劉 凱，張沛茹，謝素紅，郭 林，盧仁泉

（復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科 復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤系，上海 200032）

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)的發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第3位，病死率居第2位[1]。近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢[2]。有研究結(jié)果顯示，一些基因的DNA甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)展密切相關(guān)[3]。DNA甲基化對于基因的表達有重要的調(diào)節(jié)作用[4]，如某些抑癌基因的啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化會降低轉(zhuǎn)錄活性，使抑癌基因表達沉默，導致細胞增殖異常而發(fā)生惡性腫瘤。SEPT9基因是 GTP結(jié)合蛋白家族成員，參與了細胞骨架的形成、細胞分裂和腫瘤的發(fā)生等，其基因啟動子的高甲基化與結(jié)直腸癌密切相關(guān)。本研究擬通過定量檢測結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織基因啟動子甲基化水平，并與腫瘤基因圖譜計劃（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選出結(jié)直腸癌患者差異表達和啟動子甲基化水平升高的基因，并探討其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年9—11月復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科就診的17例結(jié)直腸癌患者，其中男9例、女8例，年齡30～74歲。參考美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版腫瘤分期標準[5]進行結(jié)直腸癌TNM分期。本研究經(jīng)復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 經(jīng)術(shù)后或活檢后病理確診為結(jié)直腸癌；年齡＞18歲。

1.2.2 排除標準 （1）處于妊娠期或哺乳期的女性；（2）既往有惡性腫瘤病史；（3）既往有腹部外科手術(shù)史；（4）術(shù)前已行放射治療或化療等輔助治療；（5）病理學類型為惡性黑素瘤、間質(zhì)瘤、淋巴瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、鱗癌等非腺癌系惡性腫瘤；（6）原發(fā)灶不在結(jié)直腸的惡性腫瘤患者（卵巢、宮頸、子宮、空腸、回腸、十二指腸或原發(fā)不明惡性腫瘤侵犯結(jié)直腸等）。

1.3 方法

1.3.1 一般資料 收集所有患者的臨床資料。年齡≤60歲7例，＞60歲10例；腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～Ⅳ期13例；淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移8例，有轉(zhuǎn)移9例；腫瘤部位為直腸10例，結(jié)腸7例；腫瘤直徑（缺失1例）≤5 cm 12例，＞5 cm 4例。

1.3.2 樣本收集 收集術(shù)中切除的癌組織樣本及距腫瘤＞5 cm的癌旁組織樣本，-80 ℃液氮罐保存。

1.3.3 DNA抽提 采用基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，目錄號：DP304]提取組織DNA，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3.4 基因啟動子甲基化檢測 采用基于堿基特異性裂解和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）的MassARRAY平臺（美國Sequenom公司）上的EpiTYPER方法定量檢測基因啟動子甲基化，嚴格按儀器和試劑（內(nèi)附陰、陽性質(zhì)控）說明書進行操作。引物由平臺內(nèi)部程序設(shè)計并合成。結(jié)果判讀：基因啟動子甲基化結(jié)果由儀器直接輸出。癌組織與癌旁組織基因啟動子甲基化存在差異的篩選條件：（1）陽性質(zhì)控＞0.7，陰性質(zhì)控＜0.5；（2）依據(jù)廠商提供的資料，癌組織基因啟動子甲基化水平均值與癌旁組織的差值應(yīng)≥0.20。用癌組織基因啟動子甲基化檢測值-癌旁組織基因啟動子甲基化檢測值的差值（Δ）表示結(jié)直腸癌患者癌組織基因啟動子甲基化水平相對于癌旁組織的差異。根據(jù)MassARRAY平臺的檢測值，以癌組織與癌旁組織的差值≥0.20為陽性。

1.3.5 與TCGA數(shù)據(jù)庫的比對分析 將篩選出的基因與TCGA數(shù)據(jù)庫進行比對，查詢相關(guān)基因的表達及啟動子甲基化情況。

1.3.6 SEPT9基因啟動子甲基化檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測SEPT9基因啟動子甲基化，試劑盒（熒光探針法）購自博爾誠（北京）科技有限公司，檢測儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。嚴格按儀器和試劑盒（內(nèi)附ACTB作為內(nèi)參引物）說明書操作。結(jié)果判讀：SEPT9啟動子甲基化水平結(jié)果由循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）計算而來，計算公式[6]為：ΔΔCt組織=ΔCt組織-ΔCt內(nèi)參；ΔCt組織=Ct組織ACTB-Ct組織SEPT9；ΔCt參照品=Ct參照品ACTBCt參照品SEPT9；式中參照品為陽性對照品，ΔΔCt組織為組織基因啟動子甲基化水平，2ΔΔCt癌組織-ΔΔCt癌旁組織為癌組織相對于癌旁組織基因啟動子甲基化水平的差異，參考值取5，以2ΔΔCt癌組織-ΔΔCt癌旁組織＞5為SEPT9基因啟動子甲基化陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，2個配對組之間比較采用Wilcoxon W符號秩和檢驗，2個獨立組之間比較采用 Mann-Whitney U秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織SorCS1基因和CASR基因啟動子甲基化水平比較

采用MassARRAY平臺檢測結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織KHDRBS2、CNTN1、IRF4、ARHGAP20、NDRG4、GFRA1、CPEB1、NPY、CRHR2、SorCS1、PTPRT、CASR基因啟動子甲基化水平。癌組織SorCS1基因和CASR基因啟動子甲基化水平均顯著高于癌旁組織（P＜0.001），其他基因不符合篩選條件予以剔除。見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織SorCS1基因和CASR基因啟動子甲基化水平比較

2.2 與TCGA數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果

與TCGA數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果顯示，膀胱尿路上皮癌、宮頸鱗狀細胞癌、結(jié)腸腺癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、直腸腺癌、胃腺癌患者的SorCS1基因相對表達量均低于正常對照者（P＜0.05），結(jié)腸癌、直腸癌、肺腺癌患者SorCS1基因啟動子甲基化水平均明顯高于正常對照者（P＜0.05），見圖2。結(jié)直腸癌患者和正常對照者CASR基因相對表達量均較低（TPM＜1），且兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），TCGA數(shù)據(jù)庫中無CASR基因啟動子甲基化的數(shù)據(jù)。

圖2 SorCS1基因啟動子甲基化水平分析比較

2.3 癌組織與癌旁組織SEPT9基因啟動子甲基化水平比較

結(jié)直腸癌組織SEPT9基因啟動子甲基化水平均顯著高于癌旁組織（P＜0.001）。見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織SEPT9基因啟動子甲基化水平的比較

2.4 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織SorCS1、CASR、SEPT9基因啟動子甲基化水平差異比較

Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者ΔSorCS1基因和SEPT9基因啟動子甲基化水平分別高于Ⅰ～Ⅱ期患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），而不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑的患者之間ΔSorCS1基因和SEPT9基因啟動子甲基化水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者之間ΔCASR基因差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者之間SorCS1基因、CASR基因、SEPT9基因啟動子甲基化水平比較

續(xù)表2

2.5 結(jié)直腸癌患者癌組織SorCS1基因與SEPT9基因啟動子甲基化陽性率比較

SorCS1基因啟動子甲基化陽性率為82.35%（14/17），SEPT9基因啟動子甲基化陽性率為70.58%（12/17），兩者聯(lián)合檢測陽性率為88.24%（15/17）。

3 討論

結(jié)直腸癌是由多基因突變和表觀遺傳改變等致病機制逐漸積累和相互作用引起的?；蚣谆悄壳把芯孔顬樯钊氲谋碛^遺傳學現(xiàn)象，若局部出現(xiàn)高甲基化，會導致基因組極不穩(wěn)定，最終誘發(fā)腫瘤。有研究結(jié)果顯示，異常甲基化導致的基因表達下調(diào)與結(jié)腸組織從良性到惡性病變的病理發(fā)展過程密切相關(guān)[7]。目前，SEPT9基因啟動子甲基化檢測在結(jié)直腸癌的篩查與臨床診療中已被廣泛應(yīng)用[8-9]，而SorCS1基因啟動子甲基化與腫瘤的關(guān)系還鮮有報道。SorCS1是神經(jīng)元受體運輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可結(jié)合多種特異性配體完成營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導調(diào)控、中樞系統(tǒng)代謝控制等生理過程[10-11]。SorCS1的表達水平與阿爾茨海默病[12]、2型糖尿病[13]及慢性腎臟疾病[14]等有關(guān)。

本研究通過MassARRAY平臺檢測結(jié)直腸癌患者癌組織與癌旁組織KHDRBS2、CNTN1、IRF4、ARHGAP20、NDRG4、GFRA1、CPEB1、NPY、CRHR2、SorCS1、PTPRT、CASR基因啟動子甲基化水平，篩選后發(fā)現(xiàn)癌組織SorCS1基因和CASR基因啟動子甲基化水平均顯著高于癌旁組織（P＜0.001）。與TCGA數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)，膀胱尿路上皮癌、宮頸鱗狀細胞癌、結(jié)腸腺癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、直腸腺癌、胃腺癌患者的SorCS1基因相對表達量低于正常對照者（P＜0.05），而在結(jié)腸癌、直腸癌、肺腺癌中SorCS1基因啟動子甲基化水平明顯高于正常對照者（P＜0.05）。提示SorCS1基因啟動子甲基化水平的升高可能影響了SorCS1基因的表達，這與HUANG等[15]SorCS1 mRNA和蛋白表達的缺失與相應(yīng)啟動子甲基化高度相關(guān)（P＜0.001、P=0.033）的研究結(jié)果一致。

SorCS1是VPS10結(jié)構(gòu)域受體家族5個成員之一，另外4個成員分別為Sortilin、SorCS2、SorCS3和SorLA。既往研究發(fā)現(xiàn)，VPS10P的受體Sortilin增強了乳腺癌細胞的侵襲作用[16]，還可促進卵巢癌細胞的增殖[17]。有研究結(jié)果顯示，SorCS2在生存率較低的結(jié)直腸癌患者中表達上調(diào)[18]，而胃癌患者中SorCS3呈高甲基化[19]。雖然目前尚未完全了解VPS10結(jié)構(gòu)域受體家族的5個成員在腫瘤中的作用機制，但結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果，推測該家族在腫瘤的發(fā)展中可能具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者SorCS1基因和SEPT9基因啟動子甲基化水平分別高于Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑的患者之間癌組織與癌旁組織SorCS1基因和SEPT9基因啟動子甲基化水平的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而不同臨床病理特征的結(jié)直腸癌患者之間CASR基因啟動子甲基化水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示SorCS1基因可能與結(jié)直腸癌的進展有關(guān)。雖然SorCS1在腫瘤中的功能還不明確，但一些SorCS1相關(guān)基因，如STAT3、PDGF-BB、AMPARs和突觸蛋白神經(jīng)素已被證明與腫瘤發(fā)展有關(guān)[20-21]。在對SorCS1基因下游機制的研究中，LARSEN等[22]發(fā)現(xiàn)，SorCS1基因表達的降低減少了HEK-293細胞中磷酸化信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3的生成。雖然SorCS1可以抑制某些細胞中的促癌因子，但還需要更深入的研究來闡明SorCS1在結(jié)直腸癌中的功能和潛在機制。

本研究結(jié)果還顯示，SorCS1基因啟動子甲基化陽性率高于SEPT9基因啟動子甲基化陽性率，與李丹等[23]的Meta分析結(jié)果基本相符，且SorCS1基因聯(lián)合SEPT9基因啟動子甲基化檢測可提高對結(jié)直腸癌的檢測陽性率?；騿幼蛹谆鳛檩o助分子分期參數(shù)可用于區(qū)分國際抗癌聯(lián)盟（the Union for International Cancer Control，UICC）分期和 TNM分期，與目前所用的TNM分期系統(tǒng)結(jié)合，可有效提高現(xiàn)有治療方案的效率[24]。

本研究的不足之處在于樣本量較小，尚需要多中心大樣本量研究來進一步驗證SorCS1基因啟動子甲基化在結(jié)直腸癌中的作用，并更深入地研究SorCS1影響結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的具體機制。

綜上所述，SorCS1基因啟動子甲基化檢測在結(jié)直腸癌患者中有較高的陽性率，且可與SEPT9基因啟動子甲基化檢測形成互補，或可作為結(jié)直腸癌篩查潛在的分子標志物。

致謝：感謝上海吉凱醫(yī)學檢驗所有限公司遲連凱博士對本研究的支持與幫助。