龔志贇，江銘磊，施衛(wèi)忠，盧仁泉，郭 林

（復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032）

2020年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在我國(guó)全部惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌的發(fā)病率居第2位，病死率居第5位，新發(fā)病例55.5萬(wàn)，死亡病例28.6萬(wàn)[1]。大部分結(jié)直腸癌患者被確診時(shí)已處于中晚期，療效及預(yù)后均較差。早期篩查、早期診斷并進(jìn)行適當(dāng)干預(yù)能將結(jié)直腸癌患者的存活率提高至75%～90%[2-3]。目前，腸鏡活檢是腸癌早期診斷常用的方法，也是“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，但有一定漏檢率，并且這是一種侵入性的檢查，有腸穿孔、出血、感染等風(fēng)險(xiǎn)。糞便隱血試驗(yàn)（fecal immunochemical test，F(xiàn)IT）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）檢測(cè)是除腸鏡外常用的結(jié)直腸癌篩查方法，但FIT易受干擾，假陽(yáng)性率高[4]；CEA、CA19-9特異性低，一般用于療效監(jiān)測(cè)[5]。因此，尋找一種高敏感性、高特異性的非侵入性結(jié)直腸癌篩查和診斷方法顯得尤為重要。結(jié)直腸癌早期會(huì)發(fā)生異常甲基化，相關(guān)甲基化標(biāo)志物陸續(xù)被報(bào)道，有研究結(jié)果顯示，黏結(jié)蛋白聚糖2（syndecan 2，SDC2）參與腫瘤細(xì)胞活化、腫瘤血管生成及侵襲、轉(zhuǎn)移[6]。本研究擬探討SDC2基因甲基化、CEA、CA19-9在結(jié)直腸癌中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年5月—2021年10月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診的結(jié)直腸癌患者51例（結(jié)直腸癌組），其中男25例、女26例，年齡40～75歲。結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2020年版）》[7]，TNM分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)結(jié)直腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[8]。選取同期復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診的結(jié)直腸腺瘤患者22例（腺瘤組），其中男12例、女10例，年齡40～60歲。結(jié)直腸腺瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國(guó)早期結(jié)直腸癌篩查及內(nèi)鏡診治指南（2014年，北京）》[9]。另選取同期復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院健康體檢者39名作為正常對(duì)照組，其中男19名、女10名，年齡35～60歲，腸鏡結(jié)果均無(wú)明顯異常。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 初診患者，有明確的病理診斷，腸鏡檢查前有SDC2基因甲基化、CEA、CA19-9的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并其他腫瘤的患者，進(jìn)行過(guò)放化療及全身治療的患者，妊娠期女性，病理診斷不明確的患者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 收集所有患者治療前及正常對(duì)照者體檢當(dāng)日糞便樣本，采用糞便采集裝置（廣州康立明生物科技股份有限公司）采集4.5 g糞便，放入配套的糞便保護(hù)液中，用于后續(xù)檢測(cè)。在收集糞便樣本的同時(shí)采集所有對(duì)象的靜脈血4 mL，4 h內(nèi)離心分離血清，-20 ℃保存，2周內(nèi)完成血清CEA、CA19-9檢測(cè)。

1.3.2 P12全自動(dòng)樣本預(yù)處理儀與手工法的比對(duì) 隨機(jī)選取26份結(jié)直腸癌患者、結(jié)直腸腺瘤患者和正常對(duì)照者的糞便樣本，每份樣本均分為2份，1份采用P12全自動(dòng)樣本預(yù)處理儀進(jìn)行預(yù)處理，1份采用手工法預(yù)處理，分別檢測(cè)。采用2-ΔCt法計(jì)算26例比對(duì)樣本的糞便SDC2基因相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=CtSDC2-Ctβ-actin。比較2種處理方法檢測(cè)結(jié)果的一致性。

1.3.3 糞便SDC2基因甲基化檢測(cè) 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)SDC2基因甲基化，試劑盒（批號(hào)：CSD12210603）購(gòu)自廣州康立明生物科技股份有限公司，檢測(cè)儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑說(shuō)明書操作。

1.3.4 血清CEA、CA19-9水平檢測(cè) 采用cobas e 801全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑檢測(cè)血清CEA、CA19-9水平。嚴(yán)格按儀器和試劑說(shuō)明書操作。

1.3.5 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn) 糞便SDC2基因甲基化以循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）≤38為陽(yáng)性，CEA和CA19-9均以高于參考區(qū)間上限（5.2 ng/mL、29 U/mL）為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Kruskal Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用二元 Logistic回歸分析建立各項(xiàng)指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)方程，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的效能。采用Peason相關(guān)分析評(píng)估2種方法之間的相關(guān)性，采用kappa檢驗(yàn)分析2種方法的一致性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組、腺瘤組及正常對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性率比較

結(jié)直腸癌組糞便SDC2基因甲基化陽(yáng)性率顯著高于腺瘤組和正常對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)腸癌組糞便SDC2基因甲基化陽(yáng)性率顯著高于血清CEA和CA19-9的陽(yáng)性率（P＜0.01）。見表1。

結(jié)直腸癌Ⅰ～Ⅳ期患者之間糞便SDC2基因甲基化陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)直腸癌Ⅰ～Ⅲ期患者的糞便SDC2基因甲基化陽(yáng)性率顯著高于血清CEA和CA19-9的陽(yáng)性率（P＜0.01）。見表1。

表1 結(jié)直腸癌組、腺瘤組及正常對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性率比較 例（%）

2.2 糞便SDC2基因甲基化、血清CEA、CA19-9單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的效能

糞便S D C 2基因甲基化及血清C E A和CA19-9的聯(lián)合檢測(cè)方程為：Logit（P）=1.02×SDC2+0.14×CEA+0.01×CA19-9。ROC曲線分析結(jié)果顯示，糞便SDC2基因甲基化、血清CEA、CA19-9單項(xiàng)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.965、0.694、0.567、0.976。見圖1、表2。

表2 糞便SDC2基因甲基化、血清CEA、CA19-9單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線參數(shù)

圖1 糞便SDC2基因甲基化、血清CEA、CA19-9單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

2.3 結(jié)直腸癌組糞便SDC2基因甲基化與血清CEA聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率分析

將腺瘤組和正常對(duì)照組合并為對(duì)照組（61例），糞便SDC2基因甲基化和血清CEA聯(lián)合檢測(cè)可將結(jié)直腸癌組的陽(yáng)性率從84.3%（糞便SDC2基因甲基化單項(xiàng)檢測(cè)）提升至90.2%（糞便SDC2基因甲基化+CEA），顯著高于CEA的陽(yáng)性率（P＜0.01）。見表3。

表3 結(jié)直腸癌組與對(duì)照組血清CEA水平及糞便SDC2基因甲化、血清CEA單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率比較

2.4 P12自動(dòng)化樣本預(yù)處理儀與手工法預(yù)處理樣本糞便SDC2基因相對(duì)表達(dá)量比較

分別采用P12自動(dòng)化樣本預(yù)處理儀與手工法同時(shí)對(duì)26份糞便樣本進(jìn)行預(yù)處理。2種方法糞便SDC2基因相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.994，P＜0.001），一致性良好（kappa=0.845，P＜0.001）。見圖2。

圖2 P12自動(dòng)化樣本預(yù)處理儀與手工法預(yù)處理樣本SDC2基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性

3 討論

基因甲基化檢測(cè)是目前臨床應(yīng)用前景較廣的腫瘤篩查方法，在發(fā)達(dá)國(guó)家已開展多年[10]。目前，采用腸鏡取樣進(jìn)行組織病理學(xué)檢查依然是診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但其缺點(diǎn)也很明顯，特別是侵入性操作會(huì)導(dǎo)致較多結(jié)直腸癌患者無(wú)法堅(jiān)持定期檢查，錯(cuò)失了早期診斷時(shí)機(jī)，降低了結(jié)直腸癌患者的生存率[11]。臨床上常用的非侵入性檢查項(xiàng)目為血清CEA、CA19-9，但兩者的敏感性和特異性不高，更適用于結(jié)直腸癌患者的療效監(jiān)測(cè)[12]。因此，臨床亟需一種無(wú)創(chuàng)且敏感性和特異性均較高的方法來(lái)篩查、診斷結(jié)直腸癌，特別是早期結(jié)直腸癌[13-14]。為此，本研究探討了糞便SDC2基因甲基化在結(jié)直腸癌輔助診斷中的價(jià)值。

SDC2屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β通路相關(guān)基因，其與免疫監(jiān)控及細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)；在結(jié)直腸癌中，SDC2主要調(diào)節(jié)細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用，使基質(zhì)金屬蛋白酶活化，分解細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)還參與了間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化過(guò)程等生物學(xué)進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，SDC2基因甲基化與結(jié)直腸癌關(guān)系密切，有良好的應(yīng)用前景[17]。本研究結(jié)果顯示，糞便SDC2基因甲基化診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.965，最佳臨界值（Ct值）為-38.1，敏感性為88.2%，敏感性顯著優(yōu)于目前臨床常用指標(biāo)（CEA和CA19-9）。提示將糞便SDC2基因甲基化用于結(jié)直腸癌篩查具有良好的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果還顯示，結(jié)直腸癌Ⅰ～Ⅳ期患者糞便SDC2基因甲基化的陽(yáng)性率分別為70%、85%、90%、94%，各分期間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；結(jié)直腸癌Ⅰ～Ⅲ期患者糞便SDC2基因甲基化陽(yáng)性率顯著高于血清CEA和CA19-9的陽(yáng)性率（P＜0.01）。提示糞便SDC2基因甲基化檢測(cè)在早期結(jié)直腸癌的篩查中有較好的應(yīng)用價(jià)值。這可能與SDC2參與了腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。另外，糞便SDC2基因甲基化聯(lián)合CEA檢測(cè)可將陽(yáng)性率提升至90.2%，有效提升了結(jié)直腸癌的檢出率。

為了提升糞便SDC2基因甲基化的檢測(cè)效率，本研究對(duì)P12自動(dòng)化樣本預(yù)處理儀與手工法預(yù)處理樣本的效果進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果顯示2種方法預(yù)處理樣本的檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)（r=0.994，P＜0.001），一致性良好（kappa=0.845，P＜0.001）。提示自動(dòng)化樣本預(yù)處理可以取代人工預(yù)處理，在樣本量較大的情況下，采用自動(dòng)化儀器預(yù)處理樣本更快速，且更加規(guī)范，不宜出錯(cuò)和污染，有助于提升檢測(cè)效率。

本研究的不足之處在于樣本量較小，這可能與用于SDC2基因甲基化檢測(cè)的糞便樣本留取方式與一般糞常規(guī)不同，患者尚需要一個(gè)接受過(guò)程有關(guān)。相信隨著更廣泛的宣傳和患者接受度的提高，糞便SDC2基因甲基化檢測(cè)無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)將會(huì)進(jìn)一步體現(xiàn)。

綜上所述，糞便SDC2基因甲基化具有較高的敏感性，可用于結(jié)直腸癌的輔助診斷，在早期結(jié)直腸癌的篩查中也有較高的臨床價(jià)值，具有良好的臨床應(yīng)用前景。