劉靜 李春霞 何巧玉 王譽程 石玉夢 劉二偉 陳曉鵬

摘要 目的：基于中藥質量標志物（Q-marker）的概念，建立高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，并測定2種成分的含量，同時應用網絡藥理學方法探討2種成分的潛在作用靶點進行反向篩選，從而確定黃芩藥材的質量標志物。方法：采用HPLC建立10批黃芩藥材的指紋圖譜，并進行含量測定。結合網絡藥理學分析有效成分的對應靶點和途徑并構建“活性成分-重要靶點-通路”，探究黃芩發(fā)揮藥理作用特點，預測出潛在的Q-marker。結果：建立的黃芩藥材指紋圖譜共標定12個共有峰，指認2個成分并確定其含量。10批樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.970?！盎衔?預測靶點”網絡篩選出8個關鍵靶點，相關9條通路，涉及到癌癥通路、炎癥通路、免疫通路等。結論：本研究所建立的HPLC準確、可行，篩選出2種成分可作為潛在Q-marker，以網絡藥理學驗證黃芩主成分相關的靶點作用機制，進一步確認黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷作為Q-marker的可行性，為黃芩質量控制提供參考。

關鍵詞 黃芩;質量標志物;高效液相色譜法;指紋圖譜;含量測定;黃芩苷;漢黃芩苷;網絡藥理學

Prediction of Q-markers for Radix Scutellariae Based on Fingerprint and Network Pharmacology

LIU Jing，LI Chunxia，HE Qiaoyu，WANG Yucheng，SHI Yumeng，LIU Erwei，CHEN Xiaopeng

（State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China）

Abstract Objective：Based on the concept of Q-marker，high performance liquid chromatography（HPLC） fingerprints were established for Radix Scutellariae and the content of two components was determined.Via network pharmacology，the potential targets of the two components were predicted for determining the Q-markers of the medicinal.Methods：The HPLC fingerprints of 10 batches of Radix Scutellariae were established，and the content of baicalin and wogonoside was determined.Based on network pharmacology，the targets of the active components and related pathways were analyzed and the “component-target-pathway” network was plotted.Thereby，pharmacological characteristics of Radix Scutellariae were clarified and the potential Q-markers were forecasted.Results：The fingerprints of Radix Scutellariae shared 12 peaks.Two of them were identified，namely，baicalin and wogonoside，and the content was determined.The fingerprints of the 10 batches of samples showed>0.970 similarity to the reference fingerprint.A total of 8 key targets which were involved in 9 pathways such as inflammation pathway，cancer pathway，and immune pathway，were screened out.Conclusion：The HPLC method is accurate and reliable，and two components can be used as potential Q-markers of Radix Scutellariae.The mechanism related to the principal components of Radix Scutellariae was further tested by network pharmacology，which confirmed that baicalin and wogonoside can be used as Q-markers of the medicinal.The result is expected to serve as a reference for quality control of Radix Scutellariae.

Keywords Radix Scutellariae; Quality marker; High performance liquid chromatography; Fingerprints; Determination of content; Baicalin; Wogonoside; Network pharmacology6CF65330-F464-4784-8903-A8464DAF226F

中圖分類號：R285;R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.001

中藥飲片作為中藥制藥的原材料，其質量的好壞直接關系到中醫(yī)臨床用藥的安全性與有效性，并直接影響到患者的健康甚至生命安全。確保中藥飲片質量的安全性和有效性極為重要。質量標志物（Q-marker）是中藥質量控制的新概念[1]，基于成分的特有性、可測性、有效性、質量傳遞與溯源及配伍環(huán)境5個方面，建立中藥飲片的Q-marker更加有利于中藥飲片的全面質量控制和追溯體系，從而提高反映飲片特異性的質量標準。

隨著系統(tǒng)生物學的興起，網絡藥理學作為一種新興的技術手段，從整體上探索藥物成分與疾病之間的關系，探討多成分-多靶點-多途徑治療相關疾病的作用機制，為中藥飲片質量控制的研究提供了新思路，以及為其深入發(fā)展奠定了理論基礎[2-3]。近年來，網絡藥理學方法已逐漸深入到中藥及復方中質量標志物有效性的研究[4-5]。

黃芩為唇形科植物黃芩[Scutellaria baicalensis（Georgi）]的干燥根，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎等的功效[6]?，F(xiàn)代研究證明，黃芩具有抗炎、抗菌、抗病毒等藥理作用[7-11]，是我國傳統(tǒng)使用的一種中藥?，F(xiàn)行2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定黃芩及其炮制品中黃芩苷含量不小于8.0%，其質量控制標準有進一步提升的空間。

因此，本實驗采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）建立了黃芩藥材的指紋圖譜，同時對其中黃芩苷、漢黃芩苷2種主要活性成分進行定量方法研究，并結合網絡藥理學方法進一步驗證2種主要活性成分的藥理作用機制，為黃芩的Q-marker發(fā)現(xiàn)和質量評價提供科學參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（安捷倫科技公司，美國，型號：1100）、電子天平（賽多利斯集團，德國，型號：MSA125P）、多功能粉碎機（永康市金穗機械制造廠，型號：800A）、調溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：DZTW）、Milli-Q超純水制備儀（上海默克化工技術有限公司，型號：IQ7005）、超聲波清洗機（天津知著科技有限公司，型號：ZZ-3200DTS）、渦旋振蕩器（賽默飛世爾科技有限公司，型號：G3KT18273）。

1.2 試劑 HPLC級色譜純甲醇（康科德科技有限公司，批號：UNI230）、HPLC級色譜純甲酸（ACS恩科化學，美國，批號：UN1779）、超純水、其他試劑均為分析純。黃芩苷對照品（成都德斯特生物技術有限公司，批號：DST200227-023）、漢黃芩苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq-00244），液相色譜法測定質量分數(shù)>98%。

1.3 分析樣品 本研究從全國各省和地區(qū)收集了10批黃芩樣品，并由天津中醫(yī)藥大學李先寬老師鑒定為唇形科植物黃芩[Scutellaria baicalensis（Georgi）]的干燥根。10批黃芩藥材相關信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-0.2%甲酸水（B），梯度洗脫（0～8 min，53%～59% A;8～13 min，59%～62% A;13～14 min，62%～95% A）;檢測波長：280 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;進樣量：5 μL;檢測器：紫外檢測器。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱量黃芩苷和漢黃芩苷對照品適量，加甲醇溶解，搖勻，配制得到每1 mL含黃芩苷0.5 mg、漢黃芩苷0.2 mg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 分別精密稱量黃芩粗粉（過4號篩）約3 g，加入480 mL的水，在1 000 mL電熱套中煎煮至約240 mL，冷卻至室溫，用紗布過濾，得到的濾液用水補足至240 mL，搖勻，濾過，即得黃芩水提液。精密量取濾液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，用水定容，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，獲得的續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液，以純水按一定比例稀釋制成一系列的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣分析，并記錄色譜圖。分別測定黃芩苷、漢黃芩苷的峰面積，將進樣量（X）對峰面積（Y）進行線性回歸并繪制標準曲線，以考察各有效成分在相應范圍內的線性關系是否良好。見表2。

2.5 定量限和檢測限 精密量取“2.2”項下的混合對照品溶液，用超純水逐步稀釋，按“2.1”項下的色譜條件進樣分析，其檢測限（Limit of Detection，LOD）為峰面積信噪比為3∶1（S/N=3）時的混合對照品溶液濃度，定量限（Limit of Quantitation，LOQ）為峰面積信噪比為10∶1（S/N=10）時的混合對照品溶液濃度。見表2。

2.6 精密度試驗 1）日內精密度：取黃芩樣品，依據“2.3”項下的方法制備得到供試品溶液，按“2.1”項下的儀器色譜條件連續(xù)進樣6次，并記錄色譜圖，計算供試品溶液中黃芩苷和漢黃芩苷的峰面積相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）分別為0.18%、0.22%，表明該儀器具有良好的精密度。2）日間精密度：取黃芩樣品，依據“2.3”項下的方法制備成供試品溶液，按“2.1”項下的儀器色譜條件連續(xù)進樣3 d，并記錄色譜圖，計算供試品溶液中黃芩苷和漢黃芩苷的峰面積RSD分別為0.36%、0.20%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取黃芩樣品，依據“2.3”項下的方法制備得到供試品溶液，并在室溫放置0，2，4，8，12，24 h，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖并計算供試品溶液中黃芩苷和漢黃芩苷的峰面積RSD分別為1.62%、0.49%，表明黃芩供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。6CF65330-F464-4784-8903-A8464DAF226F

2.8 重復性試驗 取黃芩樣品各6份，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液6份，再按“2.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄供試品溶液色譜圖中黃芩苷和漢黃芩苷的峰面積并計算其RSD分別為2.20%、0.56%，表明該方法具有良好的重復性。

2.9 回收率試驗 精密稱量已知含量的黃芩樣品粉末9份，各約3 g，置于1 000 mL量瓶中，分成3組，根據黃芩苷、漢黃芩苷的含量按約1∶0.8、1∶1、1∶1.2的量每組分別精密加入含有一定濃度的黃芩苷和漢黃芩苷的混合對照品溶液2.0，2.5，3.0 mL，按“2.2”項下的方法制備，按“2.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算得出黃芩苷和漢黃芩苷的平均加樣回收率分別為99.33%、99.40%及其RSD分別為1.55%、0.34%，均符合相關規(guī)定。見表3。

2.10 樣品測定結果

2.10.1 指紋圖譜的建立及相似度評價 精密稱取10批黃芩藥材粉末（過4號篩）各3 g，分別按照“2.3”項下的方法制備供試品溶液，依據“2.1”項下的色譜條件，進樣量為5 μL，并記錄各批次黃芩藥材的HPLC指紋圖譜。采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》軟件自動匹配10批次黃芩藥材HPLC色譜圖色譜峰的保留時間和峰面積等參數(shù)，以平均數(shù)法生成對照指紋圖譜，并將時間窗寬度設為0.1 min，最終提取黃芩藥材的共有模式，建立黃芩藥材指紋圖譜的疊加圖，比較分析10批樣品測定結果，總共標定了12個共有峰。見圖1～2。各色譜峰的分離較好，符合指紋圖譜檢測要求。通過與對照品比較，指認出2個成分，同時采用該系統(tǒng)作相似度評價，結果顯示此10批黃芩樣品間的相似度均大于0.970，表明各批黃芩藥材具有良好的一致性。

2.10.2 含量測定 取黃芩樣品10批，依據“2.3”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，基于外標法以峰面積計算得出黃芩苷、漢黃芩苷的含量范圍分別為122.495～181.274 mg/g，36.354～52.062 mg/g。見表4。

2.11 網絡藥理學研究

2.11.1 活性成分確定 通過“2.1”項下對黃芩進行定性鑒別和含量測定，并結合2020版《中華人民共和國藥典》，提示黃芩苷和漢黃芩苷可能作為黃芩潛在的Q-marker，因此選擇黃芩苷和漢黃芩苷2個主要特征成分作為其候選化合物。通過ChemSpider網站檢索化合物，下載化合物的2D結構式，并獲得相應化合物的SMILES式，用于化合物的靶點預測。相關信息見表5。

2.11.2 靶點預測及活性成分-靶點網絡的構建?? 將2個化合物的結構式分別輸入到Swiss Target Prediction數(shù)據庫，對其進行作用靶點的反向虛擬篩選，最后總共匹配得到127個潛在靶點。通過UniProt數(shù)據庫（https：//www.uniprot.org/）將獲得的黃芩活性成分所對應的靶點翻譯成相應的基因，并將所有靶點人源化。然后將化合物及相對應的基因導入Cytoscape 3.6.1軟件中，繪制出黃芩活性成分-靶點網絡。見圖3。該網絡共有129個節(jié)點，其中包括2個化學成分和127個靶點蛋白，構成136條化合物-靶點關系。在Cytoscape網絡中，與節(jié)點相連的路線條數(shù)可以用度來表示，度值越大，靶點與化合物之間的作用關系就越密切，也可能是化合物的關鍵靶標（人源靶點）。

2.11.3 靶蛋白質-蛋白質相互作用網絡及核心靶點篩選與結果 將黃芩的127個靶點導入String數(shù)據庫（https：//string-db.org/），并將物種限定為“Homo sapiens”以構建蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）關系，其中的一些蛋白與其他蛋白沒有相互關系，將不再在相互作用關系圖中反映，將數(shù)據導入Cytoscape軟件中構建PPI網絡圖。通過Degree一倍中位數(shù)值篩選得到16個關鍵基因，提示這些關鍵基因在黃芩藥理機制中發(fā)揮關鍵作用。見表6。

2.11.4 通路注釋和功能分析與結果 1）基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析：采用David v6.8數(shù)據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對黃芩127個靶基因進行了GO生物過程富集，GO注釋分為3大類，分別是：生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Components，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）。通過這3個功能，可以從多個方面定義和描述一個基因的功能，并以人類基因為背景，對黃芩的預測靶點進行GO富集分析（P<0.05）。見圖4。從結果來看，黃芩活性成分的作用靶點主要富集在一氧化氮生物合成過程的正調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、蛋白質磷酸化的正調控、血管內皮生長因子受體信號通路、細胞對缺氧的反應等生物過程中;在細胞組分方面，細胞表面、蛋白質復合物、線粒體、細胞質、核染色質占比相對較高;在分子功能方面，酶結合、相同蛋白質結合、一氧化氮合酶調節(jié)劑活性、生長因子受體結合、蛋白磷酸酶結合排在前列。見圖4。2）GO富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析與結果：使用David v6.8數(shù)據庫對黃芩的127個靶點進行KEGG信號通路富集，根據P<0.05從中篩選出前20條信號通路。包括癌癥蛋白多糖通路（Proteoglycans in Cancer）、癌癥通路（Pathways in Cancer）、雌激素信號通路（Estrogen Signaling Pathway）、膀胱癌（Bladder Cancer）、前列腺癌（Prostate Cancer）、癌癥miRNAs通路（MicroRNAs in Cancer）、PI3K-AKT信號通路（PI3K-AKT Signaling Pathway）、乙型肝炎（Hepatitis B）、丙型肝炎（Hepatitis C）、TNF信號通路（TNF Signaling Pathway）、NOD樣受體信號通路（NOD-like Receptor Signaling Pathway）、黏著斑（Focal Adhesion）、VEGF信號通路（VEGF Signaling Pathway）等。表明這127個靶點可能主要通過調節(jié)這些途徑來干預疾病。見圖5。6CF65330-F464-4784-8903-A8464DAF226F

2.11.5 成分-靶點-通路網絡構建與結果 將定量獲得黃芩的2個活性成分、16個核心作用靶點、9條主要信號通路運用Cytoscape 3.6.1軟件構建“成分-靶點-通路”網絡，通過該網絡圖進行可視化展示。從網絡圖中可知共有27個節(jié)點，74條邊。節(jié)點的大小表示Degree值的大小，節(jié)點越大表示Degree值越大。以度為參考，發(fā)現(xiàn)MAPK3、EGFR、TP53、VEGFA、MMP9、PTGS2等的靶點與以P<0.05篩選得出的前9條信號通路具有較高的連接度，提示這些可能是黃芩苷和漢黃芩苷發(fā)揮藥理作用的潛在關鍵作用靶點。見圖6。

3 討論

藥物靶點被認為是體內藥物的作用結合位點，包括生物大分子，如基因位點、酶、受體、離子通道、核酸等，因此選擇和確定有效的新藥物靶標對開發(fā)新藥具有重要的意義。黃芩靶點PPI網絡分析表明TP53、VEGFA、HSP90AA1、MAPK3、src、EGFR等可能是黃芩抗炎，抗癌，抗氧化，抗病毒的關鍵靶點。其中TP53是公認的重要的抑癌基因，被用作胃癌的超早期篩查基因[12]。與黃芩抗癌作用關系密切。血管內皮生長因子A（Vascular Endothelial Growth FactorA，VEGFA）作為目前活性最強、特異性最高的腫瘤血管相關生長因子，它在腫瘤及非腫瘤的病理過程中廣泛表達，并受細胞因子，局部缺血和缺氧的影響[13]。這與臨床研究黃芩對腫瘤細胞的抑制作用相符。熱激蛋白（Heat Shock Protein，HSP）是一種細胞伴侶蛋白，可以通過維持細胞成活的相應蛋白的結構和功能完整性來調節(jié)細胞的成活、增殖與凋亡[14]。研究表明HSP90可以抑制細胞凋亡、調節(jié)細胞分裂并促成血管生成等作用[15]，已有報道HSP90在肺癌、肝癌和其他腫瘤組織中表達增加。結果證實，黃芩亦用于抑制癌細胞的增殖。促分裂原活化的蛋白激酶（Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK）在由細胞外刺激（炎癥介質或物理刺激等）引起的細胞級聯(lián)反應中發(fā)揮著重要作用，并且能夠使多種蛋白質磷酸化。src屬于蛋白酪氨酸激酶家族的成員之一的原癌基因，有研究表明，高度活化的src基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有很強的細胞轉化作用，并促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，是導致許多腫瘤惡性增加的關鍵因素之一[16]。表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR），同時也是TGF-α受體，故推測黃芩的活性成分可能與EGFR相互作用，阻斷炎癥介質和EGFR的結合來發(fā)揮抗炎作用，增強細胞免疫功能，并且與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[17]。

GO富集分析和KEGG通路注釋分析的結果顯示，黃芩的2個主要活性成分靶點主要通過包含癌癥信號通路（Proteoglycans in Cancer、Pathways in Cancer、Bladder Cancer、Prostate Cancer、MicroRNAs in Cancer）、炎癥信號通路（TNF Signaling Pathway、PI3K-AKT Signaling Pathway）、免疫信號通路（Hepatitis B、Hepatitis C）、細胞增殖信號通路（MAPK Signaling Pathway）等發(fā)揮其抗癌、抗炎、免疫抑制等作用。

網絡藥理學實驗為驗證成分的有效性，分析所選取的Q-marker成分與黃芩藥材臨床功效是否一致。如果一致性較高，則對標志物的質量控制能有效體現(xiàn)黃芩藥材的整體質量?；诰W絡藥理學的結果，所篩選得到的靶點和通路與黃芩抗炎、抗癌、抗氧化、抗病毒和免疫調節(jié)的藥理作用一致[18-20]，說明了標志物選取的合理性。

本實驗基于Q-marker的“五原則”，即為特有、可測、有效、傳遞及配伍，通過建立黃芩的指紋圖譜，采用高效液相色譜法鑒別黃芩水煎液成分，并確定其主要成分的含量，尋找到黃芩可能的Q-marker，體現(xiàn)出中藥質量的可測性，之后結合網絡藥理學的方法從有效性方面對2種標志物的擬作用靶點進行反向篩選，成功地預測了黃芩發(fā)揮作用的靶點，發(fā)現(xiàn)黃芩可以通過多種成分作用于多個靶點，涉及肝臟、腎臟、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多種疾病，這與黃芩瀉火解毒、止血安胎的傳統(tǒng)功效相契合，與其現(xiàn)代藥理活性實驗研究基本一致[21-22]。之后經過對其靶點信號通路進行富集分析，發(fā)現(xiàn)了9條相關的信號途徑，表明了黃芩的化學成分具有多靶點多通路的藥理作用特征。

中藥質量的評價與質量控制對中藥的安全性和有效性具有直接的影響，建立相應的質量標準，做好中藥材的質量控制至關重要。本研究旨在建立一個尋找藥材質控指標的方法：首先建立指紋圖譜用于評價藥材質量的共性，然后用Q-marker的理念找尋特征性潛在標志物，最后結合網絡藥理學的方法探究潛在標志物藥效與藥材臨床作用是否吻合?；诖碎_發(fā)一種中藥質量控制研究模式以評價中藥質量，為中藥質控提供新思路。本研究以尋找中藥黃芩的Q-marker為范例，確定了黃芩苷和漢黃芩苷為Q-marker，其中的黃芩苷為2020版《中華人民共和國藥典》規(guī)定黃芩的含測指標，2種方法結果互為印證，充分說明了本方法的可行性。

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（2021-03-19收稿 本文編輯：楊覺雄）

基金項目：國家科技重大專項“重大新藥創(chuàng)制”（2018ZY09735-002，2019ZX09201005-002-007）;國家自然科學基金青年科學基金項目（81903915）作者簡介：劉靜（1997.05—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中藥物質基礎和質量控制，E-mail：liujing2059@163.com通信作者：陳曉鵬（1983.11—），女，博士，副研究員，碩士研究生導師，研究方向：中藥物質基礎和質量控制，E-mail：xpchen@tjutcm.edu.cn6CF65330-F464-4784-8903-A8464DAF226F