K-B法)，選擇生產(chǎn)中常用的恩諾沙星、強(qiáng)力霉素、多黏菌素等作為試驗(yàn)藥物。取轉(zhuǎn)接培養(yǎng)5 h～6 h的菌液100 μL，使用一次性涂布棒，均勻涂布于含有50 mL/L血清、0.1 mg/mL NAD的TSA平板上，再用無(wú)菌鑷子將各藥敏試紙片均勻貼附于TSA平板，輕柔按壓，防止藥敏紙片脫落，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h～24 h，測(cè)量并記錄各藥敏紙片對(duì)應(yīng)抑菌圈大??；參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦的判定方法，根據(jù)抑菌圈的直徑(Φ)大小判定其藥物敏感性，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)分別為：Φ≥20 mm 為敏感(S)，15 mm≤Φ<20 mm 為中介耐藥(I)，Φ<15 mm為耐藥(R)。

2 結(jié)果

2.1 剖檢結(jié)果

豬場(chǎng)反饋發(fā)病豬群表現(xiàn)為采食減少、咳嗽、呼吸困難，個(gè)別豬關(guān)節(jié)腫大。實(shí)驗(yàn)室剖檢可見(jiàn)仔豬肺部有大量纖維性滲出物，肺間質(zhì)充血明顯，心包粘連；前后肢關(guān)節(jié)肉眼可見(jiàn)明顯腫大，按壓有波動(dòng)感，剖檢可見(jiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)有清亮液體滲出(圖1)。

A.體型消瘦，關(guān)節(jié)腫大；B.關(guān)節(jié)液滲出；C.肺部病變

2.2 PCV2及PRRSV病原PCR檢測(cè)結(jié)果

PCR電泳結(jié)果顯示，陰性陽(yáng)性對(duì)照均成立，各樣品均未成功擴(kuò)增到目的條帶，該病料PCV2及PRRSV檢測(cè)均為陰性。

2.3 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

無(wú)菌狀態(tài)下分離細(xì)菌于TSA平板(含50 mL/L血清、0.1 mg/mL NAD)，可見(jiàn)針尖大小的透明菌落，呈露珠狀；轉(zhuǎn)接菌液經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌(圖2)。

圖2 革蘭氏染色鏡檢(1 000×)

2.4 分離菌種衛(wèi)星試驗(yàn)及生化鑒定結(jié)果

觀察衛(wèi)星試驗(yàn)結(jié)果，該分離菌株距金黃色葡萄球菌較近時(shí)，生長(zhǎng)狀態(tài)較好，菌落較大；距金黃色葡萄球菌較遠(yuǎn)時(shí)，少見(jiàn)有菌落生長(zhǎng)(圖3)。

圖3 衛(wèi)星現(xiàn)象

分離菌株生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示該分離株為接觸酶、硝酸鹽還原酶陽(yáng)性，能夠分解葡萄糖、果糖；氧化酶、甘露醇、脲酶試驗(yàn)均為陰性，吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)(Methyl red，MR)及VP試驗(yàn)(Voges-Proskauer，VP)試驗(yàn)結(jié)果顯示為陰性；生化鑒定結(jié)果與HPS生化特性一致。

表2 分離菌株生化鑒定結(jié)果

2.5 細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果

使用培養(yǎng)的分離株菌液進(jìn)行HPS 16S引物擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增822 bp大小目的片段，條帶大小符合預(yù)期(圖4)；將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示分離株16S序列與HPS 16S基因同源性達(dá)99%以上，確定該分離株為HPS，將本次分離的HPS菌株命名為YD株。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.YD株

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)選取臨床常用的10種藥物對(duì)副豬嗜血桿菌YD株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，該分離菌株對(duì)恩諾沙星、多黏菌素、環(huán)丙沙星和強(qiáng)力霉素敏感，對(duì)頭孢氨芐和大觀霉素耐藥(表3)。

表3 分離YD株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；l(fā)展不斷加快，細(xì)菌性傳染病也出現(xiàn)群體性多發(fā)趨勢(shì)。HPS嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。規(guī)?；i場(chǎng)多以混合感染病例出現(xiàn)，這給HPS的分離鑒定造成一定困難[8-9]。臨床中防控副豬嗜血桿菌病主要通過(guò)接種疫苗和使用藥物。然而，由于抗菌藥物大量使用，有關(guān)HPS耐藥性的報(bào)道逐漸增多[10]。研究表明，菌株對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，通常是革蘭氏陰性菌中的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或結(jié)合子介導(dǎo)的抗性基因(antibiotic resistance gene，ARG)轉(zhuǎn)移的結(jié)果，而養(yǎng)豬業(yè)長(zhǎng)期大量使用抗菌藥物則對(duì)菌株產(chǎn)生巨大的選擇壓力，一定程度上加劇了抗性基因在菌株間的水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致菌株耐藥[11-12]。Zhang B等[13]于2012年-2017年從我國(guó)16個(gè)主要養(yǎng)豬省9 661個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)的44 175份樣品中分離得到約1 900余株HPS，其藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，HPS對(duì)常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、林可霉素、四環(huán)素、喹諾酮類(lèi)、多黏菌素和磺胺類(lèi)藥物耐藥性呈逐步增加態(tài)勢(shì)。這要求我們?cè)谂R床中使用藥物應(yīng)更具針對(duì)性，選擇敏感藥物治療。

考慮該場(chǎng)豬群臨床癥狀、仔豬剖檢及病毒檢測(cè)情況，初步懷疑引起豬場(chǎng)發(fā)病病因?yàn)榧?xì)菌感染。對(duì)豬場(chǎng)送檢病料，進(jìn)行細(xì)菌分離、生化鑒定、藥敏試驗(yàn)情況綜合分析，最終鑒定為HPS感染。根據(jù)豬場(chǎng)需要，公司技術(shù)服務(wù)人員前往豬場(chǎng)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)該豬場(chǎng)仍有個(gè)別豬存在精神沉郁，關(guān)節(jié)腫大、臥地不起現(xiàn)象。當(dāng)時(shí)豬價(jià)處于高位，該豬場(chǎng)飼養(yǎng)密度較大，通風(fēng)不良，一定程度亦促進(jìn)病原滋生，另一方面12月天氣寒冷，保育舍內(nèi)溫度較低，這可能成為引起體弱動(dòng)物副豬嗜血桿菌病暴發(fā)的誘因。本研究中，該規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)分離HPS YD株對(duì)環(huán)丙沙星及恩諾沙星等藥物敏感性高，對(duì)頭孢氨芐、頭孢噻吩耐藥，提示該規(guī)模豬場(chǎng)可使用喹諾酮類(lèi)藥物進(jìn)行副豬嗜血桿菌病防控。技術(shù)人員建議該豬場(chǎng)將發(fā)病豬進(jìn)行隔離治療，采用100 mg/mL恩諾沙星注射液同時(shí)配合使用地塞米松，連用3 d；其余仔豬采用100 g/kg恩諾沙星拌料投喂，藥物與飼料添加重量比為1∶1 000，連用5 d。此外，應(yīng)進(jìn)行圈舍全面消毒，加強(qiáng)保溫，降低養(yǎng)殖密度。后續(xù)防控整體建議包括以下三個(gè)方面。①飼養(yǎng)管理方面：引種應(yīng)隔離飼喂1個(gè)月后再混群；使用優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)豐富的全價(jià)飼料，并定期進(jìn)行水質(zhì)監(jiān)測(cè)；保證通風(fēng)，降低飼養(yǎng)密度；建立良好的保溫控溫設(shè)施。②生物安全方面：嚴(yán)格執(zhí)行全進(jìn)全出制；定期消毒，特別是當(dāng)豬群轉(zhuǎn)舍或出欄后應(yīng)對(duì)豬舍進(jìn)行全面消毒。③疫苗免疫：采用副豬嗜血桿菌滅活疫苗進(jìn)行免疫接種，并對(duì)不同生長(zhǎng)階段豬只制定針對(duì)性免疫方案。后續(xù)經(jīng)技術(shù)人員回訪，該豬場(chǎng)疫病發(fā)生情況顯著減少，經(jīng)濟(jì)效益明顯改善。