曲 夢，江艷華，桂彬彬，3，教 楊，3，王聯(lián)珠，崔正國，譚志軍，2，3，姚 琳

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東 青島 266071；3.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034)

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(RAS)是一種提高水產(chǎn)品品質(zhì)、高效利用水資源的養(yǎng)殖方式，具有環(huán)境可控、節(jié)水、高效、環(huán)保和安全等優(yōu)點。解析RAS中的微生物種群結(jié)構(gòu)，對于保持RAS 內(nèi)部的生態(tài)平衡、避免使用藥物、確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全具有現(xiàn)實意義。本研究運用16S rDNA 高通量測序技術(shù)，研究RAS的水體與魚體中微生物種群結(jié)構(gòu)，確定循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的微生物群落特征，比較水體與魚體之間、不同魚種之間微生物群落結(jié)構(gòu)，揭示循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)部微生物群落的多樣性特征，為構(gòu)建健康養(yǎng)殖系統(tǒng)、進一步提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

1.主要試劑

采用MagPure Soil DNA KF Kit試劑盒、 Qubit dsDNA Assay Kit、Tks Gflex DNA Polymerase、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、Biowest Agarose(瓊脂糖)，引物由青島歐易生物科技有限公司合成。

2.樣品及預(yù)處理

牙鲆、石斑魚的成魚與水樣分別采集于山東省海陽市某養(yǎng)殖公司的石斑魚與牙鲆RAS 養(yǎng)殖系統(tǒng)，用無菌采樣瓶采集養(yǎng)殖水體500毫升，樣品采集后低溫帶回實驗室，用0.22 微米濾膜抽濾后，將濾膜凍存于-80℃條件下。成魚停食24小時，置于無菌操作臺上進行取樣，魚表皮組織黏液樣品通過無菌細胞刮刀輕輕地刮擦背外側(cè)收集；使用75%酒精棉擦拭魚體表面后用蒸餾水漂洗，對肌肉、腸道、肝臟、心臟、膽、胃等組織進行無菌取樣，分為牙鲆組(組1)、石斑魚組(組2)，置于滅菌的EP 管中；每個樣品取兩個平行， 于-80℃保存，用于提取基因組DNA。

3.細菌基因組DNA提取和PCR擴增

用試劑盒提取樣本的基因組DNA，檢測基因組DNA 含量和純度。采用引物343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3')和798R(5'-AGGGTATCTAATCCT-3')擴增細菌16S rDNA 基因V3～V4 區(qū)。PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 分鐘；94℃變性30 秒，56℃退火30 秒，72℃延 伸20 秒，26 個 循 環(huán)；72℃延 伸5分鐘。

4.樣本的16S rDNA檢測和高通量測序

樣品的16S rDNA 高通量測序由青島歐易生物科技有限公司在Illumina-MiSeq 平臺上完成，使用Trimmomati 軟件對原始雙端序列去雜，采用Vsearch 軟件，將得到的有效序列按照97%的相似性進行操作分類單元(OTUs)聚類。使用QIIME軟件包挑選出各個OTUs 的代表序列，并與Silva(version132)數(shù)據(jù)庫進行相似性比對，將所有代表序列進行注釋。

5.生物信息學(xué)分析

對分類的OTUs 進行物種注釋分析，得到相對應(yīng)的物種信息，根據(jù)物種注釋結(jié)果，在門、綱、目、科、屬5 個分類級別上生成物種相對豐度圖，根據(jù)分類學(xué)層次分析微生物的群落結(jié)構(gòu)以及物種豐度。應(yīng)用QIIME軟件進行物種豐度分析，主要包括：①多樣性指數(shù)分析；②計算物種豐富度指數(shù)、覆蓋率等。分析各指數(shù)間的差異是反映微生物豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。

二、結(jié)果與分析

1.測序結(jié)果及取樣深度驗證

提取兩組樣品DNA，測定質(zhì)量濃度與純度，用于分析循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)魚體與水體的細菌多樣性，采用目的條帶大小正確、濃度適合的PCR擴增產(chǎn)物測序。兩組樣品共得到1 990 143 條有效序列，不同的組織樣本得到有效序列范圍為16 775～55 773條，各樣本操作分類單元個數(shù)分布在798～1 724 條。對樣品有效序列進行OTUs 稀釋曲線分析，結(jié)果表明各樣品的曲線均隨序列數(shù)量的增加而趨于平緩，測序數(shù)據(jù)量合理，對細菌16S rDNA V3～V4區(qū)的PCR擴增序列能真實反映樣品細菌的群落組成。

2.微生物的系統(tǒng)進化樹分析

對OTUs 的豐度進行統(tǒng)計分析，選擇兩組樣品中豐度最高的50個OTUs構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以熱圖形式分析OTUs 在不同樣品中的分布情況。經(jīng)統(tǒng)計，50條reads共歸于5個門，兩組樣品的高豐度OTUs 一致，主要為擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、梭桿菌門。

3.微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)注釋結(jié)果，兩組樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成情況相似，共鑒定出30 個菌門、73 個綱、179個目、310個科、732個屬。但各種微生物所占比例略有差異，在門水平上，擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、梭桿菌門、芽單胞菌門、酸桿菌門、ε-變形菌門、軟壁菌門、螺旋體門、硝化螺旋菌門、迷蹤菌門、疣微菌門、藍光合菌門及Patescibacteria占細菌總量的98.12%以上。15 個優(yōu)勢菌門的菌群結(jié)構(gòu)差異顯示，兩組樣品養(yǎng)殖水體以及各組織中的優(yōu)勢細菌在門水平上差異不顯著，占比較高的優(yōu)勢菌門主要為擬桿菌門、變形菌門與厚壁菌門，占細菌總量的85%以上，與黃志濤等(2016)報道的結(jié)果相似。

在綱的水平上，優(yōu)勢菌綱從高至低為擬桿菌綱、梭菌綱與變形菌綱，占比達87%以上；在目的水平上，擬桿菌目、梭菌目與腸桿菌目占比較其余13個目之和更高，約為75%；在科的水平上，前4個優(yōu)勢菌科分別為擬桿菌科、腸桿菌科、疣微菌科與毛螺菌科；在屬的水平上，樣品中細菌豐度最高的分別為擬桿菌屬(Bacteroides)、大腸志賀氏桿菌屬(Escherichia-Shigella)、棲糞桿菌屬(Faecalibacterium)與其他菌屬。結(jié)果表明，兩組的養(yǎng)殖水體與魚體組織中細菌群落的構(gòu)成比較單一，在5個分類水平上都是少數(shù)類群占據(jù)絕對的優(yōu)勢地位，其余大部分類群占很小的比例。

4.微生物多樣性分析

(1)樣品Alpha 多樣性分析。將所有樣本進行聚類分析，根據(jù)序列之間的相似性將其劃分為不同的OTUs。結(jié)果顯示牙鲆與石斑魚樣品共有的OTUs為3 445個。

Alpha多樣性分析是指對樣品中微生物群落物種的多樣性進行分析，主要包括分析微生物群落豐富度的ACE指數(shù)以及微生物群落均勻度與多樣性的辛普森指數(shù)及香農(nóng)指數(shù)(耿道強等，2020)。樣品多樣性情況見表1。由表1 可知，兩組樣品的群落多樣性和豐度上無顯著性差異，相對于牙鲆，石斑魚微生物群落多樣性和豐度水平更高。

表1 樣品多樣性情況

(2)樣品Beta多樣性分析。Beta多樣性為生物環(huán)境內(nèi)物種的多樣性程度，即比較不同分組樣本的差異。Beta多樣性分析主要包括PCA、PCoA分析等。每個點代表牙鲆與石斑魚養(yǎng)殖水體與各組織樣品，彼此之間的距離代表了它們的差異大小。如在Beta多樣性研究中，PCA分析運用方差分解進行，樣品組成越相似，則距離越近。結(jié)果顯示，兩種魚養(yǎng)殖水體與器官組織在PC1與PC2軸上差異并不明顯，兩組樣品的相似度較高，與Alpha多樣性分析結(jié)果相互印證。PCoA 是基于多種距離矩陣的分析結(jié)果，通過觀察物種個體或種群間的差異可直觀顯示不同樣品中微生物進化上的相似性或差異性。結(jié)果顯示，同組的樣本距離較近，并與其他組有距離，兩組樣品之間在PC2軸上可以分離開。菌群Beta 多樣性中各樣本的特征貢獻值分析發(fā)現(xiàn)，相較于牙鲆，石斑魚的菌群多樣性占比相對較高，為菌群多樣性的主要貢獻者。

三、討論

循環(huán)水養(yǎng)殖是一種現(xiàn)代化的高密度精養(yǎng)模式，目前廣泛應(yīng)用于鲆鰈類和石斑魚等市場價格較高的海水魚養(yǎng)殖。循環(huán)水養(yǎng)殖水體中微生物對魚的生長、健康至關(guān)重要，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化也是標(biāo)志養(yǎng)殖環(huán)境變化的一個重要方面(KLMARI S等，2019；SEKIROV I等，2010)。當(dāng)受到病原微生物感染時，菌群結(jié)構(gòu)失衡可能使得宿主的免疫系統(tǒng)受到影響，導(dǎo)致細菌性疾病暴發(fā)，因此，可以通過對循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測來研究該系統(tǒng)中微生物與宿主之間的相互關(guān)系，為水產(chǎn)品健康養(yǎng)殖、減少因違規(guī)用藥引發(fā)的水產(chǎn)業(yè)質(zhì)量安全問題提供科學(xué)依據(jù)。本研究利用16S rDNA 高通量測序技術(shù)對牙鲆與石斑魚的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中水體細菌種群結(jié)構(gòu)特征進行研究，結(jié)果顯示二者的菌落結(jié)構(gòu)和多樣性基本一致，無明顯差異，這可能與他們的養(yǎng)殖水體、飼料、生活習(xí)性等因素相關(guān)。

梭桿菌綱是一類革蘭氏陰性細菌，部分具有一定的致病性。變形菌門是海洋環(huán)境和海洋沉積物中的主要菌門，其中的α-變形菌綱、β-變形菌綱可以降解水體中的多環(huán)芳烴(吳越等，2017)；γ-變形菌綱是目前已知細菌種類最多的綱(吳歡歡等，2019)，豐度與養(yǎng)殖水體營養(yǎng)程度正相關(guān)，豐度越高，越有利于養(yǎng)殖動物的健康生長。大腸志賀氏桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，會引起魚體肛門及內(nèi)臟充血、出血，同時檢出的具有致病性的弧菌屬細菌，多數(shù)為條件致病菌或與魚病有關(guān)的病原菌，能夠引發(fā)魚的皮膚潰瘍、出血等癥狀(Zhang等，2020)；在養(yǎng)殖過程中，魚受到致病菌感染，易導(dǎo)致潛在弧菌病的暴發(fā)。因此，采取有效措施控制養(yǎng)殖環(huán)境中致病菌的數(shù)量對于水產(chǎn)動物的健康至關(guān)重要。

相較于牙鲆，石斑魚組的香農(nóng)指數(shù)更高，這表明石斑魚組的16S rDNA 多樣性較高。聚類分析結(jié)果表明，牙鲆與石斑魚的水體菌群組成和群落結(jié)構(gòu)相似性較高。養(yǎng)殖模式相同的情況下， 樣品基本聚在一起，說明在相同養(yǎng)殖模式下，菌群組成和群落結(jié)構(gòu)具有較高的相似性(吳歡歡等，2019)。

四、小結(jié)

本研究利用16S rDNA 高通量測序技術(shù)對牙鲆與石斑魚及其養(yǎng)殖水體的微生物多樣性進行了研究。結(jié)果顯示，水體環(huán)境中的微生物參與魚體菌群的形成，并且在水體環(huán)境相似的情況下，不同品種的魚菌群結(jié)構(gòu)并無較大差異。因此，在RAS系統(tǒng)養(yǎng)殖過程中，可采取同樣管控方式，如加強養(yǎng)殖水體中微生物監(jiān)控來確保RAS系統(tǒng)中微生物的生態(tài)平衡，以實現(xiàn)健康養(yǎng)殖，杜絕水產(chǎn)品質(zhì)量安全事件的發(fā)生。