朱思俞，劉煥，韓文娜，李中意，柳春紅,*

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣州 510642 2. 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642

鄰苯二甲酸酯類(phthalate esters, PAEs)是一類用途廣泛的工業(yè)化學(xué)品，作為增塑劑以軟化聚氯乙烯產(chǎn)品[1]。PAEs是目前世界上生產(chǎn)量大、應(yīng)用面廣的人工合成有機(jī)化合物之一，是一類重要的環(huán)境激素類化合物。近年來(lái)，隨著工業(yè)生產(chǎn)和塑料制品的大量使用，導(dǎo)致PAEs在大氣、水體和土壤等自然環(huán)境中普遍存在[2]。PAEs類物質(zhì)目前已廣泛存在于人體組織中，對(duì)人體健康產(chǎn)生極大危害。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(United States Environmental Protection Agency, US EPA)將6種PAEs列為優(yōu)先控制污染物，包括鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate, DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate, DEP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate, DBP)、鄰苯二甲酸芐基丁酯(benzyl butyl phthalate, BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(bis(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)和鄰苯二甲酸二正辛酯(di-n-octyl phthalate, DNOP)[3]。已有研究證明，PAEs的毒理學(xué)效應(yīng)主要有類雌激素效應(yīng)，生殖毒性、發(fā)育毒性以及其他毒性[4]。此外，暴露于DEHP的嚙齒類動(dòng)物的肝細(xì)胞發(fā)生癌變，促進(jìn)線粒體增殖、凋亡等[5]。

肝臟是PAEs毒性的靶器官，PAEs暴露會(huì)影響肝功能[6]。而線粒體在肝細(xì)胞中含量豐富，當(dāng)肝細(xì)胞暴露于PAEs時(shí)，線粒體生物發(fā)生障礙[7]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A, Tfam)是調(diào)控線粒體生物發(fā)生最重要的調(diào)控因子之一，參與線粒體DNA(mtDNA)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及拷貝數(shù)的調(diào)節(jié)[8]。Tfam缺失會(huì)導(dǎo)致線粒體生物發(fā)生的降低和線粒體功能障礙，而線粒體作為“細(xì)胞能量工廠”，當(dāng)線粒體生物合成降低時(shí)，線粒體向細(xì)胞傳遞危險(xiǎn)信號(hào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞走向死亡[9]。但關(guān)于PAEs是如何影響Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的研究甚少。通過(guò)PAEs對(duì)Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響，可進(jìn)一步預(yù)測(cè)PAEs對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體的影響。然而，由于PAEs類似物種類多，逐一測(cè)其對(duì)Tfam蛋白的影響較為繁雜。

三維定量構(gòu)效關(guān)系(three dimension quantitative structure-activity relationship, 3D-QSAR)是以配體和靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，根據(jù)分子的內(nèi)能變化和分子間的相互作用的能力變化，預(yù)測(cè)化合物的活性[10]，通過(guò)以部分有機(jī)化合物的生物毒性數(shù)據(jù)與結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)建模，進(jìn)而預(yù)測(cè)其他結(jié)構(gòu)類似化合物的生物毒性，是當(dāng)前環(huán)境化學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)前沿課題[11]?；谏鲜霰尘?，本文通過(guò)測(cè)定PAEs對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體中Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響，采用比較分子相似法(comparative molecular similarity indices analysis, CoMSIA)構(gòu)建定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系模型，揭示不同結(jié)構(gòu)的PAEs對(duì)HepG2細(xì)胞的線粒體毒性影響，為更好地對(duì)環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估以及設(shè)計(jì)新型無(wú)毒的PAEs提供有利的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人源肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞及MEM(minimum essential medium)培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)武漢普諾賽有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、6種鄰苯二甲酸酯類化合物(種類見(jiàn)表2，純度均≥99%)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；RIPA裂解液、BCA蛋白試劑盒購(gòu)于中國(guó)上海碧云天公司；Anti-GAPDH抗體購(gòu)自Affinity；Anti-Tfam抗體購(gòu)自Cell Signal Technology。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

細(xì)胞培養(yǎng)基選擇MEM完全培養(yǎng)基，其中添加10%(V∶V)的胎牛血清、1%(V∶V)青霉素鏈霉素以及1%(V∶V)L-谷氨酰胺，放入37 ℃，5%(V∶V)CO2的培養(yǎng)箱，隔天更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以此階段細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。準(zhǔn)確稱取一定量的鄰苯二甲酸酯類化合物溶于DMSO中，使最終母液濃度為1 mol·L-1，后經(jīng)過(guò)濾除菌后保存于-20 ℃中。

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板中，根據(jù)前期細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究[12]，24 h貼壁后用不同濃度的PAEs(0、125、250、500和1 000 μmol·L-1)作用48 h。

1.3 蛋白免疫印跡法

將預(yù)處理后的細(xì)胞置于冰上，用含PMSF和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，并將其收集于EP管中，離心。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)濃度。然后在10%(V∶V)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(SDS-PAGE)上電泳等量的蛋白質(zhì)。蛋白分離后，將凝膠轉(zhuǎn)到PVDF膜上，并使用5%的脫脂奶粉于室溫下封閉1.5 h，加入一抗于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。隨后，于室溫條件下將PVDF膜與二抗孵育1.5 h。最后，通過(guò)ECL顯色，通過(guò)軟件Image J軟件對(duì)其灰度進(jìn)行量化分析。

1.4 三維定量構(gòu)效關(guān)系建模與分析

本實(shí)驗(yàn)采用SYBYL2.1.1軟件各模塊完成，利用CoMSIA法進(jìn)行3D-QSAR分析。以分子的最低能量構(gòu)象作為優(yōu)勢(shì)穩(wěn)定構(gòu)象，對(duì)每個(gè)分子在Tripos力場(chǎng)中用分子程序Minimize進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，分子電荷采用Gasteiger-Huckel電荷，用Powell能量梯度法，最大優(yōu)化次數(shù)為1 000，能量收斂限定為0.005 kJ·mol-1。以化合物DBP、DEP和DNOP為預(yù)測(cè)集，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測(cè)能力，其余的PAEs化合物作為訓(xùn)練集。

利用偏最小二乘(PLS)進(jìn)行留一法(LOO)交叉驗(yàn)證得到內(nèi)部交叉驗(yàn)證系數(shù)(Q2)以及最佳主成分?jǐn)?shù)(n)，并以非交叉驗(yàn)證方法計(jì)算出模型的非交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(R2)、并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEE)、Fisher檢驗(yàn)值(F)以及各分子場(chǎng)的貢獻(xiàn)值。

1.5 CoMSIA模型的外部驗(yàn)證及應(yīng)用域

通過(guò)Golbraikh-Tropsha統(tǒng)計(jì)方法來(lái)評(píng)價(jià)QSAR模型的外部預(yù)測(cè)能力[13]。采用KNIME Analytics Platform進(jìn)行上述分析。通過(guò)Enalos KNIME節(jié)點(diǎn)預(yù)測(cè)QSAR模型的擬合質(zhì)量與預(yù)測(cè)能力，對(duì)于本文引入的外部預(yù)測(cè)能力評(píng)價(jià)方法，所建立的模型必須滿足以下條件[14]：

該QSAR模型的適用范圍通過(guò)杠桿值(leverage,h)的Williams圖(即標(biāo)準(zhǔn)化與杠桿值)來(lái)表征[13]，其中標(biāo)準(zhǔn)化殘差為δ、杠桿值為h、警告杠桿值為h*。標(biāo)準(zhǔn)化殘差的絕對(duì)值>3的化合物即被定義為異常值，若預(yù)測(cè)的PAEs類化合物殘差在這個(gè)范圍內(nèi)，即可說(shuō)明所建立的QSAR模型預(yù)測(cè)是可靠的。關(guān)于Williams圖中的δ與h、h*計(jì)算公式如下：

式中：xi為目標(biāo)化合物的模型變量所形成的向量，X為訓(xùn)練集的自變量矩陣。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 PAEs對(duì)HepG2細(xì)胞中Tfam蛋白表達(dá)量的影響

6種PAEs對(duì)HepG2細(xì)胞中Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響如圖1所示，當(dāng)PAEs以低濃度作用于HepG2細(xì)胞48 h后，其中DEP在作用濃度為125 μmol·L-1時(shí)增加Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量，其余PAEs化合物在低濃度對(duì)Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響不顯著。然而，當(dāng)PAEs的濃度為1 000 μmol·L-1時(shí)，均降低HepG2細(xì)胞中Tfam蛋白的相對(duì)表達(dá)，其中DBP、DMEP、DNOP、DEHP對(duì)Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量影響較大(P<0.01)，且經(jīng)DBP、DNOP作用的HepG2細(xì)胞中Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量較其余4種PAEs低，提示DBP、DNOP對(duì)HepG2細(xì)胞的線粒體毒性相對(duì)較強(qiáng)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PAEs作用的HepG2細(xì)胞，其Tfam蛋白表達(dá)水平有顯著下降的趨勢(shì)[15-16]。本研究中，PAEs化合物對(duì)Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響表現(xiàn)出一定差異，但當(dāng)PAEs的作用濃度為1 000 μmol·L-1時(shí)，均降低Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量，因此在后續(xù)研究不同結(jié)構(gòu)的PAEs對(duì)HepG2細(xì)胞中Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響以1 000 μmol·L-1進(jìn)行建模。PAEs是由鄰苯二甲酸酐與醇類化合物在一定的條件下酯化形成，其多樣性表現(xiàn)于醇類化合物不同的側(cè)鏈基團(tuán)[17]，其結(jié)構(gòu)有一定的差異性，因此接下來(lái)意在通過(guò)CoMSIA方法分析PAEs對(duì)HepG2細(xì)胞中Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響以及PAEs分子結(jié)構(gòu)在調(diào)控線粒體生物發(fā)生中的作用，預(yù)測(cè)PAEs結(jié)構(gòu)差異對(duì)HepG2細(xì)胞的線粒體毒性影響。

2.2 PAEs與HepG2細(xì)胞中Tfam的定量構(gòu)效關(guān)系

2.2.1 CoMSIA模型的評(píng)估和驗(yàn)證

通過(guò)PLS計(jì)算和分析，得出CoMSIA模型的評(píng)估參數(shù)和分子貢獻(xiàn)率(表1)。CoMSIA模型的最佳組件數(shù)(n)為3，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(Q2)為0.508，非交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(R2)為0.983，SEE為0.017，F(xiàn)isher驗(yàn)證值為37.962。由于模型的Q2>0.5且R2>0.9，表明模型具有良好的預(yù)測(cè)能力及擬合能力[18-19]。6種PAEs化合物的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值見(jiàn)表2，并根據(jù)兩者的關(guān)系構(gòu)建線性回歸圖。如圖2所示，模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值高度吻合，斜率為0.9316，且預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間的決定系數(shù)為0.9823，即表明所構(gòu)建的CoMSIA具有較高的內(nèi)部預(yù)測(cè)能力，可以用于預(yù)測(cè)PAEs對(duì)Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響，進(jìn)一步預(yù)測(cè)對(duì)HepG2細(xì)胞的線粒體毒性。

圖1 鄰苯二甲酸酯類(PAEs)以濃度為125、250、500和1 000 μmol·L-1處理48 h對(duì)HepG2細(xì)胞中Tfam相對(duì)表達(dá)量的影響注：(a) 經(jīng)PAEs作用的Western blot條帶，(b) 鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)，(c) 鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)，(d) 鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)，(e) 鄰苯二甲酸二(2-乙基)酯(DEHP)，(f) 鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)，(g) 鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)；n=3；與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig. 1 Effects of phthalate esters (PAEs) on the relative expression of Tfam in HepG2 cells treated with 125, 250, 500, 1 000 μmol·L-1 for 48 hNote: (a) Western blot strips of PAEs treatment groups, (b) Dibutyl phthalate (DBP), (c) Dimethyl phthalate (DMP), (d) Diethyl phthalate (DEP), (e) Bis(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), (f) Di-n-octyl phthalate (DNOP), (g) Bis(2-methoxyethyl) phthalate (DMEP); n=3; compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.

在CoMSIA模型中，立體場(chǎng)、靜電場(chǎng)、疏水場(chǎng)、氫鍵供體場(chǎng)及氫鍵受體場(chǎng)的貢獻(xiàn)分別為11.90%、29.60%、30.90%、0.00%和27.60%，即提示空間效應(yīng)、帶電基團(tuán)分布、疏水效應(yīng)和氫鍵供體均影響Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.2.2 外部預(yù)測(cè)能力

圖2 實(shí)驗(yàn)測(cè)定與模型預(yù)測(cè)的Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量之間的線性回歸分析Fig. 2 Linear regression analysis between experimental data and predicted data of Tfam protein relative expression

2.2.3 應(yīng)用域

Williams圖一般用于評(píng)價(jià)所建立QSAR模型的應(yīng)用域，在Williams圖中，當(dāng)數(shù)據(jù)點(diǎn)杠桿值(h)大于警告杠桿值(h*)時(shí)，表明該數(shù)據(jù)點(diǎn)可能影響模型，標(biāo)準(zhǔn)化殘差的絕對(duì)值>3的化合物即被認(rèn)為是響應(yīng)離群值[19]。如圖3所示，實(shí)驗(yàn)所得PAEs數(shù)據(jù)點(diǎn)的h均小于h*且其標(biāo)準(zhǔn)化殘差的絕對(duì)值全部落入(-3, 3)的閾值范圍內(nèi)，表明該模型具有良好的預(yù)測(cè)結(jié)果，能夠覆蓋廣泛的結(jié)構(gòu)應(yīng)用域。

表1 CoMSIA模型的統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table 1 The statistical parameters of CoMSIA models

表2 PAEs對(duì)HepG2細(xì)胞中Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的實(shí)驗(yàn)值與模型分析值Table 2 The experimental and model-predicted values of Tfam protein relative expression in HepG2 cells by PAEs

2.2.4 基于DNOP物質(zhì)對(duì)CoMSIA模型三維等高圖進(jìn)行分析

根據(jù)圖4中DNOP的基本骨架，結(jié)合CoMSIA模型圖(圖5)，探究PAEs分子結(jié)構(gòu)對(duì)Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響。

在立體場(chǎng)中，R與R’基團(tuán)中主鏈上出現(xiàn)黃色色塊，即表明在主鏈上其基團(tuán)體積越大，Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量減少。但在R與R’基團(tuán)中側(cè)鏈上出現(xiàn)綠色色塊，即表明在側(cè)鏈上若存在大體積的基團(tuán)，將促進(jìn)Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)，例如化合物DEHP，其R與R’基團(tuán)中側(cè)鏈引入乙基，對(duì)比相同分子量的DNOP，DNOP在R與R’基團(tuán)上無(wú)側(cè)鏈，因此經(jīng)DEHP作用的HepG2細(xì)胞中Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，且綠色色塊占主導(dǎo)作用。

圖3 模型的應(yīng)用域Fig. 3 Application domain of model

圖4 鄰苯二甲酸酯類的基本骨架Fig. 4 Basic skeleton of phthalate esters

圖5 DNOP在CoMSIA模型的三維等高線圖注：(a)立體場(chǎng)；(b)靜電場(chǎng)；(c)疏水場(chǎng)；(d)氫鍵受體場(chǎng)。Fig. 5 DNOP’s three-dimensional contour maps in the CoMSIA modelNote: (a) The steric field; (b) The electrostatic field; (c) The hydrophobic field; (d) The acceptor field.

在靜電場(chǎng)中，在3、4號(hào)位上出現(xiàn)大面積的藍(lán)色色塊，即在上述位點(diǎn)引入正電基團(tuán)會(huì)導(dǎo)致Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量增加。在R與R’基團(tuán)上出現(xiàn)紅色色塊，當(dāng)R與R’基團(tuán)為負(fù)電基團(tuán)時(shí)，增加Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量，例如化合物DMEP，其R與R’基團(tuán)引入電負(fù)性較強(qiáng)的甲氧基，對(duì)比物質(zhì)DBP在R與R’基團(tuán)上引入電負(fù)性較弱的甲基，因此經(jīng)DMEP作用的HepG2細(xì)胞中Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量增加。

在疏水場(chǎng)中，苯環(huán)上及R與R’基團(tuán)出現(xiàn)大面積的黃色色塊，即在上述位點(diǎn)上增加疏水基團(tuán)會(huì)增加Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量，由于烷基是疏水基團(tuán)，因此在R與R’基團(tuán)上連接的烷烴鏈越長(zhǎng)，其疏水性越強(qiáng)，Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量增加。例如物質(zhì)DEHP是由鄰苯二甲酸酐與2-乙基己醇結(jié)合形成的物質(zhì)，其R與R’基團(tuán)疏水性較強(qiáng)，因此Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量較高。

在氫鍵受體場(chǎng)中，紅色色塊主要出現(xiàn)在3、4號(hào)位上，紫紅色主要出現(xiàn)在R與R’基團(tuán)上，即說(shuō)明在R與R’基團(tuán)上增加氫鍵受體，Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量增加。由于氫鍵供體場(chǎng)的貢獻(xiàn)率為0，因此本文未出現(xiàn)氫鍵供體場(chǎng)的等高線圖。例如化合物DMEP，此物質(zhì)是由鄰苯二甲酸酐與甲氧基乙醇在酸性條件下酯化而成，在R與R’基團(tuán)上引入了2對(duì)孤對(duì)電子，即多了2個(gè)氫鍵受體，所以經(jīng)DMEP作用的HepG2細(xì)胞中的Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量增加。

有研究表明DMP、DNOP的R與R’基團(tuán)上引入疏水基團(tuán)，能夠降低PAEs的毒性[20]，此結(jié)果與本研究結(jié)果類似，可推測(cè)當(dāng)在PAEs的支鏈引入疏水基團(tuán)時(shí)，Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，進(jìn)一步降低PAEs的線粒體毒性。近些年，在改善PAEs結(jié)構(gòu)、設(shè)計(jì)環(huán)境友好型塑化劑的研究中發(fā)現(xiàn)，在鄰苯二甲酸酯類支鏈引入大體積、疏水性強(qiáng)、負(fù)電基團(tuán)和增加氫鍵受體能夠降低PAEs的毒性[20]。

3 討論(Discussion)

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)PAEs以1 000 μmol·L-1的濃度作用于HepG2細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比其Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降，通過(guò)3D-QSAR方法定量分析了PAEs對(duì)Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響，該3D-QSAR模型具有良好的內(nèi)、外部預(yù)測(cè)能力且具有覆蓋此類結(jié)構(gòu)的廣泛應(yīng)用域。

此外，定量構(gòu)效關(guān)系結(jié)果表明，在PAEs類中R與R’基團(tuán)上引入電負(fù)性大、疏水性強(qiáng)、氫鍵受體多的基團(tuán)，增加PAEs類物質(zhì)處理組HepG2細(xì)胞中Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量，影響HepG2細(xì)胞中線粒體生物發(fā)生，降低PAEs對(duì)HepG2細(xì)胞的線粒體毒性。通過(guò)對(duì)6種PAEs化合物對(duì)Tfam蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響進(jìn)一步預(yù)測(cè)此類物質(zhì)對(duì)HepG2細(xì)胞的線粒體毒性效應(yīng)和定量構(gòu)效關(guān)系，為預(yù)測(cè)新型PAEs對(duì)Tfam的影響提供了一個(gè)潛在的工具，并為今后設(shè)計(jì)無(wú)毒的新型PAEs提供參考。

通訊作者簡(jiǎn)介：柳春紅(1968—)，女，博士，教授，主要研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與毒理學(xué)。