葉敬文，沈云岳，劉鷖雯，何怡青，杜 艷，張國(guó)良，高 鋒，楊翠霞

（1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200233；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200233）

乳腺癌是源于乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。2020年全球新增癌癥患者中，女性乳腺癌患者約占11.7%，發(fā)病率居所有腫瘤之首[1]。約有80%的乳癌患者為雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性，表現(xiàn)為激素依賴性[2]，對(duì)內(nèi)分泌治療敏感；有約20%的患者會(huì)產(chǎn)生耐藥性并復(fù)發(fā)[2]，其中20%的復(fù)發(fā)患者ER由陽(yáng)性轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅磉_(dá)或陰性[3]，失去對(duì)內(nèi)分泌治療的敏感性[2]。根據(jù)美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（the National Comprehensive Cancer Network，NCCN）最新指南[4]，乳腺癌復(fù)發(fā)患者若表現(xiàn)為ER陰性或ER低表達(dá)，只能使用吉西他濱等常規(guī)化療藥物。因此，針對(duì)發(fā)生內(nèi)分泌治療耐藥的患者，目前臨床多采用放化療輔以芳香化酶抑制劑等聯(lián)合治療方案[5]，但多數(shù)患者對(duì)放化療的反應(yīng)較大，且芳香化酶抑制劑僅適用于絕經(jīng)后女性。因此，尋找新的治療方案是攻克內(nèi)分泌治療耐藥乳腺癌的關(guān)鍵。有研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)通路常被過(guò)度激活[6]。因此，信號(hào)通路抑制劑是目前臨床討論的熱點(diǎn)方案之一。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的重要信號(hào)通路，在乳腺癌中會(huì)被高度活化[6-7]。當(dāng)常規(guī)化療藥物阿霉素治療管腔型乳腺癌發(fā)生耐藥時(shí)，MAPK/ERK通路在耐藥細(xì)胞中被過(guò)度激活，而抑制MAPK/ERK信號(hào)通路可明顯降低耐藥細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性[8]，提示MAPK/ERK通路與乳腺癌細(xì)胞的耐藥性和可塑性密切相關(guān)。但在內(nèi)分泌治療耐藥中，關(guān)于MAPK/ERK通路活化程度及作用的研究尚少。為此，本研究擬采用絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）抑制劑抑制MAPK/ERK信號(hào)通路，觀察內(nèi)分泌治療耐藥的乳腺癌細(xì)胞增殖的改變情況，為尋找內(nèi)分泌治療耐藥的乳腺癌治療新方案提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。MCF-7細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的最低基本培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）培養(yǎng)。T47D細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

參考文獻(xiàn)[9]，使用1 μmol/L他莫昔芬連續(xù)刺激MCF-7細(xì)胞和T47D細(xì)胞＞10個(gè)月，建立內(nèi)分泌治療耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/TAMR和T47D/TAMR，此后，MCF-7/TAMR和T47D/TAMR細(xì)胞需持續(xù)培養(yǎng)于含1 μmol/L他莫昔芬的培養(yǎng)基中。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7他莫昔芬耐藥株（MCF-7/TAMR）采用無(wú)酚紅MEM培養(yǎng)，人乳腺癌細(xì)胞系T47D他莫昔芬耐藥株（T47D/TAMR）采用無(wú)酚紅1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，2種培養(yǎng)基中均添加5%活性炭吸附胎牛血清，同時(shí)添加1 μmol/L他莫昔芬、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素。培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5% CO2。細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。他莫昔芬和MEK抑制劑U0126均購(gòu)自美國(guó)MedChem Express公司。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，CCK-8試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司。分2個(gè)組進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。第1組實(shí)驗(yàn)：將MCF-7細(xì)胞、MCF-7/TAMR細(xì)胞、T47D細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞按3 000個(gè)/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度[0、1、5、10 μmol/L，0 μmol/L為僅加入1 μmol/L二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；美國(guó)MedChem Express公司）]的他莫昔芬；第2組實(shí)驗(yàn)：將MCF-7/TAMR細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞按3 000個(gè)/孔接種到96孔板中培養(yǎng)24 h后，加入1 μmol/L他莫昔芬和不同濃度[0、1、5、10 μmol/L，0 μmol/L為僅加入1 μmol/L DMSO]的U0126。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞均培養(yǎng)72 h后，加入20 μL CCK-8試劑和80 μL相應(yīng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，37 °C孵育2 h。采用Epoch酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）檢測(cè)吸光度（A）值。

1.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

分2個(gè)組進(jìn)行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。第1組實(shí)驗(yàn)：將MCF-7細(xì)胞、MCF-7/TAMR細(xì)胞、T47D細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞按800個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后加入他莫昔芬，使培養(yǎng)基中的他莫昔芬濃度為1 μmol/L。第2組實(shí)驗(yàn)：將MCF-7/TAMR細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞按800個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，U0126組加入他莫昔芬和U0126，使培養(yǎng)基中的他莫昔芬和U0126濃度分別為1和5 μmol/L；對(duì)照組加入他莫昔芬和DMSO，使兩者濃度均為1 μmol/L。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞均持續(xù)培養(yǎng)2周，直至形成肉眼可見(jiàn)的克隆細(xì)胞團(tuán)后，用4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞20 min后，去除固定液，用1×磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌3次，再用0.05%結(jié)晶紫溶液染色20 min，用1×PBS洗滌后風(fēng)干，拍照并記錄所形成的細(xì)胞克隆數(shù)目。

1.4 免疫印跡法

采用RIPA裂解液（上海碧云天公司）裂解細(xì)胞并提取總蛋白。采用bicinchoninic酸蛋白測(cè)定試劑盒（美國(guó)Sigma公司）測(cè)定總蛋白濃度。在總細(xì)胞裂解液中加入總體積1/4的蛋白上樣緩沖液（上海碧云天公司，貨號(hào)P0015），置于100 ℃水浴鍋中孵育10 min，按照每泳道10 μg總蛋白上樣，采用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，然后用含5%脫脂奶粉的三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液（tris-hydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）封閉1 h，加入一抗，4 ℃下孵育過(guò)夜。一抗中的c-MYC抗體、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinase，pERK）抗體、ERK抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司（貨號(hào)分別為5605S、4370P、4695），類固醇受體共激活因子-1（steroid receptor coactivator-1，SRC-1）抗體、E26轉(zhuǎn)錄因子-2（E26 oncogene homolog-2，ETS-2）抗體和c-JUN抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克公司（貨號(hào)分別為A9058、A16844、A11378）。采用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的多克隆二抗，孵育1 h。然后加入化學(xué)發(fā)光底物，采用Amersham Imager 600掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)GE healthcare Bio-Sciences AB公司）分析。以3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，使用Image Pro-Plus 6.0軟件（美國(guó) Media Cybernetics 公司）對(duì)圖像灰度進(jìn)行分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

MCF-7/TAMR細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞按300 000個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，U0126組加入他莫昔芬和U0126，使培養(yǎng)基中的他莫昔芬和U0126濃度分別為1和5 μmol/L；對(duì)照組加入他莫昔芬和DMSO，使兩者濃度均為1 μmol/L，2個(gè)組的細(xì)胞分別處理12 h和48 h。收集細(xì)胞上清，并使用胰酶消化細(xì)胞，與上清液一起1 000×g離心5 min，棄上清，用冰PBS清洗沉淀，1 000×g離心5 min，棄上清。使用冰70%乙醇固定細(xì)胞30 min，用冰PBS清洗后，1 000×g離心5 min，棄上清，加入細(xì)胞周期檢測(cè)試劑（上海碧云天公司，貨號(hào)C1052），避光染色30 min，采用CytoFLEX Lx流式細(xì)胞儀（美國(guó) Beckman Coulter公司）檢測(cè)，采用配套的CytExpert 2.4軟件進(jìn)行分析。

1.6 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

MCF-7/TAMR細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞按300 000個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加入他莫昔芬和U0126，使培養(yǎng)基中的他莫昔芬和U0126濃度分別為1和5 μmol/L；對(duì)照組加入他莫昔芬和DMSO，使兩者的濃度均為1 μmol/L。2個(gè)組均處理72 h。采用RNAiso Plus試劑盒（日本TaKaRa公司）提取總RNA。采用NanoDrop系統(tǒng)（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）測(cè)定RNA濃度。采用含gDNA Eraser（日本TaKaRa公司）的PrimeScript RT Reagent試劑盒（日本TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄1 μg mRNA。采用熒光定量PCR檢測(cè)SRC-1、ETS-2和c-JUN基因。SYBR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，檢測(cè)儀器為QuantStudio 7 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）。引物由上海擎科公司合成，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，65 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均至少獨(dú)立重復(fù)3次。采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 他莫昔芬對(duì)細(xì)胞增殖的影響

采用不同濃度他莫昔芬處理后，MCF-7/TAMR細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞的增殖速度分別顯著高于MCF-7細(xì)胞和T47D細(xì)胞（P＜0.05）。在1 μmol/L他莫昔芬的刺激下，MCF-7/TAMR細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞克隆形成能力分別顯著高于MCF-7細(xì)胞和T47D細(xì)胞（P＜0.000 1）。見(jiàn)圖1。

圖1 他莫昔芬對(duì)MCF7細(xì)胞、MCF-7/TAMR細(xì)胞、T47D細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 他莫昔芬耐藥細(xì)胞株MAPK/ERK信號(hào)通路分子的表達(dá)情況

MCF-7/TAMR細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞的ERK、pERK和c-MYC表達(dá)量分別高于MCF-7細(xì)胞和T47D細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

圖2 MCF-7/TAMR細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、T47D/TAMR細(xì)胞和T47D細(xì)胞中MAPK/ERK信號(hào)通路分子的表達(dá)

2.3 抑制MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)他莫昔芬耐藥細(xì)胞株增殖的影響

采用MEK抑制劑U0126阻斷MAPK/ERK信號(hào)通路后，MCF-7/TAMR和T47D/TAMR細(xì)胞的MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)分子c-MYC、ERK和pERK表達(dá)顯著降低。見(jiàn)圖3（a）。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 mol/L U0126（對(duì)照）比較，用不同濃度U0126處理后，MCF-7/TAMR和T47D/TAMR細(xì)胞的增殖速度均顯著降低（P＜0.05、P＜0.000 1）。見(jiàn)圖3（b）。

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，U0126組MCF-7/TAMR細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞的克隆形成能力均顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖3（c）。

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，U0126組處于S期和G2期的MCF-7/TAMR細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞百分比率顯著增加（P＜0.01）。見(jiàn)圖3（d）、表2。

表2 對(duì)照組和U0126組2種細(xì)胞處于S期和G2期的百分比 %

圖3 MEK抑制劑U0126對(duì)他莫昔芬耐藥細(xì)胞株增殖及細(xì)胞周期的影響

2.4 抑制MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)他莫昔芬耐藥細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，U0126組MCF-7/TAMR和T47D/TAMR細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SRC-1、ETS-2和c-JUN的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 MCF-7/TAMR和T47D/TAMR細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SRC-1、ETS-2和c-JUN表達(dá)的免疫印跡圖

圖5 MEK抑制劑U0126對(duì)MCF-7/TAMR細(xì)胞和T47D/TAMR細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

3 討論

內(nèi)分泌治療耐藥是ER陽(yáng)性乳腺癌患者治療失敗及復(fù)發(fā)的主要原因，目前臨床對(duì)這類患者尚無(wú)有效的治療方案。本研究結(jié)果顯示，抑制他莫昔芬耐藥細(xì)胞株的MAPK/ERK通路可顯著抑制ERK的過(guò)度激活，下調(diào)ERK依賴的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，使其細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，延緩增殖速度，恢復(fù)了其對(duì)他莫昔芬的敏感性。提示抑制MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌治療耐藥具有重要的潛在臨床價(jià)值。

針對(duì)內(nèi)分泌治療耐藥的乳腺癌患者，目前臨床上首選聯(lián)合使用多種化療藥物[4-5]，但其毒副作用均較大。為解決這一難題，有學(xué)者提出使用內(nèi)分泌治療藥物聯(lián)合調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期或抑制信號(hào)通路過(guò)度活化的替代方案。目前，臨床常聯(lián)合使用PI3K抑制劑、Src抑制劑和CDK4/6抑制劑等。PI3K抑制劑，如阿培利斯，可通過(guò)抑制蛋白激酶B（protein kinase B，PKB；又稱Akt）活化，抑制生長(zhǎng)信號(hào)通路活化[10]，已被美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局（U.S.Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于治療PI3CA基因突變的乳腺癌。Src蛋白是許多信號(hào)通路的上游分子，Src抑制劑，如博舒替尼，可抑制Src的磷酸化，從而抑制PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、MAPK/ERK和Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等信號(hào)通路的活性[11-12]，已被FDA批準(zhǔn)用于治療慢性粒系白血病。雖然以上用于治療內(nèi)分泌治療耐藥乳腺癌的方案均在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中取得一定的療效，但在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，多數(shù)患者會(huì)迅速對(duì)其產(chǎn)生耐藥[5，13]，因此至今未進(jìn)入臨床應(yīng)用。有研究結(jié)果表明，MAPK/ERK通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要通路之一，在乳腺癌、黑色素瘤和白血病細(xì)胞中被過(guò)度活化[6，14-15]。有研究結(jié)果顯示，三陰性乳腺癌患者磷酸化ERK的表達(dá)量高于ER陽(yáng)性的管腔型乳腺癌患者（P＜0.01）[16]。ERK在介導(dǎo)乳腺癌發(fā)生順鉑或阿霉素耐藥中發(fā)揮著重要作用，抑制其過(guò)度活化可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性[17]。由此可見(jiàn)，ERK的活化程度與乳腺癌細(xì)胞的惡性程度和耐藥性密切相關(guān)。因此，MAPK/ERK信號(hào)通路過(guò)度激活可能提示乳腺癌預(yù)后不良。但關(guān)于ERK活化程度在內(nèi)分泌治療耐藥中的作用的研究尚不多見(jiàn)，具體機(jī)制仍不清楚。為此，本研究在體外建立了內(nèi)分泌治療耐藥細(xì)胞模型MCF-7/TAMR和T47D/TAMR，結(jié)果顯示MAPK/ERK通路被過(guò)度激活，與文獻(xiàn)報(bào)道[18]一致。本研究采用MEK抑制劑U0126抑制MAPK/ERK通路后，發(fā)現(xiàn)MCF-7/TAMR和T47D/TAMR細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，逆轉(zhuǎn)了乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的耐藥性。提示抑制MAPK/ERK通路可能對(duì)治療內(nèi)分泌治療耐藥的乳腺癌有一定作用，但是其體內(nèi)效果有待深入研究。

轉(zhuǎn)錄因子是MAPK/ERK通路發(fā)揮生物學(xué)功效的關(guān)鍵因子。MAPK/ERK信號(hào)通路調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子包括SRC-1、ETS-2、c-JUN、c-MYC和c-FOS等[19-22]，主要發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等功能。BROWNE等[19]的研究結(jié)果顯示，SRC-1通過(guò)MAPK/ERK通路活化后，可使ETS-2表達(dá)增加，從而調(diào)節(jié)c-JUN等下游基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。SRC-1在調(diào)控乳腺癌細(xì)胞獲得內(nèi)分泌治療耐藥中發(fā)揮了重要作用[19]。有研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者ETS家族異常高表達(dá)[20]，其中ETS-2參與了乳腺癌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)分泌治療耐藥[21]。而c-JUN是構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activating protein-1，AP-1）的轉(zhuǎn)錄因子之一，具有參與細(xì)胞增殖、分化等生理功能[23]。QUAN等[24]的研究結(jié)果顯示，c-JUN可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)分泌治療耐藥。由此可見(jiàn)，SRC-1、ETS-2和c-JUN與腫瘤細(xì)胞發(fā)生內(nèi)分泌治療耐藥密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，抑制ERK磷酸化可顯著抑制SRC-1、ETS-2和c-JUN的表達(dá)，進(jìn)而使乳腺癌細(xì)胞恢復(fù)對(duì)他莫昔芬的敏感性。這進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子（SRC-1、ETS-2和c-JUN）在內(nèi)分泌治療耐藥發(fā)生中的重要作用。

綜上所述，抑制MAPK/ERK通路可減緩內(nèi)分泌治療耐藥的乳腺癌細(xì)胞的增殖速度，恢復(fù)其對(duì)他莫昔芬的敏感性。提示抑制MAPK/ERK通路并與他莫昔芬聯(lián)合使用可能具有良好的臨床應(yīng)用潛力，或能為臨床治療化療不耐受，且內(nèi)分泌治療耐藥乳腺癌患者的治療提供新思路。