梁延鵬，王婧，錢麗，覃禮堂,3,*，曾鴻鵠,#，莫凌云,3，宋曉紅

1. 桂林理工大學環(huán)境科學與工程學院，廣西環(huán)境污染控制理論與技術重點實驗室，桂林 541004 2. 桂林理工大學巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協同創(chuàng)新中心，桂林 541004 3. 廣西環(huán)境污染控制理論與技術重點實驗室科教結合科技創(chuàng)新基地，桂林 541004

抗生素是一類能在低濃度下抑制或影響生物機能的化學物質，在醫(yī)療及動、植物病蟲害防治方面發(fā)揮了巨大的作用[1]?；前奉惪股?sulfonamide antibiotics, SAs)是一類人工合成的抗菌劑，自20世紀40年代被成功合成以來，超過150種SAs及其衍生物被應用于人體疾病的治療或動物飼養(yǎng)[2]。SAs在國內外的生產和使用量均較高，且用量逐年上升，而抗生素的濫用易引起更嚴重的環(huán)境殘留問題[3]。由于代謝不完全，這些化合物中的大部分以糞便和尿液的形式的排出。其也被應用于人體疾病的治療，且在各國的醫(yī)療廢水中被高濃度檢出[4]。SAs藥物已進入大氣、水體以及土壤等環(huán)境中[5]。SAs有其特定的代謝途徑，它們通過抑制氨基苯甲酸的合成來抑制葉酸的生物合成，故而當其母體或其代謝產物在土壤、表層水體等環(huán)境中的殘留量達到一定濃度后，既可影響特定微生物，也可影響非特定生物體，例如一些單細胞藻類、無脊椎動物、魚類和植物等[6]，甚至促進耐藥菌株的進化[7]，并可通過食物鏈威脅人體健康。

研究表明，世界各地的地表水、地下水和沉積物甚至飲用水中都經常檢測到各種抗生素，其中一些化合物濃度水平甚至高達數百μg·L-1[8]。環(huán)境中的抗生素常以各種形式和濃度共存，形成復雜的混合污染物，對環(huán)境生物產生了聯合毒性效應[9-10]?；前奉惪股卦谒芯哂辛己玫娜芙庑院突瘜W穩(wěn)定性，在中國的大型水系中被檢測到?；前芳讗哼蛟谥袊乇硭械臐舛茸罡呖蛇_4 870 ng·L-1，遠遠高于世界上許多國家河流的檢出濃度。在中國桂林會仙濕地中，檢測到6種SAs，包括磺胺吡啶(sulfapyridine, SPY)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine, SMR)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine, SM2)、磺胺甲氧噠嗪(sulfamethoxypyridazine, SMP)、磺胺喹噁啉(sulfaquinoxaline, SQ)和磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMZ)，其復合污染對水生態(tài)環(huán)境產生中高風險[4]。SAs混合物對青海弧菌Q67的拮抗作用存在濃度依賴性[11]。

陳瓊[12]考察磺胺甲惡唑等5種SAs對蛋白核小球藻的聯合效應，發(fā)現混合與單個物質的毒性效應沒有明顯差別。磺胺喹噁啉等6種SAs組成的混合物對大型溞表現出協同效應[13]。磺胺吡啶等5種SAs組成的混合物對青?；【鶴67呈現加和效應和拮抗作用[11]。宋雪薇等[14]研究發(fā)現，在單一暴露下，SAs會促進大腸桿菌的突變效應；聯合暴露下，SAs對大腸桿菌突變效應的影響為相加效應。不同類型抗生素的二元混合物對明亮發(fā)光桿菌的等比急性聯合毒性表現為加和效應[15]。雖然SAs混合物毒性已開展一些研究，但SAs對綠藻的聯合毒性缺乏系統(tǒng)研究，對綠藻的毒性相互作用也未知。

綠藻是水生態(tài)系統(tǒng)的初級生產者，其生存狀況與水質有密切關系，可以利用綠藻的生長狀況反映水體的毒性。藻類構成了食物鏈的基礎，其種群數量的減少將直接影響整個水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡。研究表明，幾乎所有磺胺類藥物均能對藻類產生毒性作用[16]，對SAs毒性作用反應較為敏感的斜生柵藻是淡水中常見的浮游藻類，極喜在營養(yǎng)豐富的靜水中繁殖，且繁殖迅速、適應性強[17-18]，適合作為SAs受試生物。

本文以日常生活和生產中使用量較大的6種SAs：磺胺吡啶(sulfapyridine, SPY)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine, SMR)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine, SM2)、磺胺甲氧噠嗪(sulfamethoxypyridazine, SMP)、磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMZ)、磺胺喹噁啉(sulfaquinoxaline, SQ)，以及其二元混合物體系(共75條混合物射線)為研究對象，以斜生柵藻(Scenedesmusobliquus, So)為受試生物，利用96孔微板測定單一SAs和其二元混合物對So的毒性效應，基于濃度加和(concentration addition, CA)和獨立作用(independent action, IA)模型分析混合物的聯合毒性及毒性相互作用，研究結果將為科學、客觀地評價SAs的環(huán)境風險提供數據參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗藻種斜生柵藻購自中國科學院淡水藻種庫。該藻采用BG11培養(yǎng)基，放入恒溫光照培養(yǎng)箱中，于22 ℃、照度3 000 lx和光暗比12 h∶12 h條件下培養(yǎng)。經過藻種復蘇和藻液的傳代后用于實驗，實驗時采用處于對數生長期的藻。

6種SAs包括SPY、SMR、SM2、SMP、SMZ和SQ均購自美國Cato Research Chemicals Inc，純度均>98%，其基本信息如表1所示。

1.2 毒性測試、曲線擬合及混合物設計

So的毒性測定參照文獻方法[19]。生長抑制毒性表達為毒物對So的生長抑制率(I)：

I=1-(ODt,i-ODt,0)/(OD0,i-OD0,0)

(1)

式中：ODt,0和ODt,i分別是實驗組暴露0 h和96 h后藻液的光密度(OD)值；OD0,0和OD0,i分別是空白對照組暴露0 h和96 h后藻液的OD值。

對于濃度-效應關系采用Weibull函數(式2)或Logit函數(式3)進行非線性擬合，公式分別為：

y=1-exp(-exp(α+β*log10(c)))

(2)

y=1/(1+exp(-α-β*log10(c)))

(3)

式中：α和β是函數的位置參數和斜率參數；y為效應，即毒物對指示生物的抑制率；c為毒物的濃度。

以6種SAs為混合物組分，構建15個二元混合物體系。每個混合物體系采用直接均分射線法[21]設計5條二元混合物射線(R1、R2、R3、R4和R5)，在每條射線上設計12個濃度梯度。

表1 6種磺胺類抗生素(SAs)理化性質及濃度-效應擬合曲線參數Table 1 Physicochemical properties of six sulfonamide antibiotics (SAs) and their concentration-effect fitting curve parameters

1.3 毒性相互作用評估

采用CA和IA模型預測混合物毒性[22-25]，CA模型數學表達式為：

(4)

式中：ECx,i表示混合物中第i個化合物單獨存在時產生的效應與混合物總效應x%相同時的濃度，ci是混合物中第i個化合物濃度，m是混合物組分數。

IA模型數學表達式為：

(5)

式中：ci是混合物中第i個組分的濃度，cmix是混合物的總濃度，E(ci)是第i個組分獨立存在時產生的效應，E(cmix)是混合物的效應。

如果由CA和IA模型預測的混合物濃度-響應曲線(CRCs)位于混合物實際觀測毒性的95% OCI 內、95% OCI上限的上方或95% OCI下限的下方，則稱該混合物組分間分別是加和作用(即沒有毒性相互作用)、拮抗作用或協同作用[26]。

為提高混合物相互作用評估的準確性，采用基于效應的模型偏移率(effect-based model deviation ratio, MDRE)[27]定量評估混合物的相互作用，其表達式為：

(6)

式中：EPred為某指定效應下參考模型CA或IA預測的效應，可通過CA或IA模型計算；EObs為混合物的實驗效應。

在指定效應下，MDRE判斷混合物毒性相互作用為：當MDRE<1、MDRE>1時分別表示協同作用、拮抗作用。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 6種SAs對So的單一毒性

6種SAs對So的濃度-效應數據均可通過Weibull函數或者Logit函數擬合，其擬合模型參數(回歸參數α和β值，統(tǒng)計參數R2和RMSE)如表1所示，6種SAs的濃度-效應擬合曲線(CRCs)如圖1所示。由表1可知，6種SAs的R2值均>0.94，且所有RMSE值均<0.03，表明擬合結果準確、可靠。以半數效應濃度的負對數值(pEC50)作為毒性指標，pEC50的數值越大，毒性越大[28]，6種受試SAs對So的毒性順序為：SQ(pEC50=5.311)>SPY(pEC50=3.757)≈SMZ(pEC50=3.749)>SMP(pEC50=3.680)>SM2(pEC50=3.090)>SMR(pEC50=2.595)，可見，毒性最大的是SQ，最小的是SMR。對比6種受試SAs的化學結構特征，發(fā)現SQ相較于其他5種SAs在結構上多出一個環(huán)狀結構，這可能是其毒性最大的原因。因此，不同種SAs的單一毒性不同，可能與其自身結構有關。

丁婷婷等[11]研究了SPY等多種SAs對青海弧菌Q67的16 h毒性效應，毒性大小順序為SPY(pEC50=3.41)>SM2(pEC50=3.21)?？梢?，對于斜生柵藻和青海弧菌Q67，SPY的毒性均大于SM2。此外，陳瓊[12]以蛋白核小球藻為受試生物，考察SPY等多種SAs的毒性效應，發(fā)現SAs對蛋白核小球藻的毒性作用不是很明顯，其毒性強度沒有達到50%，故不能比較毒性物質之間的毒性大小。因此，從毒性效果來看，斜生柵藻對SAs的毒性敏感度明顯優(yōu)于蛋白核小球藻，可作為一種快速有效的毒性測試生物。

圖1 6種SAs對斜生柵藻的濃度-效應曲線(CRCs)注：圖中散點表示實測數據，實線表示擬合線。Fig. 1 The concentration-response curves (CRCs) of six SAs to Scenedesmus obliquusNote: Dispersed point and black solid lines in the diagram refer to the observed data and fitted lines, respectively.

2.2 SAs二元混合物對So的聯合毒性

15個SAs二元混合體系共75條射線的濃度-效應數據可用Weibull函數或者Logit函數有效擬合，其擬合模型參數R2均>0.90，RMSE均<0.06，擬合效果顯著，擬合CRCs繪于圖2。6種受試SAs組成的15個二元混合體系的pEC50介于2.336～4.566間，其中，SPY-SMP、SPY-SMZ、SMR-SM2和SMR-SMZ等4個混合體系所有射線的pEC50均大于相應SAs單獨存在時的pEC50，而其余11個混合體系的pEC50有大于、介于或小于相應SAs單獨存在時的pEC50等多種情況，表明在二元混合體系中發(fā)生了毒性相互作用，使其毒性增大或降低。各個混合體系5條射線的pEC50的標準偏差介于0.09～0.66間，其中SPY-SMZ混合體系pEC50的標準偏差最小，而SMR-SMP混合體系pEC50的標準偏差最大，因此SMR-SMP混合物的毒性差異最大，SPY-SMZ混合物的毒性差異最小。

由圖2可知，在6種受試SAs的15個二元混合物體系中，大部分混合體系的5條射線的抑制率隨組分的濃度比均有較明顯的變化，呈現為低濃度區(qū)毒性差異不明顯、中高濃度區(qū)毒性差異明顯；但SPY-SMZ混合體系的5條射線、SMR-SMZ混合體系的射線R1和R2、SMR-SM2混合體系的射線R1和R4以及SM2-SQ混合體系的射線R2和R3沒有完全分開甚至重疊，這可能與這些混合物組分的毒性大小或濃度比差異大小有關，如SPY、SMZ的毒性無差異，SMR-SMZ體系R1和R2射線的濃度比變化不大。這表明大部分SAs混合物對So的聯合毒性存在組分濃度依賴性，而小部分SAs混合物毒性則不存在組分濃度依賴性，因此混合物毒性不僅受組分濃度比影響，還與混合物的濃度、組分毒性大小和組分的相互作用等有關。大量污染物聯合毒性研究表明，混合物毒性具有混合組分濃度比依賴性是常見現象[29]。趙鋒[30]研究發(fā)現氯吡嘧磺隆、丁草胺、硝磺草酮和莠去津4種除草劑二元和三元(等毒比)混合對月牙藻的毒性隨著毒物濃度的升高而增大。有研究認為SPY、SM2等5種SAs的二元混合物體系的毒性沒有明顯差異，可能與這5種SAs對青海弧菌Q67的毒性差異并非十分明顯有關[11]。由于混合物毒性的復雜性，具體混合物中何種SAs存在可能使混合物毒性具有組分濃度依賴性需要進一步研究。

2.3 SAs二元混合物毒性作用

基于CA和IA模型對SAs的15個二元混合物體系進行評估，結果顯示15個混合物體系以拮抗作用(CA預測線位于95% OCI上限的上方)和協同作用(CA預測線位于95% OCI下限的下方)為主。以含有SPY和SMR組分的混合體系為例進行分析，因實際環(huán)境中污染物以低濃度暴露為主，故用其EC10效應下的等效線圖進行評估。等效線圖[24-25]是混合物毒理學中考察二元混合物毒性相互作用最常用的圖形方法之一。基于CA和IA模型來分析評價混合物的毒性相互作用，當混合物射線(R1～R5)位于CA和IA之間表示加和作用，位于CA或IA的下方區(qū)域表示協同作用，而位于CA或IA的上方區(qū)域表示拮抗作用。

SAs的15個二元混合物體系在10%效應下基于CA和IA模型的等效線圖如圖3所示。環(huán)境中多種化學物的聯合暴露將會產生獨立、相加、協同或拮抗等的聯合毒性作用，這種聯合毒性會發(fā)生在毒性作用過程中的不同靶點及不同途徑，包括發(fā)生在暴露相中，從而導致毒性改變[31]。在本研究中，含有組分SPY的混合體系大多呈現協同作用，且隨組分SPY濃度比的增大(R5～R1)，毒性相互作用增強。在SPY-SMR混合體系中，均呈現拮抗作用，且隨組分SPY濃度比的增大(R5～R1)，拮抗作用的強度增加；在SPY-SM2和SPY-SQ混合體系中，隨組分SPY濃度比的增大(R5～R1)，毒性相互作用增強，由拮抗作用→加和作用→協同作用；在SPY-SMP和SPY-SMZ混合體系中，均呈現協同作用，且隨組分SPY濃度比的增大(R5～R1)，協同作用增強。含有組分SMR的混合體系均呈現拮抗作用，且隨著組分SMR濃度比的增大(R5～R1)，拮抗作用增強。這說明混合體系的組分濃度比可能是影響混合物體系相互作用發(fā)生變化的重要因素。相關研究發(fā)現，環(huán)丙沙星、土霉素與銅的絡合作用會形成不同比例的絡合物，其聯合毒性隨抗生素與重金屬混合比例的改變而呈現不同的作用類型[32]。莫凌云等[33]研究發(fā)現混合物的毒性相互作用大小隨著組分濃度比變化而發(fā)生變化。綜上所述，混合體系組分的濃度比不同會產生不同的相互作用類型。

此外，混合物的毒性相互作用還與混合物組分構成關系密切。在本研究中，含有組分SPY的混合體系，即SPY-SMR、SPY-SM2、SPY-SMP、SPY-SMZ和SPY-SQ這5個混合體系，大多呈現協同作用，且隨著SPY濃度比的增大，毒性相互作用增強。而含有組分SMR的混合體系均呈現拮抗作用，且隨著組分SMR濃度比的增大，拮抗作用增強。蔡夢婷等[34]采用相加指數法求得土霉素-銅、諾氟沙星-銅復合暴露對小球藻的聯合作用類型分別為拮抗和協同作用。另有研究發(fā)現毒死蜱、氯氰菊酯和多菌靈的二元及三元混合體系對小球藻的聯合作用類型均為協同作用[35]。因此，混合體系組分的構成不同會產生不同的相互作用類型。

圖2 SAs的15個二元混合物體系各混合物射線對斜生柵藻的擬合濃度-效應曲線Fig. 2 The fitted concentration-effect curves of various rays in 15 groups of SAs binary mixtures to Scenedesmus obliquus

圖3 基于濃度加和(CA)和獨立作用(IA)模型的SAs二元混合體系等效線圖注：“●”表示EC10值，“——”表示置信區(qū)間，“——”表示CA預測，“——”表示IA預測。Fig. 3 Equivalent line diagram of binary SAs mixed system based on concentration addition (CA) and independent action (IA) modelsNote: “●” indicates the EC10 value, “——” indicates the confidence interval, “——” indicates the CA prediction, and “——” indicates the IA prediction.

基于效應的MDR方法定量表征SAs的15個二元混合物體系在0.8%～90%實驗效應范圍內的相互作用，結果如圖4所示。在實驗效應范圍內，混合物MDRCA和MDRIA值分別介于0.14～10.59和0.16～13.02，MDRCA和MDRIA值<1的比例分別為63.89%和54.44%，即在混合物所有實驗濃度下，6種受試SAs組成的二元混合物發(fā)生協同作用的概率超過50%。實驗效應在20%以內時，隨著效應和混合物濃度降低，拮抗作用發(fā)生概率明顯增大；當實驗效應≥20%后，隨著效應和混合物濃度增大，協同作用發(fā)生概率顯著增大。SPY-SMP、SPY-SMZ和SPY-SQ這3個二元混合體系所有射線的MDRCA和MDRIA值均<1且隨著效應和混合物濃度的降低而逐漸降低，說明這3個混合體系在所有實驗效應范圍均發(fā)生了協同作用，且在低效應和低濃度區(qū)域的協同作用最強。SMR-SM2混合體系所有射線的MDRCA和MDRIA值均>1，反映出該混合物在所有實驗效應范圍均發(fā)生了拮抗作用。SMP-SMZ混合體系R1、R2、R3射線的MDRCA和MDRIA值均<1而R4、R5射線的值均>1，說明該混合體系R1、R2、R3射線發(fā)生協同作用而R4、R5射線卻發(fā)生拮抗作用。SPY-SMR混合體系R1、R2、R3射線的MDRCA和MDRIA值均>1，R4、R5射線在實驗效應<25%時MDRCA和MDRIA值>1，而當實驗效應>25%時則<1，反映出該混合體系R1、R2、R3射線發(fā)生拮抗作用而R4、R5射線在低效應區(qū)發(fā)生拮抗作用，但高效應區(qū)則發(fā)生協同作用。綜上所述，基于效應的MDR方法可以準確判斷混合物間及濃度區(qū)間發(fā)生的相互作用，識別混合物產生拮抗、加和或協同作用與混合物組分、濃度比和混合物濃度等的關系，可為實際環(huán)境混合物風險的精準管控提供科學依據。

圖4 基于CA和IA模型的SAs二元混合物模型偏移率(MDR)Fig. 4 The model deviation ratio (MDR) value of SAs binary mixture based on CA and IA models

通訊作者簡介：覃禮堂(1982—)，男，博士，教授，主要研究方向為環(huán)境毒理學。

共同通訊作者簡介：曾鴻鵠(1970—)，女，博士，教授，主要研究方向為環(huán)境生態(tài)風險評估。