閆路，茍瀟，彭穎，高瑞澤，田明明，張效偉,3,*

1. 污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023 2. 流域環(huán)境生態(tài)工程研發(fā)中心，北京師范大學(xué)自然科學(xué)高等研究院，珠海 519087 3. 江蘇省生態(tài)環(huán)境保護(hù)化學(xué)品安全與健康風(fēng)險(xiǎn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

化學(xué)物質(zhì)引起的人體肝臟疾病不容忽視。肝臟在保護(hù)機(jī)體免受有毒有害化學(xué)物質(zhì)侵害方面發(fā)揮著重要作用，它能夠?qū)⒂H脂性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為更多的水溶性代謝物，并通過尿液有效地從體內(nèi)排出[1]。然而，一些化學(xué)物質(zhì)仍然會(huì)引起以炎癥、氧化應(yīng)激和壞死為特征的肝臟損害[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過50%以上的肝臟損害臨床案例是由于藥物引起的，并且研究發(fā)現(xiàn)，在過去的20年里，導(dǎo)致肝臟損害的化學(xué)物質(zhì)還包括工業(yè)化學(xué)品、生物殺蟲劑、化妝品成分、食品添加劑和膳食補(bǔ)充劑等多類型化學(xué)物質(zhì)[3]。如今，全球每年新增化學(xué)物質(zhì)的數(shù)量超過1 000種[4]，這些化學(xué)物質(zhì)在生產(chǎn)和使用過程中可能會(huì)產(chǎn)生環(huán)境污染，從而對(duì)生活在這樣環(huán)境中的人群的健康，特別是肝臟，產(chǎn)生不良的影響。為了保護(hù)人體健康免受某些環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的危害，利用肝毒性測(cè)試模型開展環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)和評(píng)估是識(shí)別健康危害的重要方面之一。

化學(xué)物質(zhì)肝毒性測(cè)試方法包括傳統(tǒng)的動(dòng)物模型(以嚙齒類為代表)和體外細(xì)胞模型。動(dòng)物模型可以從組織以及個(gè)體水平上反映對(duì)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)暴露的生物效應(yīng)，但是在面對(duì)大量待測(cè)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的挑戰(zhàn)以及物種間差異問題時(shí)存在一定的局限性。2007年由美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)提出的“21世紀(jì)毒理學(xué)測(cè)試遠(yuǎn)景與策略”強(qiáng)調(diào)未來毒性測(cè)試方法的重心將從整體動(dòng)物的系統(tǒng)測(cè)試轉(zhuǎn)向基于毒性通路和毒性作用機(jī)制的體外測(cè)試，因此，以人源細(xì)胞系或者細(xì)胞成分為主的體外測(cè)試模型在評(píng)估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的人體肝毒性方面發(fā)揮著越來越重要的作用[3]。經(jīng)典的二維(2D)單層培養(yǎng)系統(tǒng)因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單而被廣泛用于化學(xué)物質(zhì)高通量毒性測(cè)試，但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在2D單層培養(yǎng)中，維持細(xì)胞生理表型所需的生化反應(yīng)和細(xì)胞間的相互作用會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸消失，尤其是在肝細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的各種代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)酶的表達(dá)量會(huì)降低[5]；并且在此培養(yǎng)模型下得到的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)毒性評(píng)估無法很好地反映生物體內(nèi)長(zhǎng)期重復(fù)劑量暴露下的真實(shí)毒性效應(yīng)[6]。因此，為了提高基于體外預(yù)測(cè)模型的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)毒性預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，建立能夠模擬體內(nèi)環(huán)境的體外測(cè)試模型是非常重要的。

三維(3D)體外細(xì)胞培養(yǎng)模型在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性測(cè)試方面，為更真實(shí)地反映環(huán)境化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)人體肝毒性效應(yīng)及揭示致毒機(jī)制提供了新的測(cè)試平臺(tái)。3D體外細(xì)胞培養(yǎng)不同于傳統(tǒng)的2D單層貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方式，細(xì)胞在表面黏附能力極低或含有細(xì)胞基質(zhì)的支架中培養(yǎng)，并利用天然的細(xì)胞間相互作用來驅(qū)動(dòng)3D結(jié)構(gòu)的形成，這使得即使肝細(xì)胞在體外經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間(例如28 d)培養(yǎng)，其功能也能得到較完整的保留，并且細(xì)胞也能以類似活體組織的微組織形態(tài)存在[7]。3D體外細(xì)胞培養(yǎng)起初是用于藥物毒性測(cè)試和篩選，隨著研究的深入，藥物肝毒性預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率不斷提高[8]。目前隨著社會(huì)對(duì)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)毒性的關(guān)注越來越密切，3D體外細(xì)胞培養(yǎng)模型在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)方面的應(yīng)用也在不斷增加[9]。但是，大部分現(xiàn)有的研究依然是從細(xì)胞毒性或者基因表達(dá)等細(xì)胞和分子層面評(píng)估環(huán)境化學(xué)物的肝毒性，如何充分發(fā)揮3D體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的優(yōu)勢(shì)，為環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性研究提供系統(tǒng)的毒性機(jī)制信息是未來研究的挑戰(zhàn)。與此同時(shí)，有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)框架很好地總結(jié)了驅(qū)動(dòng)毒性發(fā)生的致毒機(jī)制，整合了從分子、細(xì)胞、器官乃至個(gè)體、種群水平的各個(gè)毒性事件[10]。毒性事件按發(fā)生的時(shí)間順序可以分為分子起始事件(molecular initiating event, MIE)，關(guān)鍵事件(key events, KEs)和有害結(jié)局(adverse outcomes, AOs)[10]?？蚣芑亩拘詸C(jī)制為體外測(cè)試方法的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)[11]。創(chuàng)立于2014年的AOP-wiki數(shù)據(jù)庫(https://aopwiki.org/)目前(截至2021年8月31日)有22條與肝毒性相關(guān)的AOPs，涉及的肝毒性終點(diǎn)包括肝臟腫瘤、肝纖維化、脂肪肝、膽汁淤積以及肝細(xì)胞損傷。驅(qū)動(dòng)肝毒性發(fā)生的致毒機(jī)制總結(jié)為3D體外肝細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立以及測(cè)試應(yīng)用提供了機(jī)制參考信息。本文綜述了目前常用3D體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的制備方法，以及在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)(納米材料、持久性有機(jī)污染物和新型有機(jī)污染物等)肝毒性預(yù)測(cè)方面的應(yīng)用，最后探討了3D肝細(xì)胞體外培養(yǎng)模型在AOP指導(dǎo)下開展肝毒性預(yù)測(cè)的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景，包括如何確定細(xì)胞培養(yǎng)體系和整合毒性測(cè)試信息、如何提高環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)的效率以及準(zhǔn)確性等。

1 3D體外培養(yǎng)模型的制備方法(Methods of 3D in vitro culture models)

依據(jù)制備方法，3D肝細(xì)胞體外培養(yǎng)模型可以分為夾層培養(yǎng)法、靜態(tài)球形模型、生物反應(yīng)器、器官芯片和3D生物打印(表1)。

1.1 夾層培養(yǎng)法

肝細(xì)胞夾層培養(yǎng)法被廣泛應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)通過膽汁淤積誘導(dǎo)的肝毒性研究中。它的培養(yǎng)方式是在2層細(xì)胞外基質(zhì)之間培養(yǎng)肝細(xì)胞(圖1(a))。通常用到的細(xì)胞外基質(zhì)是凝膠的膠原蛋白或Matrigel(一種細(xì)胞外基質(zhì)的混合物，其中包含層連蛋白和多種生長(zhǎng)因子)；細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)成影響著細(xì)胞的排列和功能，夾層培養(yǎng)中的底層基質(zhì)先于細(xì)胞放置于培養(yǎng)板中，故基質(zhì)種類和成分的不同會(huì)影響底層基質(zhì)的硬度以及粘連蛋白的數(shù)量從而影響后續(xù)接種細(xì)胞形態(tài)和多細(xì)胞排列；覆蓋層基質(zhì)放入后，細(xì)胞會(huì)處于上下覆蓋的立體空間中，這樣的環(huán)境有利于維持細(xì)胞的活力，并能誘導(dǎo)細(xì)胞分化，影響膽汁的分泌和排泄行為[12, 17]。肝細(xì)胞在夾層培養(yǎng)中保存了肝細(xì)胞極性，以及膽管功能的形成。這種3D肝細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可用于評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)肝膽運(yùn)輸?shù)挠绊懸约盎瘜W(xué)物質(zhì)引起由膽汁酸介導(dǎo)的肝臟毒性(膽汁淤積)[17]。Chatterjee等[18]利用夾層培養(yǎng)法分別構(gòu)建了基于人源肝細(xì)胞和大鼠源肝細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)膽汁淤積評(píng)估模型，通過比較不同模型下得到的化學(xué)物質(zhì)膽汁淤積指數(shù)，該研究發(fā)現(xiàn)人源肝細(xì)胞模型中獲得的膽汁淤積指數(shù)與報(bào)道的臨床藥物膽汁淤積發(fā)生率相關(guān)。同時(shí)，另一則研究利用該培養(yǎng)方式對(duì)344個(gè)藥物的肝毒性進(jìn)行測(cè)試，并實(shí)現(xiàn)了50%～60%的真陽性預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率[19]。然而，夾層培養(yǎng)法的主要局限性是在長(zhǎng)期培養(yǎng)中存在滲漏、膽管損傷和膽汁淤積的現(xiàn)象，因此夾層培養(yǎng)法的培養(yǎng)條件還需要改善，以便增加體外模擬肝膽排泄過程所需的膽管系統(tǒng)的穩(wěn)定性[20]。

1.2 靜態(tài)球形模型

球形模型是指那些使細(xì)胞聚集為細(xì)胞球狀體的細(xì)胞培養(yǎng)體系，其中懸滴培養(yǎng)法和微模法是2種比較常用的靜態(tài)球形模型，因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單而被廣泛應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)肝毒性評(píng)估以及機(jī)制研究中(圖1(b))。HepG2(人肝癌細(xì)胞)球狀體和HepaRG(末分化的人肝癌細(xì)胞)球狀體是2種在靜態(tài)球形模型下容易獲取的肝細(xì)胞球狀體。HepG2球狀體相比于常規(guī)的2D培養(yǎng)方式下的HepG2具有較好的糖原儲(chǔ)存和代謝能力，且白蛋白、尿素、異源物質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子、Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶表達(dá)量增多[13]。分化狀態(tài)下的HepaRG細(xì)胞的酶活性以及轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況與原代人肝細(xì)胞相似，它被認(rèn)為是原代人源肝細(xì)胞的替代細(xì)胞系[21]。但是在2D單層培養(yǎng)下，HepaRG的部分細(xì)胞色素酶、Ⅱ相酶以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量與原代人源細(xì)胞相比顯著下降[22]。HepaRG球狀體可培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)4周且在培養(yǎng)過程中外源代謝能力一直保持著與原代人肝細(xì)胞相似的水平[23]。研究表明HepG2和HepaRG球狀體有著不同的應(yīng)用場(chǎng)景，HepG2球狀體在識(shí)別化學(xué)物質(zhì)引起的細(xì)胞毒性方面有著更高的敏感性，而HepaRG球狀體在分子水平識(shí)別特異毒性方面有著更好的能力[24-25]。

圖1 3D體外培養(yǎng)模型制備方法Fig. 1 Methods of 3D in vitro culture models

表1 3D體外培養(yǎng)模型的制備方法Table 1 Methods of 3D in vitro culture models

3D培養(yǎng)方法3D generation methods肝細(xì)胞類型Hepatocytes 培養(yǎng)時(shí)間Culture times高通量能力High-throughput支架Scaffold模型特點(diǎn)Comments參考文獻(xiàn)References3D生物打印3D Bioprinting原代肝細(xì)胞(人、大鼠、小鼠)、HepG2、Hep-aRG、干細(xì)胞、肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)Primary hepatocytes (hu-man/rat/mouse), HepG2, HepaRG, stem cells, co-culture with NPCs>2周>2 weeks☆合成聚合物Synthetic polymers按照預(yù)先設(shè)定的程序,生物材料能夠被精準(zhǔn)放置,制備出復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu)Based on a predetermined proce-dure, biological materials can be precisely placed to generate com-plex biological structures[16]

肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞在肝毒性產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要作用，因此由肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)的多細(xì)胞球形模型提高了預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)肝毒性的能力。其中，肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)比較常見，而組成相對(duì)復(fù)雜的肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞的三元共培養(yǎng)系統(tǒng)則可更全面、高效地評(píng)估化學(xué)物質(zhì)引發(fā)肝纖維化的機(jī)制及能力[26]。Prestigiacomo等[27]利用GravityPLUSTMHanging Drop系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)由HepaRG、肝星狀細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞混合培養(yǎng)的3D肝微組織模型，并證實(shí)該模型可以在體外再現(xiàn)導(dǎo)致肝臟纖維化的分子與細(xì)胞水平的關(guān)鍵生物事件，如肝細(xì)胞損傷、抗氧化反應(yīng)、Kupffer細(xì)胞激活、肝星狀細(xì)胞激活以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積。盡管靜態(tài)球狀模型在高通量化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)方面有著較好的應(yīng)用前景，但是目前的研究往往缺乏統(tǒng)一的測(cè)試基準(zhǔn)來標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試結(jié)果，因此限制了其在大規(guī)?；瘜W(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)方面的應(yīng)用。

1.3 生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器因培養(yǎng)條件可控的特點(diǎn)為體外細(xì)胞培養(yǎng)提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境，被用于化學(xué)物質(zhì)肝毒性研究。生物反應(yīng)器是一個(gè)通過灌注或者攪拌的方式使肝細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)處于一個(gè)流動(dòng)狀態(tài)的裝置(圖1(c))，該裝置將血流動(dòng)力學(xué)和剪切應(yīng)力對(duì)肝臟功能的影響考慮到了模型制備中，目的是為了生成更貼近體內(nèi)肝臟復(fù)雜形態(tài)的模型，特別是彌補(bǔ)了嚴(yán)重肝損傷時(shí)肝臟功能下降的不足[28]。流動(dòng)的生物反應(yīng)器可以提升模型的去毒能力同時(shí)保存生物合成和生物轉(zhuǎn)化的功能。最早報(bào)道的生物反應(yīng)器是一個(gè)體積為800 mL的3D灌注多室中空纖維膜生物反應(yīng)器[29]，它由3個(gè)獨(dú)立的毛細(xì)管系統(tǒng)組成，分別用于動(dòng)靜脈介質(zhì)灌注、氧氣供應(yīng)和二氧化碳清除，當(dāng)反應(yīng)器中接種肝臟實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞后，這些細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自我組裝成組織樣結(jié)構(gòu)。之后，該裝置被縮小到2 mL的體積，使用的細(xì)胞量也減少至1.2×108個(gè)，適用于臨床藥物測(cè)試。在該裝置內(nèi)，細(xì)胞色素酶P450可保持活性長(zhǎng)達(dá)23 d，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的生理結(jié)構(gòu)也能被觀察到，管狀轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白MRP2 (multidrug resistance-associated protein 2)、P-gp (P-glycoprotein)和BCRP (breast cancer resistance protein)等外排型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分布特征也與人體肝臟組織中的分布特征相似。此外，研究發(fā)現(xiàn)HepaRG細(xì)胞和原代人肝細(xì)胞在生物反應(yīng)器培養(yǎng)中表現(xiàn)出相似的細(xì)胞色素酶P450和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性[30]。生物反應(yīng)器還可以密切監(jiān)視整個(gè)反應(yīng)介質(zhì)中氧氣、乳酸含量以及任何可通過近紅外技術(shù)測(cè)量的參數(shù)；同樣的，細(xì)胞的狀態(tài)也可以通過觀察細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白的含量得到反映[31]?？偟膩碚f，生物反應(yīng)器裝置在模擬肝臟的功能和表型方面表現(xiàn)優(yōu)異，但實(shí)際使用過程中由于所需細(xì)胞量巨大而不適用于高通量的毒性測(cè)試。

1.4 器官芯片

器官芯片為研究化學(xué)物質(zhì)肝毒性提供了一種復(fù)雜度更高、仿真效果更好的體外模擬人體肝臟器官的方式[32-33]。模型利用微流控技術(shù)將不同類型細(xì)胞在同一個(gè)系統(tǒng)的分隔室內(nèi)共同培養(yǎng)，通過產(chǎn)生流體剪切力、機(jī)械應(yīng)力和生化濃度梯度等理化刺激使細(xì)胞發(fā)生自組裝，從而在培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出更加真實(shí)的生理學(xué)功能[33]。肝臟芯片技術(shù)為研究藥物代謝和化學(xué)物質(zhì)毒性測(cè)試提供了一個(gè)更加接近于人體真實(shí)暴露環(huán)境的裝置，且肝臟芯片已逐漸被商業(yè)化使用[34]。例如，Organovo公司生產(chǎn)了一種由原代肝細(xì)胞和非血小板細(xì)胞組成的肝臟微組織芯片ExViveTM[35]。Rennert等[36]使用雙通道微流控技術(shù)創(chuàng)建了一個(gè)由多孔膜(模擬肝淋巴間隙)分隔的3D肝臟模型，該模型整合了由內(nèi)皮細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞組成的血管層以及由肝星狀細(xì)胞與HepaRG細(xì)胞共同培養(yǎng)的肝臟層，增強(qiáng)了肝細(xì)胞的極性，并允許觀察肝膽功能。同時(shí)，器官芯片還可以通過連接腸道上皮細(xì)胞和肝臟細(xì)胞形成肝-腸多器官芯片，進(jìn)一步增加器官芯片的復(fù)雜性[37](圖1(d))，這樣的模型可用于研究化學(xué)物質(zhì)的代謝途徑以及在器官水平上評(píng)估化學(xué)物質(zhì)的毒性效應(yīng)。Choe等[15]開發(fā)了一種由腸道上皮細(xì)胞(Caco-2)和肝細(xì)胞(HepG2)2個(gè)單獨(dú)層組成的微流體腸道肝芯片，2種細(xì)胞的細(xì)胞色素酶P450代謝活性在該培養(yǎng)系統(tǒng)中顯著增強(qiáng)，且Caco-2細(xì)胞的吸附特性也因流動(dòng)而改變，在評(píng)估藥物代謝特征方面比單一細(xì)胞培養(yǎng)更接近人體報(bào)告數(shù)據(jù)。總之，肝器官芯片提供了一個(gè)更加接近于人體肝臟器官的體外培養(yǎng)模型，有利于準(zhǔn)確掌握化學(xué)物質(zhì)引發(fā)肝毒性的致毒機(jī)制及毒代動(dòng)力學(xué)過程，但是大部分的肝臟器官芯片測(cè)試還需要得到進(jìn)一步的驗(yàn)證，且芯片的高成本阻礙了其應(yīng)用。

1.5 3D生物打印

3D生物打印利用編程技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)的精準(zhǔn)組裝，被逐漸應(yīng)用于預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)肝毒性以及毒性機(jī)制研究中。這項(xiàng)技術(shù)使用含有細(xì)胞的生物材料作為生物打印墨水，在預(yù)設(shè)的計(jì)算機(jī)程序下，逐層精確定位墨水的空間位置，從而打印出具有生物活性的立體細(xì)胞組織構(gòu)架(圖1(e))。3D生物打印的方法策略包括3個(gè)方面：(1)仿生學(xué)，即對(duì)組織或器官的細(xì)胞和細(xì)胞外成分進(jìn)行體外復(fù)制，復(fù)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的同時(shí)也要保證功能的實(shí)現(xiàn)；(2)自組裝，即利用胚胎作為生物組織復(fù)制的原材料，并通過操縱培養(yǎng)系統(tǒng)的參數(shù)來驅(qū)動(dòng)3D生物打印組織中的胚胎生長(zhǎng)；(3)微型組織、器官，即利用仿生學(xué)和自組裝策略的結(jié)合，將自我組裝的細(xì)胞集團(tuán)，再次組裝成為功能性的宏觀組織[38]。目前3D生物打印主要有3種打印方式：激光輔助生物打印[39]、液滴噴射生物打印[40]和擠壓成型生物打印[41]。通過這些技術(shù)，3D生物打印最終能夠在體外構(gòu)建出一個(gè)功能性的組織或器官，用于化學(xué)物質(zhì)的毒性預(yù)測(cè)和篩選。在化學(xué)物質(zhì)肝毒性篩選與預(yù)測(cè)方面，Ide等[8]利用3D Regenova?生物打印機(jī)生成了由原代人肝細(xì)胞和人肝星狀細(xì)胞組成的肝微組織，該微組織直徑大約1 mm，能夠持續(xù)培養(yǎng)25 d，且保持長(zhǎng)期的細(xì)胞活力以及代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)；與2D培養(yǎng)和球狀模型下的化學(xué)物質(zhì)肝毒性評(píng)估結(jié)果相比，該模型通過檢測(cè)三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate, ATP)和白蛋白指標(biāo)識(shí)別出了其他2類模型沒有識(shí)別到的肝毒性化學(xué)物質(zhì)，具有更高的靈敏性。然而，3D生物打印仍然存在一些有待改進(jìn)的地方，如細(xì)胞與生物相容性材料之間的兼容性差，打印速度低，打印后可能會(huì)由于培養(yǎng)環(huán)境的失控導(dǎo)致支架形狀發(fā)生改變。為了解決這些問題，新一代的3D生物打印方法也在不斷的發(fā)展中[16]，例如，一種四維(4D)生物打印新技術(shù)被提出，第四維指的是3D生物打印生成的構(gòu)造在打印后隨著時(shí)間的推移繼續(xù)被控制發(fā)展[42]。

2 3D體外培養(yǎng)模型在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)中的應(yīng)用(Application of 3D in vitro culture models on hepatotoxicity prediction of environmental chemicals)

環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性評(píng)估按暴露時(shí)間主要分為短期暴露(12 h或24 h)產(chǎn)生的肝細(xì)胞毒性(例如50%受抑制濃度(IC50))，與長(zhǎng)期暴露(數(shù)周或數(shù)月)引起的肝特有毒性(例如肝纖維化或脂肪肝)[43]。目前3D肝細(xì)胞體外測(cè)試模型在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性尤其是慢性肝毒性評(píng)估方面的應(yīng)用逐漸增加，表2羅列了3D體外培養(yǎng)模型在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引發(fā)肝毒性的預(yù)測(cè)中的應(yīng)用案例，包括納米材料、持久性有機(jī)污染物(四氯二苯并-對(duì)-二噁英(TCDD)、3,3’,4,4’,5-五氯聯(lián)苯(PCB126)等)和新型有機(jī)污染物等(全氟辛酸(PFOA)等)。

2.1 納米材料

3D肝細(xì)胞體外培養(yǎng)模型可有效控制納米材料的暴露方式，為研究納米材料在體外肝細(xì)胞功能穩(wěn)定情況下的毒性效應(yīng)提供測(cè)試平臺(tái)，且目前在納米材料肝毒性評(píng)估中應(yīng)用較多的是球形模型和流動(dòng)狀態(tài)的芯片模型。隨著納米材料在醫(yī)藥、個(gè)人護(hù)理品及電子產(chǎn)品等多個(gè)領(lǐng)域的大量應(yīng)用[56]，納米材料存在廣泛的環(huán)境暴露與生物內(nèi)暴露，嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境及人體健康安全[57]。盡管目前納米材料的環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)研究已經(jīng)取得了較多的進(jìn)展，但是仍然存在許多亟待解決的問題和挑戰(zhàn)。其中，由于納米材料的毒性效應(yīng)受多種因素(元素組成、尺寸和表面電荷等)的影響，傳統(tǒng)的化學(xué)藥品毒性測(cè)試方法不適用于納米材料毒性機(jī)制評(píng)估[58]，因此，需要發(fā)展針對(duì)納米材料環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新方法或者替代測(cè)試策略。Li等[44]構(gòu)建了一個(gè)用于評(píng)估納米材料肝毒性的微流控3D肝細(xì)胞芯片模型，該模型通過連續(xù)灌注的方式研究納米材料累積暴露的毒性。超順磁性氧化鐵納米粒子在該模型下表現(xiàn)出比標(biāo)準(zhǔn)的2D孔板暴露方式更強(qiáng)的肝毒性，可能的原因是較小尺寸的納米粒子在此模型下更有可能與肝細(xì)胞發(fā)生作用，影響白蛋白和尿素的合成路徑，最終引發(fā)更嚴(yán)重的肝損傷。Jiang等[45]利用大鼠肝細(xì)胞球狀體研究了硫化銅納米粒子的肝毒性及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)硫化銅納米粒子通過影響線粒體膜電位以及誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激從而引起肝毒性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)硫化銅納米粒子影響膽鹽輸出泵的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，對(duì)肝臟膽汁的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行阻斷，但是具體的機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

表2 3D體外培養(yǎng)模型在化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)方面的應(yīng)用案例Table 2 Application cases of 3D in vitro culture models for hepatoxicity prediction of environmental chemicals

不同的納米材料在3D肝細(xì)胞體外培養(yǎng)模型下的肝毒性效應(yīng)與2D培養(yǎng)模型下的結(jié)果相比較，敏感性不同，但3D培養(yǎng)模型下的肝毒性效應(yīng)更能真實(shí)地反映納米材料體內(nèi)暴露的毒性。Elje等[46]對(duì)比了HepG2細(xì)胞在3D球形培養(yǎng)和2D培養(yǎng)下對(duì)納米二氧化鈦、納米銀以及納米氧化鋅的毒性響應(yīng)，包括細(xì)胞毒性和基因毒性；發(fā)現(xiàn)弱毒性的納米二氧化鈦在2個(gè)模型下都沒有表現(xiàn)出毒性效應(yīng)，強(qiáng)毒性的納米氧化鋅表現(xiàn)出相似的細(xì)胞毒性，但是納米銀對(duì)2D培養(yǎng)下的HepG2細(xì)胞具有更強(qiáng)的毒性，這些差異的來源可能是由于納米材料暴露方式的不同影響了其毒性效應(yīng)。盡管納米材料的肝毒性在3D培養(yǎng)模型下與2D培養(yǎng)存在差異，但是3D培養(yǎng)模型下的肝毒性數(shù)據(jù)與體內(nèi)測(cè)試結(jié)果有著更好的一致性[59]。因此，開發(fā)并使用能夠模擬體內(nèi)暴露環(huán)境的3D培養(yǎng)模型進(jìn)行納米材料的人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估非常重要。

2.2 持久性有機(jī)污染物

3D肝細(xì)胞模型為研究持久性有機(jī)污染物(POPs)對(duì)人體肝臟的影響提供了一個(gè)接近于體內(nèi)肝臟功能且能夠研究低濃度長(zhǎng)期暴露毒性效應(yīng)的測(cè)試平臺(tái)，這增加了利用體外模型的毒性數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)POPs人體健康風(fēng)險(xiǎn)的可信度。二噁英(TCDD)和多氯聯(lián)苯(PCB126)是2種典型的持久性有機(jī)污染物，同時(shí)是芳香烴受體(AhR)的配體[60]，由于AhR受體的結(jié)構(gòu)以及AhR信號(hào)通路響應(yīng)在動(dòng)物與人體之間具有差異，且AhR受體在TCDD、PCB126致毒過程中發(fā)揮著重要作用，因此TCDD、PCB126致毒機(jī)制及毒性效應(yīng)存在物種差異[61]。在動(dòng)物模型下，TCDD、PCB126與AhR受體結(jié)合，激活A(yù)hR信號(hào)通路，產(chǎn)生大量的細(xì)胞色素酶，長(zhǎng)期暴露導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，肝細(xì)胞以及周圍的肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的正常功能紊亂，導(dǎo)致脂肪肝、肝纖維化以及肝臟腫瘤的發(fā)生[62]。然而，Yan等[47]構(gòu)建了一個(gè)由HepaRG、肝星狀細(xì)胞(HSCs)和巨噬細(xì)胞(THP-1)共培養(yǎng)的人肝微組織模型，該模型能有效用于識(shí)別化學(xué)物質(zhì)所引發(fā)的肝纖維化，并且觀察到硫代乙酰胺(TAA)以及苯并芘(BaP)引起的肝纖維化。但在TCDD和PCB126脅迫下，并未觀察到肝纖維化，僅檢測(cè)到細(xì)胞色素酶等代謝相關(guān)信號(hào)的激活[27]。動(dòng)物模型和人肝微組織模型測(cè)試結(jié)果的差異進(jìn)一步預(yù)示著在評(píng)估POPs對(duì)人體肝臟危害時(shí)，需要考慮物種間的毒性差異。除了3D人肝微組織模型外，基于雞肝癌細(xì)胞(LMH)以及原代水牛肝細(xì)胞的3D球狀模型也分別用于評(píng)估PCB126和TCDD的毒性效應(yīng)[48-49]。研究發(fā)現(xiàn)，PCB126在3D雞肝癌細(xì)胞模型下的細(xì)胞毒性IC50值高于2D培養(yǎng)模型，但是在評(píng)估7-乙氧基-異吩唑酮-脫乙基酶(7-ethoxyresorufin-O-deethylase, EROD)活性以及AhR相關(guān)基因表達(dá)方面，PCB126在3D模型下誘導(dǎo)更高的基因表達(dá)以及EROD活性，這表明了3D培養(yǎng)模型在評(píng)估分子水平變化時(shí)具有靈敏度高的特點(diǎn)。以原代水牛肝細(xì)胞構(gòu)建的3D肝細(xì)胞培養(yǎng)模型通過檢測(cè)TCDD誘導(dǎo)的特有基因表達(dá)情況，并與已知的原代人肝細(xì)胞以及大鼠細(xì)胞測(cè)試結(jié)果做比較，發(fā)現(xiàn)該模型對(duì)TCDD的響應(yīng)與原代人肝細(xì)胞模型更相似，這也說明了不同物種在響應(yīng)TCDD毒性時(shí)存在物種差異，以及發(fā)展更接近于人體毒性響應(yīng)模型的重要性[49]?？傊?，在評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)人體肝臟的影響時(shí)，建立與人體肝臟模型相關(guān)性高的3D體外細(xì)胞模型一方面可以在體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的過程中保存肝細(xì)胞功能，另外一方面可以縮小毒性效應(yīng)的物種差異，為環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的肝毒性評(píng)估提供接近于人體肝臟功能的測(cè)試平臺(tái)。

2.3 新型有機(jī)污染物

3D肝細(xì)胞培養(yǎng)模型為新型有機(jī)污染物全氟辛酸(perflurooctanoic acid, PFOA)和雙酚A (bisphenol A, BPA)的肝毒性機(jī)制研究提供了一個(gè)模擬體內(nèi)暴露環(huán)境的平臺(tái)，縮小了體外和體內(nèi)研究結(jié)果的差異，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)下肝細(xì)胞基因表達(dá)異常等不足。隨著PFOA替代品的出現(xiàn)，為了提高PFOA及其替代品的毒性測(cè)試通量以及增加體外測(cè)試數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，利用3D肝細(xì)胞模型進(jìn)行這類物質(zhì)的肝毒性研究是一個(gè)可行的選擇。在小鼠肝細(xì)胞(AML12)球形模型下，PFOA細(xì)胞毒性的IC50值比2D培養(yǎng)條件下的數(shù)值高，且氧化應(yīng)激水平也具有同樣的趨勢(shì)，41.4 mg·L-1和82.8 mg·L-1PFOA暴露AML12球狀體28 d會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激、乳酸脫氫酶漏出率以及凋亡效應(yīng)因子caspase3/7活性顯著增加；六氟環(huán)氧丙烷二聚酸(hexafluoropropylene oxide dimer acid, HFPO-DA)和全氟-3,5,7,9-四氧雜癸酸(perfluoro-3,5,7,9-tetraoxadecanoic acid, PFO4DA)這2個(gè)新興替代品也會(huì)引起細(xì)胞氧化應(yīng)激以及細(xì)胞損傷，但比PFOA的肝毒性小[50]。

3D肝細(xì)胞體外培養(yǎng)模型在BPA肝毒性機(jī)制研究方面的應(yīng)用提高了慢性BPA暴露肝毒性致毒機(jī)制的認(rèn)識(shí)。HepG2球狀體經(jīng)BPA染毒14 d后的轉(zhuǎn)錄組變化顯示，BPA影響與脂質(zhì)代謝功能相關(guān)的生物過程，包括脂質(zhì)生物合成、類固醇代謝過程和膽固醇調(diào)節(jié)過程，且這一結(jié)果與大鼠經(jīng)BPA暴露90 d后的轉(zhuǎn)錄組變化情況相一致[51]，補(bǔ)充了2D HepG2模型未檢測(cè)到低濃度BPA暴露影響脂質(zhì)代謝的不足[63]。另外，在基于人肝癌細(xì)胞Hep3B的微流控芯片模型中，BPA被證實(shí)在CYP2E1細(xì)胞色素酶存在的情況下毒性更強(qiáng)，而在乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶以及雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶存在的情況下毒性減弱，同時(shí)該系統(tǒng)用到的酶樣品體積僅為普通的96孔板的1/2 000，大大節(jié)約了該模型評(píng)估化學(xué)物質(zhì)代謝毒性所需要的花費(fèi)[9]。

2.4 其他環(huán)境化學(xué)物質(zhì)

3D肝細(xì)胞模型可用于研究由農(nóng)藥暴露引起的肝臟代謝紊亂的毒性機(jī)制。在傳統(tǒng)的2D細(xì)胞模型下，肝細(xì)胞的代謝能力會(huì)迅速減弱，這會(huì)影響農(nóng)藥肝臟毒性的預(yù)測(cè)，以及機(jī)制的研究。Jellali等[52]利用大鼠原代細(xì)胞構(gòu)建的器官芯片和多組織學(xué)測(cè)試方法的結(jié)合研究了滴滴涕(dichlorodiphenyltrichloroethane, DDT)、氯菊酯(permethrin, PMT)和它們混合物引起的肝臟損害，轉(zhuǎn)錄組和代謝組測(cè)試結(jié)果共同表明，53.1 mg·L-1DDT、58.7 mg·L-1PMT和DDT/PMT混合物通過干擾與PPARα信號(hào)傳導(dǎo)、脂質(zhì)代謝和類固醇合成等相關(guān)基因而干擾脂肪酸、脂質(zhì)以及葡萄糖的代謝，同時(shí)發(fā)現(xiàn)混合暴露會(huì)引起更加復(fù)雜的基因和代謝紊亂。

除了肝毒性之外，3D肝細(xì)胞模型也可以用于評(píng)估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)基因毒性，且比2D培養(yǎng)模型具有更好的靈敏性。Sharin等[53]對(duì)比了BaP在雞肝癌細(xì)胞2D培養(yǎng)和3D球形培養(yǎng)下誘導(dǎo)的cyp1a表達(dá)量以及引發(fā)的DNA損傷響應(yīng)；在3D模型下，EROD活性在暴露8 h后即可檢測(cè)到且在暴露24 h達(dá)到最大值，比2D模型更早檢測(cè)到，同時(shí)與DNA損傷響應(yīng)相關(guān)的基因也更早地在3D細(xì)胞模型下被檢測(cè)到，這說明了雞肝癌細(xì)胞LDH球狀體適用于評(píng)估需要CYP1A激活的化學(xué)物質(zhì)的基因毒性。Mandon等[54]利用HepaRG細(xì)胞構(gòu)建了一個(gè)用于評(píng)估化學(xué)物質(zhì)基因毒性的肝細(xì)胞模型，該模型測(cè)試了11個(gè)基因毒性化學(xué)物質(zhì)對(duì)HepaRG球狀體染毒24 h和48 h后DNA損傷情況，并且彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示8個(gè)基因毒性化學(xué)物質(zhì)被檢測(cè)到具有損傷DNA的能力。盡管3D HepaRG球狀體在預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性方面是一個(gè)非常有潛力的模型，但是還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證和提高該模型對(duì)化學(xué)物質(zhì)致癌性的預(yù)測(cè)效果。

3 3D體外培養(yǎng)模型在肝毒性AOPs指導(dǎo)下的應(yīng)用前景(Prospect of 3D in vitro culture models under the guide of hepatotoxicity AOPs)

3D體外培養(yǎng)模型不僅提高了環(huán)境化學(xué)物質(zhì)關(guān)于肝細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，還為分析環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引發(fā)多種肝毒性有害結(jié)局(例如膽汁淤積、脂肪肝和肝纖維化)提供了復(fù)雜的體外細(xì)胞模型。肝毒性AOPs系統(tǒng)地描述了毒性發(fā)展過程，根據(jù)收錄在AOP-wiki數(shù)據(jù)庫中涉及到肝毒性的有害結(jié)局，肝毒性AOPs可以歸納為5種類型：肝臟腫瘤、肝纖維化、脂肪肝、膽汁淤積和肝細(xì)胞損傷。這些AOPs涉及到的生物信息有利于針對(duì)性地設(shè)置3D體外培養(yǎng)模型的檢測(cè)指標(biāo)，指導(dǎo)3D體外培養(yǎng)模型從分子、細(xì)胞、組織和器官水平對(duì)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性進(jìn)行評(píng)估，實(shí)現(xiàn)提高模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的目標(biāo)[64]。

不同的肝毒性終點(diǎn)測(cè)試需求決定了3D體外培養(yǎng)模型的選擇。在預(yù)測(cè)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對(duì)人體肝臟的影響時(shí)，選擇基于人源細(xì)胞系的培養(yǎng)模型能夠減少由物種差異帶來的毒性信息不一致的可能性；而利用動(dòng)物源肝細(xì)胞培養(yǎng)模型獲得的化學(xué)物質(zhì)毒性數(shù)據(jù)以及毒性機(jī)制信息同樣為生態(tài)及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了重要的理論依據(jù)。另外一方面，針對(duì)化學(xué)物質(zhì)引起的肝纖維化、脂肪肝等肝臟毒性研究，由于毒性產(chǎn)生過程中多種細(xì)胞系受到影響且細(xì)胞系之間存在密切的相互作用，因此在評(píng)估這種類型的肝毒性時(shí)，多細(xì)胞系共培養(yǎng)模型更加符合化學(xué)物質(zhì)毒性引發(fā)的場(chǎng)景。此外，3D體外培養(yǎng)模型可以評(píng)估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)低濃度長(zhǎng)期暴露引起的肝臟損傷以及細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的分子機(jī)制，并結(jié)合現(xiàn)有的肝毒性AOPs預(yù)測(cè)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對(duì)人體的影響。

3D體外肝細(xì)胞培養(yǎng)模型聯(lián)合其他體外測(cè)試方法或者組學(xué)測(cè)試(轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué))進(jìn)一步提高了環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性[65]。導(dǎo)致肝臟毒性的過程會(huì)涉及到多種細(xì)胞參與，是一個(gè)機(jī)制比較復(fù)雜的過程。因此，目前單一模型或測(cè)試無法準(zhǔn)確評(píng)估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)。依據(jù)肝毒性機(jī)制構(gòu)建一個(gè)包含多種或多級(jí)肝毒性測(cè)試方法的整合預(yù)測(cè)模型是毒性測(cè)試的發(fā)展方向[66]。這種整合預(yù)測(cè)方法由2個(gè)維度組成(圖2)，橫向反映的是環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引發(fā)的肝毒性AOPs，縱向是整合測(cè)試評(píng)估方法(integrated approaches to testing and assessment, IATA)。環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引起肝毒性分子啟動(dòng)事件的發(fā)生是肝損傷的重要分子標(biāo)志物之一，由于待測(cè)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)數(shù)量巨大，采用體外化學(xué)分析法(inchemico)或計(jì)算機(jī)模擬法(insilico)對(duì)分子啟動(dòng)事件的進(jìn)行評(píng)估可以提高預(yù)測(cè)的規(guī)模和速度。具有引發(fā)分子啟動(dòng)事件潛力的那些環(huán)境化學(xué)物質(zhì)將會(huì)進(jìn)行第二級(jí)的肝毒性體外測(cè)試，主要是為了檢測(cè)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)在細(xì)胞或組織水平是否能夠引起肝毒性生物標(biāo)志物的變化，這個(gè)過程涉及到的毒性機(jī)制更加復(fù)雜，因此3D體外肝細(xì)胞培養(yǎng)模型的應(yīng)用為這一步的測(cè)試提供了更好的測(cè)試平臺(tái)。如果環(huán)境化學(xué)物質(zhì)在第二級(jí)同樣被檢測(cè)出有肝毒性風(fēng)險(xiǎn)，則需要進(jìn)行第三級(jí)人群流行病學(xué)的調(diào)查，進(jìn)一步確認(rèn)該環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的肝毒性。

綜上所述，3D體外肝細(xì)胞培養(yǎng)模型更好地模擬了真實(shí)肝臟的功能，并形成了以夾層培養(yǎng)法、球形模型、生物反應(yīng)器、器官芯片和3D生物打印5種主要的3D細(xì)胞模型制備方法，其中球形模型在進(jìn)行大量環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)方面應(yīng)用時(shí)可以做到高通量，而生物器、器官芯片以及3D生物打印可以模擬更加復(fù)雜的體內(nèi)肝臟環(huán)境。肝毒性AOPs總結(jié)了化學(xué)物質(zhì)從(1)分子啟動(dòng)事件(cyp2e1持續(xù)激活、AhR持續(xù)激活、PPARα激活等)，到(2)細(xì)胞、組織/器官水平上的分子響應(yīng)關(guān)鍵事件(膽汁酸合成增加、脂質(zhì)積累、炎癥反應(yīng)、肝星狀細(xì)胞激活等)，再到(3)個(gè)體水平上可觀察到的肝損傷(肝臟腫瘤、肝纖維化和脂肪肝等)，為充分利用3D體外肝細(xì)胞培養(yǎng)模型進(jìn)行環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)提供了理論依據(jù)。另外，3D肝細(xì)胞模型可以與多種檢測(cè)技術(shù)(如組學(xué))結(jié)合，進(jìn)一步提高對(duì)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)肝毒性預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

圖2 有害結(jié)局路徑指導(dǎo)下的肝毒性整合測(cè)試評(píng)估方法注：AOP表示有害結(jié)局路徑；IATA表示整合測(cè)試評(píng)估方法；MIEs表示分子啟動(dòng)事件。Fig. 2 Integrated testing assessment approaches for hepatotoxicity guided by the adverse outcome pathwayNote: AOP stands for adverse outcome pathway; IATA stands for integrated approaches to testing and assessment; MIEs stands for molecular initiating events.

通訊作者簡(jiǎn)介：張效偉(1978—)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。