楊惠源，陳泓霖，李瑞雪，楊志會，吳穎瑞，吳信忠，蔡小輝

( 1.北部灣大學 海洋學院，廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室，廣西 欽州 536011；2.廣西大學 生命科學與技術(shù)學院，廣西 南寧 530004； 3.邢臺市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邢臺 054000 )

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)，又稱非洲鯽魚，屬鱸形目、麗魚科、羅非魚屬。尼羅羅非魚因繁殖迅速、生長快、肉質(zhì)細嫩、蛋白質(zhì)含量豐富、適應性強、經(jīng)濟效益高等優(yōu)點，深受漁業(yè)養(yǎng)殖戶的青睞。近年來，我國海南、廣東和廣西等南方地區(qū)的羅非魚無乳鏈球菌病情況嚴重，發(fā)病死亡率高達95%[1-3]，不僅對羅非魚的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴重打擊，同時也讓羅非魚一直以來具有抗病力強、不易患病的觀點遭到質(zhì)疑。有研究報道，鏈球菌病暴發(fā)時間段主要為每年的3—11月，其中5月和9月為發(fā)病高峰期，影響發(fā)病的因素主要有環(huán)境因素和生物因素，其中環(huán)境因素表現(xiàn)為養(yǎng)殖區(qū)域周圍的環(huán)境問題和水質(zhì)污染問題等，其傳播途徑為魚體間接觸傳播和水體以及飼料間接傳播[4-5]。

無乳鏈球菌 (Streptococcusagalatiae) 又稱B族溶血性鏈球菌(GBS)，外層由莢膜包被著，無乳鏈球菌可通過莢膜的相變來逃避宿主免疫[6]。研究證實，無乳鏈球菌可通過胃腸道上皮侵入羅非魚體內(nèi)從而引起各種病狀[7]。但有關(guān)無乳鏈球菌是通過何種機制侵入羅非魚腸道上皮的研究尚未見報道。E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)是定位在細胞表面的跨膜糖蛋白，主要存在上皮組織中，可作為受體與單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的內(nèi)化素(InlA)[8]和肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)表面蛋白(PspA)[9]相連接，細菌可依靠這種連接侵入宿主細胞。目前尚未見關(guān)于尼羅羅非魚E-鈣黏著蛋白(On-ECdh)功能的相關(guān)報道。筆者對尼羅羅非魚On-ECdh基因(GenBank登錄號：MT370500)進行克隆，分析該基因編碼的氨基酸序列，研究無乳鏈球菌刺激前后On-ECdh基因在尼羅羅非魚體內(nèi)的表達模式，以期為羅非魚E-鈣黏著蛋白的功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康尼羅羅非魚300尾購自廣西欽州市某羅非魚養(yǎng)殖場，體質(zhì)量約50 g。RNA提取試劑(Trizol、氯仿、無水乙醇、75%乙醇和無RNA酶水)、反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。無乳鏈球菌菌種由本實驗室保種。pMD18-T載體和Taq DNA聚合酶購自日本TaKaRa公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 尼羅羅非魚總RNA提取和第一鏈cDNA合成

健康尼羅羅非魚暫養(yǎng)于室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)[(28±2) ℃]。隨機剖取3尾健康尼羅羅非魚的腦、鰓、眼、頭腎、心臟、胃、腸道、肝臟、脾臟和肌肉10個組織，分別放入裝有500 μL Trizol的2.0 mL無RNA酶離心管中，按照TransZol Up說明書提取組織RNA。按cDNA合成說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，保存至-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 On-ECdh基因引物設(shè)計

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)中羅非魚全基因組數(shù)據(jù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_0319 65.2)，設(shè)計合成羅非魚On-ECdh基因克隆引物E-cadherinF/E-cadherinR(表1)。運用Premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量引物RT-cadherinF/RT-cadherinR和熒光定量分析內(nèi)參β-actinF/β-actinR引物(表1)。

表1 試驗所用引物

1.2.3 On-ECdh基因片段擴增

以尼羅羅非魚的cDNA為模板，利用引物E-cadherinF/E-cadherinR對On-ECdh基因序列進行擴增。擴增體系為：cDNA 2 μL、引物E-cadherinF/E-cadherinR各2 μL、Premix Taq 25 μL、H2O 19 μL。反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，33個循環(huán)；72 ℃ 10 min；16 ℃保存。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，并回收純化PCR產(chǎn)物。將切膠回收后目的DNA片段與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞。將菌落PCR鑒定為陽性的菌落送至賽默飛世爾科技(中國)有限公司廣州分公司進行測序驗證。

1.2.4 On-ECdh基因生物信息學分析

根據(jù)所測得的序列用DNAMAN軟件拼接獲得On-ECdh基因全長序列，并用下列方法進行生物信息學分析：通過Ex PASy Proteomics Server在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)進行蛋白質(zhì)理論等電點預測、分子量和親水性等信息的推測；蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域預測利用TMHMM Server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行序列比對分析；使用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽序列預測；SoftBerry-Psite分析氨基酸基本功能位點分布預測；采用NCBI Conserved Domains (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域；利用SWISSM-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)進行同源建模分析。結(jié)合ClustalX和GeneDoc軟件，對氨基酸序列進行多重比對分析；利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 無乳鏈球菌刺激后On-ECdh基因組織分布情況

將暫養(yǎng)在室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)的健康尼羅羅非魚(50 g)先饑餓 2 d，隨機挑選80尾進行試驗，方法如下：將過夜培養(yǎng)的無乳鏈球菌稀釋至1×107cfu/mL，使用口腔灌胃方法[10]將上述稀釋細菌按照0.1 mL/尾，灌入80尾尼羅羅非魚。分別在攻毒后1、3、6、12、24、48、72、96 h各時間段，取6尾剖取鰓、眼、頭腎、胃、腸、脾臟和肝臟6個組織。立即放入裝有1.5 mL RNAlater的無RNA酶離心管中，-80 ℃保存。另取10尾尼羅羅非魚每尾注射生理鹽水0.1 mL作為0 h的空白對照組。

熒光定量PCR所用RNA提取和cDNA合成步驟同1.2.1。將合成的第一鏈cDNA稀釋10倍cDNA作為模板，以β-actin 基因作為內(nèi)參基因，參照Transgen Biotech公司的TransScript?Green qPCR SuperMix試劑盒說明書，使用實時熒光定量PCR儀(QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System，購自Life Technologies)檢測On-ECdh基因在各組織中的表達表達水平，每個反應重復3次。反應體系為10 μL：cDNA 0.5 μL、2×TransScript?Green qPCR SuperMix 5 μL、Passive Reference Day 0.2 μL、RT-cadherinF/RT-cadherinR各 0.4 μL。反應條件為：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；95 ℃ 5 s，70 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反應結(jié)束后用QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System軟件進行檢測，選用3個重復熔解曲線相似單峰的Ct值。采用2-△△Ct法分析無乳鏈球菌刺激后各時間段各個組織的相對表達量情況，將計算結(jié)果使用 IBM SPSS Statistics 22 軟件進行統(tǒng)計學單因素方差分析，分析其顯著性水平(P<0.05表示差異顯著)。

2 結(jié) 果

2.1 On-ECdh基因克隆和序列分析

On-ECdh基因全長2442 bp(GenBank登錄號：MT370500)，編碼813個氨基酸。Ex PASy Proteomics Server分析On-ECdh基因推導氨基酸理論分子質(zhì)量為89.9 ku，等電點為4.81，其中含量最高的氨基酸為亮氨酸(9.3%)，其次為纈氨酸(9.1%)，帶負電荷的氨基酸有119個，帶正電荷的氨基酸有82個，預測為親水性蛋白，平均親水值為-0.303。SignalP-5.0 Server預測該序列1～26為信號肽區(qū)域，信號肽剪切位點在第26～27氨基酸之間(圖1a)。TMHMM Server 2.0預測分析跨膜結(jié)構(gòu)在第756～778個氨基酸(圖1b)。運用Softberry線上預測On-ECdh氨基酸的功能位點得到以下信息：N-天冬酰胺糖基化(ASN_GLYCOSYLATION)位點1個；磷酸化環(huán)腺苷酸(CAMP_PHOSPHO_SITE)位點3個；蛋白激酶C磷酸化(PKC_PHOSPHO_SITE)位點有12個；蛋白激酶Ⅱ磷酸化(CK2_PHOSPHO_SITE)位點11個；酪氨酸激酶磷酸化(TYR_PHOSPHO_SITE)位點1個；?；?MYRISTYL)位點13個；酰胺化位點1個；異戊二烯基結(jié)合位點2個；微體C末端目標信號(MICROBODIES_CTER)11個。運用美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站預測保守結(jié)構(gòu)域，On-ECdh蛋白含有1個鈣黏著蛋白前結(jié)構(gòu)域、4個鈣黏著蛋白重復樣結(jié)構(gòu)域、1個鈣黏著蛋白細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和1個跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖1 尼羅羅非魚On-ECdh基因序列及其推導的氨基酸序列(a)和蛋白保守結(jié)構(gòu)區(qū)域(b)

2.2 尼羅羅非魚On-ECdh同源比對及進化分析

通過與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中的其他物種的E-鈣黏著蛋白氨基酸序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚與伯氏樸麗魚(Haplochromisburtoni)的E-鈣黏著蛋白氨基酸序列相似性最高，為79.04%，與已發(fā)現(xiàn)人(Homosapiens)、花斑劍尾魚(Xiphophorusmaculatus)、斑馬魚(Daniorerio)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、家牛(Bostaurus)、家馬(Equuscaballus)的相似性分別44.62%、52.59%、42.44%、37.12%、37.94%、43.70%(圖2)。用ClustalX 2.0和MEGA 7.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，尼羅羅非魚和伯氏樸麗魚的親緣關(guān)系最為相近，在同一個分支，與其他物種親緣關(guān)系較遠(圖3)。

圖2 On-ECdh與其他物種E-鈣黏著蛋白的氨基酸序列比對

圖3 鄰接法構(gòu)建E-鈣黏著蛋白基因系統(tǒng)進化樹

2.3 On-ECdh基因組織表達分析

熒光定量PCR檢測結(jié)果見圖4。On-ECdh基因在健康的尼羅羅非魚各組織均有分布，其中肝臟組織的表達最高，其次為鰓、腸道、胃、眼、肌肉、脾臟、腦、心臟，頭腎的表達水平最低。

圖4 On-ECdh基因在尼羅羅非魚不同組織中的表達情況

2.4 無乳鏈球菌感染后On-ECdh基因組織表達分析

熒光定量PCR檢測頭腎、眼、胃、鰓、腸道和肝臟組織在無乳鏈球菌腸道感染后0、1、3、6、12、24、48、72、96 h的On-ECdh基因的表達模式結(jié)果見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無乳鏈球菌感染后不同時間、不同組織中的表達量有很大差異。眼、頭腎和腸道組織中的表達量呈上調(diào)表達，其中頭腎中的表達量在刺激后1 h有所下降，在3 h時上升達到高峰。眼組織中的表達量在刺激1 h時即達到高峰，腸道中的表達量則在12 h時達到高峰。胃、鰓和肝臟組織中的表達量則呈下調(diào)表達。鰓中的表達量呈波浪型的趨勢，在24 h時最低。胃與鰓中的表達量呈現(xiàn)相似的趨勢，刺激1 h時最低。肝臟中的表達量則在刺激后則呈持續(xù)下調(diào)趨勢。

圖5 無乳鏈球菌刺激后各組織的On-ECdh基因表達時序變化

3 討 論

3.1 On-ECdh基因序列特征和系統(tǒng)進化

本研究中，克隆了On-ECdh基因序列，該基因全長為2442 bp，編碼813個氨基酸，具有1個鈣黏著蛋白前結(jié)構(gòu)域，4個鈣黏著蛋白重復樣結(jié)構(gòu)域、1個鈣黏著蛋白細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和1個跨膜結(jié)構(gòu)域。已有研究表明，鈣黏著蛋白是一種以平行二聚體存在的跨膜蛋白，由5個鈣黏著蛋白重復序列組成的鈣黏著蛋白樣結(jié)構(gòu)區(qū)域的細胞外段可介導細胞與細胞間接觸，發(fā)揮細胞信息傳導、增殖或分化的作用[11-12]，鈣黏著蛋白前結(jié)構(gòu)域包含1個結(jié)合位點，是特異性的同種黏附所必需的，其余4個鈣黏著蛋白重復序列在黏著結(jié)合中的作用尚不清楚。On-ECdh氨基酸的功能位點預測發(fā)現(xiàn)，其4個鈣黏著蛋白重復樣結(jié)構(gòu)域上有糖基化位點1個、蛋白激酶C磷酸化位點6個、酪氨酸激酶磷酸化位點1個、磷酸化環(huán)腺苷酸位點1個等，表明其在細胞與細胞間結(jié)合和信號傳導的過程中起到重要作用。研究顯示，人源E-鈣黏著蛋白的糖基化可直接影響細胞侵襲、增殖能力[13]；蛋白激酶C磷酸化通過直接或間接作用于E-鈣黏著蛋白，在小鼠發(fā)育胚胎細胞壓實起始過程中起作用[14]；在Caco-2細胞單層中用氧化應激誘導，可導致E-鈣黏著蛋白和β-連環(huán)蛋白酪氨酸磷酸化的快速增加，引發(fā)細胞再分布和通透性增加[15]，說明酪氨酸磷酸化可能有調(diào)節(jié)細胞—細胞黏附的作用。另有研究顯示，幽門螺桿菌(Helicobacterpylori) CagA蛋白通過酪氨酸磷酸化獨立的方式可以與E-鈣黏著蛋白相互作用，形成CagA-E-鈣黏著蛋白復合物[16]；煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)能與E-鈣黏著蛋白結(jié)合，并將其用作上皮細胞內(nèi)胚孔黏附和內(nèi)吞的受體[17]；E-鈣黏著蛋白還可作為受體與單核細胞增生李斯特氏菌的內(nèi)化素[8]和肺炎鏈球菌表面蛋白[9]相連接，介導細菌侵入宿主細胞。

通過多序列比對，發(fā)現(xiàn)On-ECdh與伯氏樸麗魚E-鈣黏著蛋白氨基酸序列的同源性為79.04%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚On-ECdh基因和伯氏樸麗魚E-鈣黏著蛋白基因位于同一分支，與其他物種在不同分支，說明尼羅羅非魚與伯氏樸麗魚親緣關(guān)系較近，與其他物種的親緣關(guān)系較遠。由此推測，On-ECdh保守結(jié)構(gòu)域在進化過程中具有較高的保守性，并且不同物種有不同的差異性。

3.2 尼羅羅非魚On-ECdh基因在無乳鏈球菌感染前后的表達模式

熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)，On-ECdh基因在健康尼羅羅非魚肝臟、鰓、腸道、胃組織中均有較高表達量，在頭腎組織中表達量最低。On-ECdh基因在各組織中表達量的差異主要是受尼羅羅非魚體內(nèi)上皮組織的分布和機體分泌的影響。無乳鏈球菌刺激后，On-ECdh基因在尼羅羅非魚肝臟、鰓、胃組織的表達量下調(diào)，這可能跟無乳鏈球菌能夠通過消化道進入羅非魚機體內(nèi)的血液循環(huán)并破環(huán)組織器官的感染路徑[18]有關(guān)。值得注意的是，On-ECdh基因在眼、頭腎、腸道組織中分別在感染1、3、12 h時表達量達到高峰，隨后表達量顯著下降。有研究表明，E-鈣黏著蛋白在人上皮細胞間連接形成黏膜屏障的結(jié)構(gòu)黏附力，可以參與氣道上皮細胞機體免疫反應[19]；免疫細胞化學顯示，E-鈣黏著蛋白對腺癌細胞的敏感性為80.0%[20]。由此推測，尼羅羅非魚機體受到無乳鏈球菌刺激后On-ECdh可能參與免疫反應。無乳鏈球菌刺激后On-ECdh基因在尼羅羅非魚機體表達的結(jié)果與食管鱗癌患者大部分處于pTNM低期時E-鈣黏著蛋白高表達而在食管鱗癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移時E-鈣黏著蛋白處于低表達的結(jié)果[21]相似。此外，其他研究證明，在胃癌、大腸癌、肝癌細胞中E-鈣黏著蛋白的表達量低于正常組織[22-24]。頭腎是羅非魚機體內(nèi)主要的免疫器官，感染3 h時表達量上升，或許與羅非魚機體的自身免疫反應調(diào)節(jié)有關(guān)。

4 結(jié) 論

筆者克隆了On-ECdh基因序列，該基因全長2442 bp，編碼813個氨基酸，具有1個鈣黏著蛋白前結(jié)構(gòu)域、4個鈣黏著蛋白重復樣結(jié)構(gòu)域、1個鈣黏著蛋白細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和1個跨膜結(jié)構(gòu)域。通過多序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，On-ECdh基因與伯氏樸麗魚E-鈣黏著蛋白基因的同源性最高，達79.04%，并且位于同一分支。熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)， On-ECdh基因在健康的尼羅羅非魚各組織中均有分布，其中肝組織中的表達量最高，無乳鏈球菌刺激后表達模式發(fā)生改變。該研究結(jié)果可為尼羅羅非魚E-鈣黏著蛋白基因功能研究提供基礎(chǔ)資料。