葛明峰，金晗，柳海，徐勝威，許昊川，王雯瓊，沈偉良

（1.寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江寧波 315000；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連 116023）

我國(guó)大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，帶動(dòng)了飼料、交通運(yùn)輸、餐飲服務(wù)等相關(guān)上下游產(chǎn)業(yè)，創(chuàng)造了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。但隨養(yǎng)殖量的攀升，受養(yǎng)殖密度增大，以及水體負(fù)載飽和及污染加重，管理水平低和技術(shù)規(guī)范欠科學(xué)等諸多因素影響，養(yǎng)殖大黃魚(yú)病害頻發(fā)，且呈日益加重趨勢(shì)[1-2]。

據(jù)漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)，我國(guó)2020 年大黃魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)25.4 萬(wàn)t，為海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)第一，而因病害造成的經(jīng)濟(jì)損失約為5.0 億元，其中由細(xì)菌性疾病造成的危害最為嚴(yán)重[3-4]。對(duì)大黃魚(yú)細(xì)菌性病害進(jìn)行監(jiān)測(cè)，不僅能夠較系統(tǒng)地掌握細(xì)菌病害的發(fā)生規(guī)律、分布及其程度等，更能及時(shí)、有效地預(yù)防與控制細(xì)菌病害，將其所造成的損失降到最低[5]。

同時(shí)，為推進(jìn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于實(shí)施2021 年水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖“五大行動(dòng)”，達(dá)到用藥減量的目的，對(duì)分離的病原菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以掌握其對(duì)不同漁藥的耐藥性及其變化規(guī)律，豐富當(dāng)?shù)丶叭珖?guó)大黃魚(yú)養(yǎng)殖區(qū)域病原菌耐藥譜庫(kù)，為科學(xué)、規(guī)范、精準(zhǔn)、合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品

2021 年4—10 月，每月在象山西滬港、三門(mén)灣大黃魚(yú)網(wǎng)箱養(yǎng)殖海區(qū)進(jìn)行1 次例行采樣檢測(cè)，并同時(shí)對(duì)寧波市其他大黃魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)，如發(fā)生細(xì)菌性疾病的場(chǎng)進(jìn)行應(yīng)急采樣檢測(cè)。每次每個(gè)養(yǎng)殖點(diǎn)現(xiàn)場(chǎng)采集臨床癥狀明顯的活體或?yàn)l臨死亡的個(gè)體5～10 尾，共采集大黃魚(yú)93 尾。

1.2 主要試劑與材料

牛腦心浸出液固體培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA 提取試劑盒，Omega Biotek 公司產(chǎn)品；2×TaqMasterMix（含染料），Takara Bio 公司產(chǎn)品；16S rDNA 引物，由北京華大基因科技有限公司合成；藥敏檢測(cè)分析試劑盒、試劑板，南京菲恩醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定

無(wú)菌條件下，取魚(yú)肝、脾、腎等組織劃線(xiàn)接種于牛腦心浸出液固體平板，28 ℃培養(yǎng)24～48 h（鰤?mèng)~諾卡氏菌需培養(yǎng)5～7 d）；挑取單菌落純化培養(yǎng)后，提取細(xì)菌DNA。根據(jù)16S rDNA 序列設(shè)計(jì)引物，建立PCR 擴(kuò)增體系[6]。PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果由北京六合華大基因科技股份有限公司提供，經(jīng)GenBank Blast 數(shù)據(jù)比對(duì)后進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.4 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖主要病原微生物耐藥性普查工作要求，選定硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、甲砜霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶、“磺胺甲噁唑+甲氧芐啶”等8 種抗菌藥物。根據(jù)藥敏檢測(cè)分析試劑盒、試劑板操作說(shuō)明，得到各藥物對(duì)菌株的最低抑菌質(zhì)量濃度（MIC），計(jì)算中位值MIC50，然后進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離

2.1.1 細(xì)菌種類(lèi) 2021 年1—10 月從采集的93 尾大黃魚(yú)中分離到6 種細(xì)菌，共25株（表1）。其中：殺香魚(yú)假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）8株，占總菌株數(shù)的32%（8/25）；三類(lèi)弧菌10株，包括溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）各4株，副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）2株，占總分離菌數(shù)的40%（10/25）；另有5株鰤?mèng)~諾卡氏菌（Nocardia seriolea）和2株美人魚(yú)發(fā)光桿菌（Photobacterium），占比分別為20%（5/25）和8%（2/25）。這25株菌株從象山地區(qū)分離到20株（西滬港13株、三門(mén)灣7株），鄞州和奉化地區(qū)各分離到2株，寧海分離到1株。

表1 2021 年1—10 月分離到的細(xì)菌種類(lèi)及數(shù)量 單位：株

2.1.2 分離地點(diǎn)與時(shí)間 共分離到殺香魚(yú)假單胞菌8株，其中1 月（水溫21 ℃）于鄞州區(qū)室內(nèi)水泥池發(fā)病大黃魚(yú)上分離到2株，4—5 月在象山網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(yú)上陸續(xù)分離到6株（4 月、5 月西滬港各2株，三門(mén)灣各1株），發(fā)病水溫普遍為18～22 ℃。分離到弧菌10株（奉化、象山西滬港、三門(mén)灣分別2株、5株、3株），其中溶藻弧菌4株、哈維氏弧菌4株、副溶血弧菌2株，且采樣時(shí)間集中在5、7、8 月。5 月，從象山西滬港同一批魚(yú)組織上不僅分離到1株溶藻弧菌，同時(shí)還分離到2株美人魚(yú)發(fā)光桿菌，表現(xiàn)為混合感染。8—10 月，共分離到5株鰤?mèng)~諾卡氏菌，其中8—9 月從寧海、象山地區(qū)各分離到2株，10 月從象山西滬港分離到1株。

2.2 細(xì)菌耐藥性分析

2.2.1 不同病原菌對(duì)藥物的耐藥性 通過(guò)統(tǒng)計(jì)MIC50得到的結(jié)果見(jiàn)表2。分析可知，殺香魚(yú)假單胞菌的耐藥性普遍大于其他5 種細(xì)菌，特別是對(duì)酰胺醇類(lèi)（甲砜霉素、氟苯尼考）及磺胺類(lèi)藥物（磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶）的MIC50高于其他病原菌。3 種弧菌對(duì)不同藥物的耐藥性基本一致，除對(duì)恩諾沙星和甲砜霉素略有差異外，對(duì)其他6 種藥物的MIC50則完全相同，且與其他3 種病原菌相比，弧菌對(duì)藥物的敏感性更強(qiáng)。美人魚(yú)發(fā)光桿菌和鰤?mèng)~諾卡氏菌都對(duì)鹽酸多西環(huán)素最為敏感，與3 種弧菌的耐藥性類(lèi)似。從抗菌藥物種類(lèi)分析，2 種磺胺類(lèi)藥物對(duì)不同病原菌的抑制作用較強(qiáng)（殺香魚(yú)假單胞菌除外），鹽酸多西環(huán)素和氟甲喹對(duì)溶藻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、美人魚(yú)發(fā)光桿菌及鰤?mèng)~諾卡氏菌都有極好的抑制作用，除氟甲喹對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌MIC50為4.00 mg/L 外，這兩種藥物對(duì)5 種菌的MIC50均小于最低試驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度。另外，恩諾沙星、硫酸新霉素的抑菌效果也普遍較好，MIC50為0.13～4.00 mg/L；而酰胺醇類(lèi)的甲砜霉素、氟苯尼考抑菌效果一般，尤其是對(duì)殺香魚(yú)假單胞菌的MIC50≥200 mg/L。

表2 各病原菌對(duì)不同藥物的耐藥性（MIC50） 單位：mg/L

2.2.2 同種病原菌對(duì)藥物的耐藥性 對(duì)不同采樣時(shí)間、不同養(yǎng)殖地區(qū)大黃魚(yú)上分離到的殺香魚(yú)假單胞菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各菌株對(duì)同一藥物的耐藥性并不完全一致（表3）。除了磺胺間甲氧嘧啶和“磺胺甲噁唑+甲氧芐啶”這2 種藥物對(duì)4株病原菌的MIC 相同外，其他6 種藥物對(duì)不同時(shí)間分離到的殺香魚(yú)假單胞菌的抑菌效果均有一定差異。其中，5 月16 日從象山三門(mén)灣分離的菌株對(duì)氟甲喹的敏感性高于其他株菌；1 月15 日從鄞州室內(nèi)水泥池養(yǎng)殖大黃魚(yú)上分到的菌株對(duì)恩諾沙星敏感性高于其他株菌?？傮w而言，4 月2 日從象山西滬港網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚(yú)體上分離到的殺香魚(yú)假單胞菌對(duì)8種藥物的耐受性普遍高于其他3 個(gè)菌株。這表明從不同時(shí)間、不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖模式大黃魚(yú)上分離到的殺香魚(yú)假單胞菌對(duì)藥物的耐藥性存在一定差異。

表3 不同時(shí)間分離到的殺香魚(yú)假單胞菌對(duì)不同藥物的耐藥性（MIC50） 單位：mg/L

3 討論

細(xì)菌病一直是困擾大黃魚(yú)健康養(yǎng)殖的一類(lèi)疾病，其中以弧菌?。ㄆつw潰瘍?。┚佣啵：ψ畲骩7]。李清祿等[8]對(duì)引起福建省網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(yú)弧菌病的病原菌鑒定為鰻弧菌和副溶血弧菌，且鰻弧菌占51%。這與本研究結(jié)果有一定差異，本研究未分離到鰻弧菌，這可能跟福建省區(qū)域的水溫、鹽度較寧波市高等環(huán)境差異導(dǎo)致水體中優(yōu)勢(shì)菌群不同有關(guān)。殺香魚(yú)假單胞菌是引起寧波市大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病的主要病原[9-10]。有研究[11-13]對(duì)寧德市大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)致病菌也為假單胞菌屬細(xì)菌。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從象山西滬港魚(yú)體上分離到的菌株數(shù)及細(xì)菌種類(lèi)均高于三門(mén)灣。這可能跟兩者所處地理位置有關(guān)，三門(mén)灣更靠近象山港口，水流速度快，且該區(qū)域養(yǎng)殖密度低，養(yǎng)殖環(huán)境整體優(yōu)于西滬港，因而細(xì)菌感染及疾病的發(fā)生都較后者低。

大黃魚(yú)細(xì)菌病流行時(shí)間大多在4—10 月，其中5—9 月為流行高峰期[7]。從不同病原菌的分離時(shí)間分析，4—5 月是大黃魚(yú)內(nèi)臟白點(diǎn)病的高發(fā)期，隨著水溫升高，該病有所緩減。5—8 月由于梅雨、高溫等惡劣天氣影響，且隨著水溫上升，細(xì)菌迅速繁殖，水質(zhì)加劇惡化，易發(fā)生弧菌病等多種細(xì)菌疾病。如這一時(shí)期分離到的美人魚(yú)發(fā)光桿菌和3 種弧菌，都是海水中常見(jiàn)的條件致病菌[14-15]，其感染魚(yú)體的主要原因是目前網(wǎng)箱養(yǎng)殖集約化程度高，養(yǎng)殖密度大，導(dǎo)致魚(yú)體容易損傷，免疫力下降。本次調(diào)查在6 月未分離到任何菌株，推測(cè)可能跟5 月細(xì)菌集中感染后養(yǎng)殖戶(hù)注重水體消毒并內(nèi)服抗生素等積極的防控措施有關(guān)，亦或跟采樣點(diǎn)的局限性有關(guān)。8—10 月為大黃魚(yú)諾卡氏菌病發(fā)病高峰期，該菌從2006 年在網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(yú)被發(fā)現(xiàn)后[16-17]，便一直危害魚(yú)體，尤其近幾年對(duì)寧波市大黃魚(yú)養(yǎng)殖造成了較為嚴(yán)重影響，雖然日死亡量不大，但影響時(shí)間長(zhǎng)。由上述分析可知，大黃魚(yú)細(xì)菌性疾病的發(fā)生種類(lèi)與水溫存在一定的相關(guān)性。另有研究[18]表明，福建省等大黃魚(yú)養(yǎng)殖地區(qū)也時(shí)常發(fā)生上述疾病，但流行時(shí)間略有差異，如內(nèi)臟白點(diǎn)病在寧德市的發(fā)病期往往為11 月至次年5 月，而寧波市11 月至次年2 月很少發(fā)現(xiàn)該病。這主要跟水溫有關(guān)，該時(shí)期寧波市水溫較低，養(yǎng)殖戶(hù)往往將大黃魚(yú)運(yùn)往溫州、福建等水溫較高的地區(qū)越冬。

從細(xì)菌耐藥性結(jié)果可知，鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、恩諾沙星對(duì)大部分病原菌的抑制效果較好，可作為防治大黃魚(yú)細(xì)菌病的首選藥物。但考慮到寧波市養(yǎng)殖區(qū)域鹽酸多西環(huán)素及恩諾沙星使用較普遍且頻繁，建議養(yǎng)殖戶(hù)可用氟甲喹替代，實(shí)行輪換用藥，以避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[19]?；前奉?lèi)藥物與增效劑甲氧芐啶合用療效更佳[5]。病原菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的MIC50較前幾年大幅下降，這可能是由于近幾年寧波市大黃魚(yú)養(yǎng)殖區(qū)域較少使用磺胺類(lèi)藥物，亦或與菌株耐藥性的自然消失有關(guān)，但對(duì)該類(lèi)藥物敏感性還需持續(xù)跟蹤監(jiān)測(cè)，以準(zhǔn)確掌握其變化規(guī)律。另外，不同時(shí)間、不同地區(qū)魚(yú)體上分離到的殺香魚(yú)假單胞菌對(duì)藥物的耐藥性并非完全一致，這可能跟菌種存在不同亞種以及各養(yǎng)殖地區(qū)用藥狀況有關(guān)。因此即使針對(duì)同種細(xì)菌，在藥物選擇及劑量上也應(yīng)參考藥敏試驗(yàn)結(jié)果而定，不可僅憑經(jīng)驗(yàn)或照搬書(shū)本[20]。但要指出的是，MIC50雖然是評(píng)價(jià)病原菌對(duì)抗菌藥物敏感性的主要指標(biāo)，是選擇有效抗菌藥物的重要依據(jù)，但體外試驗(yàn)與魚(yú)體內(nèi)環(huán)境還存在一定差異。因此，要制訂有效的治療方案，達(dá)到最佳的療效，還應(yīng)結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)等參數(shù)。

病原菌耐藥性監(jiān)測(cè)對(duì)科學(xué)精準(zhǔn)用藥，推動(dòng)水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖及用藥減量具有十分重要的意義。之前關(guān)于大黃魚(yú)細(xì)菌耐藥性的分析大多集中于福建省寧德市[21-22]，而本研究進(jìn)一步豐富了大黃魚(yú)病原菌耐藥性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，擴(kuò)大了耐藥性譜庫(kù)，有利于在相關(guān)疾病發(fā)生時(shí)做出快速判斷并采用相應(yīng)的藥物進(jìn)行防控，避免亂用、濫用藥物，從而降低病原微生物耐藥性。同時(shí)，養(yǎng)殖戶(hù)還應(yīng)嚴(yán)格遵守《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙》（2020 年1、2 號(hào)）相關(guān)規(guī)定，并嚴(yán)格執(zhí)行休藥期制度，避免魚(yú)體藥物殘留超標(biāo)，保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全。