徐 雯 呂玉芹 高 蕾 張敬軍

山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，山東泰安 271000

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見病，病因復雜，發(fā)病機制尚未完全闡明[1］。奧卡西平是卡馬西平的10-酮類似物，通過抑制持續(xù)、高頻、重復神經(jīng)元放電，減少突觸傳遞興奮發(fā)揮抗癇作用[2］。70%～80%的癲癇患者由一個或多個遺傳因素導致，其余20%～30%由后天因素引起，如中風、腫瘤或頭部損傷[4］?；蚪M技術和生物信息學的進步促進了全基因組范圍內(nèi)基因變異的發(fā)現(xiàn)[3］，本研究從遺傳學角度結合藥物靶點信息，利用生物信息學如單細胞測序、全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）等 研 究奧卡西平與癲癇基因的相關性，進一步明確奧卡西平抗癲癇機制，為其臨床應用及實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

DrugBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.drugbank.ca/）；DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；MAGMA軟件（https：//ctglab.nl/software/magma）；GWAS數(shù)據(jù)庫；EWCE包。

1.2 利用DrugBank獲取奧卡西平的靶基因

DrugBank是世界上使用最廣泛的參考藥物資源之一，涵蓋藥物靶點、藥物作用和藥物相互作用信息[5-6］。進入DrugBank，輸入關鍵詞Oxcarbazepine進行檢索，藥物靶點包括四個方面：Targets、Enzymes、Carriers、Transporters，展開靶點信息詳細頁面，下載、存儲并整理數(shù)據(jù)。

1.3 利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行奧卡西平25個靶基因的ID轉(zhuǎn)換

DAVID是一個整合了生物學數(shù)據(jù)和分析工具的生物信息數(shù)據(jù)庫，為大規(guī)模的基因或蛋白提供系統(tǒng)的功能注釋信息。DAVID可將大型基因列表壓縮為基因功能組，在基因/蛋白質(zhì)標識符之間進行轉(zhuǎn)換，可視化多基因?qū)Χ嘈g語的關系，將不同種類的術語聚集到組中，搜索相關基因或術語，動態(tài)查看生物路徑列表中的基因[7］。進入DAVID網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/），選擇shortcut to DAVID Tools進入Gene ID conversion界面，upload界面輸入奧卡西平基因列表，Select Identifier列表下選擇Official-Gene-Symbol，List Type處選擇Gene List，然后點擊Submit List；List界面中List manager選擇List 1，Use，Species選擇Homo Sapiens，點擊select species；Background界面選擇Homo Sapiens，Use，Successfully submitted gene list；轉(zhuǎn)換成基因類型ENTREZ-GENE-ID（Default），submit to conversion Tool，點擊Download File，結果保存于文本文檔中，命名為set.txt文件。

1.4 奧卡西平靶基因與癲癇GWAS數(shù)據(jù)的關聯(lián)分析

基于GWAS數(shù)據(jù)，將全基因組中的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide ploymorphism，SNP）作為分子遺傳標記，進行全基因組對照分析或相關性研究，利用MAGMA軟件將藥物靶點與疾病靶點進行映射，獲得奧卡西平治療癲癇的潛在作用靶點。應用基因集分析方法，計算P值（P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義），證明奧卡西平靶基因在GWAS層面與癲癇致病基因存在關聯(lián)。

1.5 奧卡西平靶基因與稀有變異癲癇危險基因的遺傳重疊

為研究奧卡西平靶點與稀有變異的癲癇危險基因是否存在遺傳重疊，對稀有變異進行了外顯子分析[8］，使用102個單基因癲癇基因作為已知疾病基因的集合，這些基因來源于1 165例患者和3 877名對照者的外顯子測序[9］。以人類全基因組（約20 000個基因）為背景，進行Fisher精確檢驗，分析奧卡西平靶基因與單基因癲癇基因重疊的意義。檢驗水準α=0.05。

1.6 奧卡西平靶基因表達加權細胞型富集分析

利用表達加權細胞類型富集（EWCE）方法探索奧卡西平靶基因是否能定位于特定腦細胞類型，使用單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，比較輸入基因列表的平均表達水平與隨機生成相同大小的每個細胞類型基因列表的平均表達水平。本研究采用Karolinska研究所的大腦scRNA-seq數(shù)據(jù)集（包括9 970個細胞），用24種細胞類型注釋來自小鼠大腦新皮質(zhì)、下丘腦、中腦、海馬和紋狀體以及富含少突膠質(zhì)細胞、多巴胺能神經(jīng)元的樣本；以及l(fā)innarsson實驗室的另一個scRNA-seq數(shù)據(jù)集（包括3 005個細胞）?？紤]到物種之間差異，應用了艾倫腦科學研究所的另一個人類單核RNA測序數(shù)據(jù)集的結果，包括人類中顳皮層的4 401個細胞。使用小鼠單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)作為背景基因集，將人的奧卡西平靶基因轉(zhuǎn)換成小鼠的基因形式，使用EWCE計算奧卡西平靶基因在腦細胞中表達富集的顯著性，利用ggplot2生成圖形。

1.7 奧卡西平靶向富集途徑分析

為進一步了解奧卡西平治療癲癇的潛在靶點基因功能及其在信號通路中的作用，將奧卡西平靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，將P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的篩選條件，將物種定義為homo sapiens，進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析。GO富集選取生物過程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular component，CC）進行分析。

2 結果

2.1 通過DrugBank查找奧卡西平靶基因

共獲取到25種奧卡西平靶基因，主要為鈉離子通道、細胞色素P450家族成員、醛酮還原酶家族成員、血清白蛋白、羰基還原酶家族成員，見表1。

表1 奧卡西平25種關鍵靶基因

2.2 利用DAVID數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換靶基因ID

利用DAVID數(shù)據(jù)庫獲取上述25種癲癇靶基因的ID信息，見表2。

表2 奧卡西平25種關鍵靶基因ID信息表

2.3 奧卡西平靶基因與癲癇GWAS數(shù)據(jù)的關聯(lián)分析

基因集分析顯示，奧卡西平靶基因與癲癇存在關聯(lián)（P<0.001），其中藥物靶點SCN1A、SCN7A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3B與癲癇GWAS關聯(lián)性最強，見表3。

表3 奧卡西平靶基因與癲癇GWAS關聯(lián)分析

2.4 奧卡西平靶基因與稀有變異癲癇危險基因的遺傳重疊

癲癇102個已知致病基因包括：ADSL、CHRNA2、CSTB、GABRA1、GRIN2B、KCNQ2、NHLRC1、PPT1、SCN9A、STX1B、WWOX、ALDH7A1、CHRNA4、CTSD、GABRB2、HCN1、KCNQ3、NR2F1、PRICKLE1、SIK1、STXBP1、ZEB2、ALG13、CHRNA7、DEPDC5、GABRB3、HNRNPU、KCNT1、NRXN1、 PRICKLE2、 SLC13A5、 SYNGAP1、ARHGEF9、CHRNB2、DNAJC5、GABRG2、IQSEC2、KCTD7、PCDH19、PRRT2、SLC25A22、TBC1D24、ARX、CLN2、DNM1、GAMT、KANSL1、LGI1、PIGA、QARS、SLC2A1、TCF4、ATP1A2、CLN3、DYRK1A、GATM、KCNA2、MAGI2、PIGO、SCARB2、SLC35A2、TPP1、ATP6AP2、CLN5、EEF1A2、GNAO1、KCNB1、MBD5、PIGV、SCN1A、SLC6A1、TSC1、CACNA1A、CLN6、EPM2A、GOSR2、KCNC1、MECP2、PNKP、SCN1B、SLC6A8、TSC2、CDKL5、CLN8、FOLR1、GRIN1、KCNJ10、MEF2C、PNPO、SCN2A、SLC9A6、UBE3A、CHD2、CNTNAP2、FOXG1、GRIN2A、KCNMA1、MFSD8、POLG、SCN8A、SPTAN1、WDR45。

運用R語言對奧卡西平靶基因與102種單基因遺傳性癲癇研究發(fā)現(xiàn)，奧卡西平靶基因與102種單基因遺傳病靶基因重合基因有5種，分別是SCN1A、SCN2A、SCN8A、SCN9A、SCN1B。進行Fisher確切檢驗，得出P<0.001，證明奧卡西平靶基因與癲癇稀有變異基因存在關聯(lián)性。

2.5 奧卡西平靶基因EWCE分析

為評估奧卡西平靶基因集的表達是否顯著富集于特定腦細胞類型，通過EWCE進行分析?；贙arolinska研究所數(shù)據(jù)集，得出奧卡西平靶基因集主要富集于兩種細胞類型（P<0.05），包括下丘腦GABA能神經(jīng)元（P=0.035）和中型多棘神經(jīng)元（medium spiny neuron，MSN）（P=0.046）。利用ggplot繪制柱狀圖，見圖1。

圖1 奧卡西平靶基因細胞型富集

2.6 奧卡西平靶向通路富集途徑分析

通過奧卡西平25個靶基因的路徑富集分析，GO功能富集分析結果顯示，BP、MF和CC相關條目分別為30、18、5條。BP主要涉及突觸后膜電位調(diào)節(jié)、鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運、動作電位膜去極化、神經(jīng)元動作電位、離子跨膜轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)、鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性的調(diào)節(jié)、鈉離子轉(zhuǎn)運的正向調(diào)節(jié)等，見圖2。MF主要包括電壓門控鈉通道活性、電壓門控鈉通道活動參與心肌細胞動作電位、鈉通道調(diào)節(jié)劑活性、離子通道活性，見圖3。CC主要集中在電壓門控鈉通道復合體、郎飛結、閏盤、Z板、T管，見圖4。KEGG通路富集分析共得到7條信號通路，主要涉及細胞色素P450對外源物質(zhì)的代謝、類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝、化學致癌作用、心肌細胞中的腎上腺素能信號，見圖5。這些重要途徑表明，奧卡西平靶基因在鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運中發(fā)揮至關重要的作用。

圖2 奧卡西平靶基因GO-BP富集

圖3 奧卡西平靶基因GO-MF富集

圖4 奧卡西平靶基因GO-CC富集

3 討論

通過DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索到25個奧卡西平潛在靶點，鈉離子通道和細胞色素P450家族成員最為關鍵。SCN1A、SCN2A、SCN8A、SCN9A、SCN1B這5種靶基因與102種單基因遺傳病靶基因重合，表明奧卡西平靶基因與癲癇稀有變異基因存在顯著關聯(lián)。奧卡西平與鈉通道結合，抑制高頻重復神經(jīng)元放電，膜去極化激活鈉通道，引起電壓依賴的構象變化，增加對鈉離子通透性，進一步使細胞去極化。膜失活后通道關閉，對鈉離子通透性降低，膜電位恢復靜止狀態(tài)[10］。KEGG通路富集分析共得到7條信號通路，主要涉及細胞色素P450對外源物質(zhì)的代謝。奧卡西平是一種窄譜酶誘導劑，影響細胞色素P450 3A4（CYP3A4）代謝[11］。CYP3A4在肝臟和腸道中含量最高，負責藥物及內(nèi)源性底物（如前列腺素、類固醇激素和脂肪酸）的代謝[12］。

基因集分析顯示，奧卡西平靶基因與癲癇顯著相關，其中與癲癇GWAS關聯(lián)性最強的藥物靶點是SCN1A、SCN7A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3B。SCN1A位 于 染 色 體2q24.3[13］，編 碼NAV1.1通道的α亞基，與多種癲癇綜合征相關，其變異導致的癲癇中Dravet綜合征超過80%[14］。SCN1A突變導致抑制性GABA能中間神經(jīng)元鈉電流顯著減少，減弱GABA能抑制功能，使大腦興奮和抑制失衡，導致癲癇發(fā)作[15］。SCN7A基因編碼一個非典型鈉通道（Nax），為Na+濃度門控通道。該通道作為血液中Na+水平傳感器，通過改變神經(jīng)元興奮性控制鈉攝取[16］。癲癇發(fā)生過程中，SCN7A在海馬中表達明顯上調(diào)，其機制尚未完全闡明[17］。SCN9A在染色體2q24.3上有27個外顯子，編碼電壓門控鈉通道Nav1.7的α亞基，表達于背根神經(jīng)節(jié)細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和平滑肌細胞[18］。Nav1.7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用，文獻報道了其在大腦中（特別是胚胎海馬體）表達；SCN9A基因突變導致Nav1.7通道中補體相關蛋白或二級信使變化，從而導致興奮閾值降低，重復放電增加，大腦鈉通道功能改變，神經(jīng)元之間連接受阻，導致癲癇發(fā)作[19］。SCN10A編碼電壓門控鈉通道Nav1.8的α亞基，NaV1.8鈉通道選擇性表達于初級感覺神經(jīng)元，如背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)和結狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，因此被稱為特異性感覺神經(jīng)元[20］。在小鼠神經(jīng)元中，電流鉗記錄顯示長時程動作電位的神經(jīng)元興奮性增強，表明SCN10A在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元活動中發(fā)揮作用[21］。NaV1.8是電壓門控鈉通道，從失活狀態(tài)快速恢復，在背根神經(jīng)節(jié)和外周神經(jīng)軸突的無髓感覺神經(jīng)元中重復放電[22］。目前尚不明確Nav1.8疾病突變?nèi)绾握T導感覺神經(jīng)元過度興奮[23］。SCN11A定位于人類3號染色體（3p21-24），編碼鈉通道Nav1.9a/NaN，在背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的傷害性初級感覺神經(jīng)元中優(yōu)先表達[24］。炎癥介質(zhì)通過G蛋白偶聯(lián)途徑使持續(xù)鈉電流介導的NaV1.9幅度增加，NaV1.9通過延長閾下刺激的去極化效應調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性[25］。SCN3B突變使NaV1.5的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運功能受損，轉(zhuǎn)染細胞表面NaV1.5的表達降低。NaV1.5在小膠質(zhì)細胞生理過程中發(fā)揮核心作用，小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬細胞，參與神經(jīng)炎癥反應，對癲癇的發(fā)生有重要作用[26］。轉(zhuǎn)染細胞的全細胞膜片鉗記錄顯示，SCN3B突變顯著降低了鈉電流[27］。在無海馬硬化的顳葉癲癇患者中，SCN3B基因產(chǎn)物Navβ3表達下調(diào)，進而影響海馬區(qū)的微電路，影響興奮性，導致癲癇發(fā)生[28］。

通過單細胞測序及EWCE方法，得出奧卡西平主要富集于下丘腦GABA能神經(jīng)元和MSN。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，GABA受體在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中均有表達[29］。GABA能系統(tǒng)是腦內(nèi)神經(jīng)元興奮性的主要抑制因子，突變會干擾GABA受體的離子通道運輸特性。GABA與GABA受體結合導致通道開放，允許氯離子流入，突觸后膜超極化，導致神經(jīng)元電活動的快速抑制，奧卡西平通過增加GABA受體表達發(fā)揮作用[30］。在大腦發(fā)育過程中，胎兒端腦的外側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起形成紋狀體神經(jīng)元。GABA能MSN是紋狀體的主要神經(jīng)元類型，約占90%以上，是以多巴胺和谷氨酸能輸入為主的投射神經(jīng)元。紋狀體的多巴胺能輸入來自黑質(zhì)致密部，谷氨酸能輸入來自皮質(zhì)和丘腦等區(qū)域[31］。MSN樹突營養(yǎng)不良破壞了突觸通信的結構基礎，通過延伸的皮質(zhì)紋狀體通路中斷信號。鑒于多巴胺和谷氨酸輸入共同到達一個MSN脊椎，需要完全了解這些遞質(zhì)及其下游信號靶點的同源受體的動態(tài)調(diào)節(jié)，才能顯著提高治療癲癇的效果[32］。

綜上，本研究通過多組學數(shù)據(jù)的整合分析和網(wǎng)絡藥理學方法，發(fā)現(xiàn)奧卡西平藥物靶點共25種，與癲癇致病基因存在關聯(lián)性，其中藥物靶點SCN1A、SCN7A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3B與癲癇GWAS關聯(lián)性最強。奧卡西平可能通過作用于下丘腦GABA能神經(jīng)元、中型多棘神經(jīng)元中的鈉離子通道基因發(fā)揮抗癇作用。本研究為進一步明確奧卡西平抗癇作用機制及其臨床用藥的有效性和安全性提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突