孫小丹，許 靜，劉鷖雯，何怡青，杜 艷，張國良，高 鋒，楊翠霞

（1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200233；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200233）

骨肉瘤是一種罕見的間充質(zhì)惡性腫瘤，具有較強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，有80%～90%的患者在首次確診時(shí)即伴有潛在轉(zhuǎn)移灶[1]。單純手術(shù)截肢治療的患者5年生存率低于20%[2]?；熆娠@著提高患者的預(yù)期壽命，目前臨床上多采用手術(shù)切除和聯(lián)合化療的治療方案治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者[3]。然而，大劑量的化療藥物副作用較多，已成為影響治療效果及預(yù)后的關(guān)鍵因素[4]。雌激素受體（estrogen receptor，ER）與腫瘤細(xì)胞的生長、耐藥及轉(zhuǎn)移能力均密切相關(guān)[5]。除性激素依賴的靶器官腫瘤外，ER還表達(dá)于胃癌、結(jié)腸癌、肺癌及骨腫瘤等惡性腫瘤中[6]。有研究結(jié)果顯示，調(diào)控ER的表達(dá)水平或活性可有效改變雌激素/ER依賴的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[7]，進(jìn)而影響腫瘤的藥物敏感性、生長特性等。目前，臨床上針對ER的選擇性ER調(diào)節(jié)劑有他莫昔芬、雷洛昔芬、巴多昔芬等，其中他莫昔芬可作為化療增敏劑，增強(qiáng)ER陽性腫瘤患者對化療藥物的敏感性[8]；巴多昔芬可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)耐藥性[9]。目前，針對選擇性ER調(diào)節(jié)劑是否可有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖及腫瘤進(jìn)展、調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞炎癥因子釋放的研究較少。為此，本研究擬探討骨肉瘤細(xì)胞中ER的表達(dá)量及選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬對骨肉瘤細(xì)胞增殖和炎癥因子表達(dá)的影響，同時(shí)分析他莫昔芬對骨肉瘤細(xì)胞CC趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）2表達(dá)的影響，為選擇性ER調(diào)節(jié)劑在骨肉瘤治療中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人成骨細(xì)胞系hFOB1.19和人骨肉瘤細(xì)胞系143B購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，人骨肉瘤細(xì)胞系U-2OS購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。hFOB1.19細(xì)胞采用含10%胎牛血清、0.3 mg/mL G418、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM），在33.5 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。143B細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞均采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM，在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。細(xì)胞密度為70%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法分別檢測加入10 μmol/L二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；上海澤邁生物技術(shù)有限公司）（DMSO組）、10 μmol/L 17β-雌二醇（estradiol，E2；美國MedChem Express公司）（E2組）和10 μmol/L他莫昔芬（美國MedChem Express公司）（他莫昔芬組）48 h后的細(xì)胞存活情況，CCK-8試劑盒購自美國Promega公司。將143B細(xì)胞或U-2OS細(xì)胞按3 000個(gè)/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加入10 μmol/L他莫昔芬和10 μmol/L E2，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL CCK-8試劑，37 °C孵育2 h。采用Epoch酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）檢測吸光度（A）值。

1.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將143B細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞以800 個(gè)/孔接種于6孔板中，加入10 μmol/L DMSO（DMSO組）、10 μmol/L E2（E2組）和10 μmol/L他莫昔芬（他莫昔芬組），培養(yǎng)2周，直到形成肉眼可見的克隆后，采用4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞20 min；去除固定液，用1×磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌3次，再用 0.05%結(jié)晶紫溶液染色20 min，使用 1×PBS 洗滌后風(fēng)干。拍照并記錄所形成的細(xì)胞克隆數(shù)目。

1.4 免疫印跡法

采用RIPA裂解液（上海碧云天公司）裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解物上清液，提取總蛋白。采用蛋白定量試劑盒（美國Sigma公司）測定總蛋白濃度。吸取10 μg蛋白，加入蛋白上樣緩沖液（上海碧云天公司），置于100 ℃水浴鍋孵育10 min。采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，然后用含5%脫脂奶粉的三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液（tris-hydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）封閉1 h，加入一抗，4 °C下孵育過夜。一抗為磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pPKB；又稱pAkt ）308抗體（貨號13038T）、pAkt473抗體（貨號4060T）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）抗體（貨號4695）和磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinase，pERK）抗體（貨號4370P），均購自美國Cell Signaling Technology公司。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆二抗（杭州聯(lián)科生物公司）孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光底物，采用Amersham Imager 600掃描成像系統(tǒng)（美國GE healthcare Bio-Sciences AB公司）分析。以3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，使用Image Pro-Plus 6.0軟件（美國 Media Cybernetics 公司）對圖像灰度進(jìn)行分析。

1.5 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

將30 000個(gè)143B細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加入10 μmol/L他莫昔芬和10 μmol/L E2，培養(yǎng)48 h。采用RNAiso Plus（日本TaKaRa公司）從143B細(xì)胞中提取總RNA。采用NanoDrop系統(tǒng)（美國ThermoFisher Scientific公司）測定RNA濃度。采用含gDNA Eraser（日本TaKaRa公司）的PrimeScript T Reagent試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1 μg mRNA。采用熒光定量PCR檢測IL-6、IL-8、TGF-β、CCL2和CCL5基因表達(dá)，SYBR試劑盒購自日本TaKaRa公司，檢測儀器為QuantStudio 7 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。引物由上海擎科生物有限公司合成，引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.6 細(xì)胞上清的收集及CCL2水平檢測

將143B細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞分別接種于24孔板中，加入500 μL培養(yǎng)液，再分別加入10 μmol/L E2（E2組）和10 μmol/L 他莫昔芬（他莫昔芬組），處理3 d，設(shè)相應(yīng)的空白對照（DMSO組）。收集培養(yǎng)上清，離心去除細(xì)胞沉淀，保存于-20 ℃冰箱。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測143B細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞培養(yǎng)上清中的CCL2水平。試劑盒購自上海森雄有限公司，最低檢測限為63 pg/mL，線性范圍125～8 000 pg/mL，批間變異系數(shù)＜15%，批內(nèi)變異系數(shù)＜10%，標(biāo)準(zhǔn)曲線r2值為0.999 3。檢測儀器為Epoch酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次。采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞ER mRNA的表達(dá)

2種骨肉瘤細(xì)胞（143B和U-2OS）的ER mRNA相對表達(dá)量均顯著低于成骨細(xì)胞（hFOB1.19）。見圖1。

圖1 骨肉瘤細(xì)胞（143B和U-2OS）和成骨細(xì)胞（hFOB1.19）ER mRNA表達(dá)比較

2.2 選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬對骨肉瘤細(xì)胞生長的抑制作用

143B細(xì)胞的CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與DMSO組比較，他莫昔芬組細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05），E2組細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。U-2OS細(xì)胞的CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，他莫昔芬組和E2組細(xì)胞數(shù)均低于DMSO組（P＜0.05）。免疫印跡法結(jié)果顯示，與DMSO組比較，他莫昔芬組pAkt和pERK水平顯著降低（P＜0.05），E2組pAkt和pERK水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響

2.3 選擇性ER調(diào)節(jié)劑對骨肉瘤細(xì)胞143B分泌炎癥因子的抑制作用

他莫昔芬可顯著抑制143B細(xì)胞IL-6、IL-8、TGF-β、CXCL1、CCL2和CCL5基因表達(dá)，其中對CCL2表達(dá)的抑制作用最為顯著。見圖3。

圖3 選擇性ER調(diào)節(jié)劑對骨肉瘤細(xì)胞143B炎癥因子表達(dá)的抑制作用

2.4 選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬對骨肉瘤細(xì)胞（143B和U-2OS）CCL2分泌的抑制作用

他莫昔芬組2種骨肉瘤細(xì)胞（143B和U-2OS）CCL2的分泌量顯著低于DMSO組（P＜0.05），而E2組CCL2的分泌量顯著高于DMSO組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 DMSO、E2和他莫昔芬對骨肉瘤細(xì)胞（143B和U-2OS）CCL2分泌的影響

3 討論

骨肉瘤是高度異質(zhì)性的間充質(zhì)腫瘤，臨床上多采用手術(shù)切除及術(shù)后化療[1]進(jìn)行治療，但大劑量使用化療藥物副作用較多[4]，且骨肉瘤患者的5年總體生存率不理想，復(fù)發(fā)率較高[10]，臨床亟需更好的治療方案。本研究結(jié)果顯示，選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖及CCL2表達(dá)，提示選擇性ER調(diào)節(jié)劑可作為骨肉瘤切除術(shù)后化療的輔助方案，可能對改善骨肉瘤患者的預(yù)后及遠(yuǎn)期生存率具有積極意義。

骨肉瘤好發(fā)于兒童和青少年，此階段正是性激素分泌最活躍的時(shí)期。有研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤組織及細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)ER呈低表達(dá)[11]；另有研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤的發(fā)生可能與ER的水平及活性有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤細(xì)胞143B和U-2OS的ER表達(dá)量顯著低于成骨細(xì)胞hFOB1.19（P＜0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道[13]一致。

選擇性ER調(diào)節(jié)劑（他莫昔芬等）目前已被廣泛用于ER陽性乳腺癌的內(nèi)分泌治療，且療效良好[14]。選擇性ER調(diào)節(jié)劑可抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[15]，而在骨組織、心血管系統(tǒng)中，選擇性ER調(diào)節(jié)劑則作為ER激動劑發(fā)揮作用[16]。本研究結(jié)果顯示，E2和他莫昔芬均可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，且他莫昔芬的抑制作用更強(qiáng)，提示他莫昔芬可作為骨肉瘤化療的輔助方案。

在腫瘤微環(huán)境中，炎癥因子可促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[17]，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲和耐藥[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)創(chuàng)傷會導(dǎo)致腫瘤患者體內(nèi)炎癥因子水平升高[18]，升高的炎癥因子在腫瘤的休眠和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用[19]。CCL2作為趨化因子家族成員之一，是腫瘤微環(huán)境中重要的炎癥因子，可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[20]。CCL2在多種腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、骨肉瘤中呈異常表達(dá)[21]，其表達(dá)水平與患者的預(yù)后相關(guān)。

有研究結(jié)果顯示，選擇性ER調(diào)節(jié)劑可調(diào)控炎癥因子的分泌[9]，他莫昔芬可通過直接發(fā)揮抗氧化作用來減輕機(jī)體氧化應(yīng)激，從而緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)[20]。在子宮肌瘤治療過程中，他莫昔芬聯(lián)合米非司酮能顯著降低子宮肌瘤患者的炎癥反應(yīng)，從而抑制疾病進(jìn)展[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞中多種炎癥因子基因的表達(dá)，其中對CCL2基因的抑制作用最強(qiáng)。

綜上所述，骨肉瘤細(xì)胞ER呈低表達(dá)。選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬可明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖及CCL2的表達(dá)，可能對骨肉瘤患者的預(yù)后具有積極作用。