侯琳，徐建,2，梁雪芳，金小偉

1. 中國環(huán)境科學研究院環(huán)境健康風險評估與研究中心，北京 100012 2. 中國環(huán)境科學研究院國家環(huán)境保護化學品生態(tài)效應與風險評估重點實驗室，北京 100012 3. 中國環(huán)境監(jiān)測總站，北京 100012 4. 內蒙古大學生態(tài)與環(huán)境學院，呼和浩特 010021

三唑酮是一種三唑類殺菌劑，占全球三唑類殺菌劑消費量[1]的30%以上。三唑酮在水環(huán)境中的普遍存在及其對水生生物的潛在不利影響已經引起廣泛關注。由于農藥的有效利用率極低[2]，大量殘留的三唑酮進入水環(huán)境，其使用區(qū)域的臨近水體檢測出了較高濃度的三唑酮[1,3]。在中國的九龍江、太湖和白洋淀等地均有三唑酮的檢出，最高檢出濃度為12 μg·L-1[3-6]。三唑酮具有穩(wěn)定性強，流動性和吸附性好等特點，可在水生生物體內累積并發(fā)生生物轉化[7-9]，對水生生物產生毒性效應。例如，三唑酮可影響生物體的發(fā)育[10-12]、繁殖[13-14]，引起神經毒性[15]、肝毒性[16]、心血管毒性[17]和氧化應激等[18-19]。三唑酮主要影響兩棲動物的變態(tài)發(fā)育，農藥的使用可能是兩棲動物種群數量下降的原因之一[20]。三唑酮通過改變下丘腦-垂體-甲狀腺軸(hypothalamic-pituitary-thyroid, HPT)相關基因的表達來干擾甲狀腺激素的分泌，影響胚胎的孵化率，降低魚類[13]和兩棲動物[10]的繁殖能力。三唑酮影響兩棲動物和魚類生殖能力的另一途徑是抑制睪酮向雌二醇的轉化[12,21]。目前，關于三唑酮的毒性機制研究主要集中在高營養(yǎng)級的脊椎動物，如兩棲動物和魚類，而其對低營養(yǎng)級水生無脊椎動物的毒性效應研究相對較少，劉娜等[22]關于三唑酮毒性效應的研究發(fā)現三唑酮對大型溞蛻皮產生毒性作用，且其敏感性高于生長和繁殖，并進一步整理出三唑酮的有害結局路徑[23]，結果表明三唑酮可能通過抑制P450酶的活性從而降低甲殼類動物蛻皮激素的活性。目前仍缺少關于三唑酮對大型溞代際影響的研究以及分子機制上的探究。

由于基因組序列的可獲得性、較短的生命周期和易于處理等優(yōu)點，大型溞成為生態(tài)毒性基因組學研究的優(yōu)秀模式生物[24]，可用于評估化學品對水生生態(tài)系統(tǒng)的毒性影響[25]。大型溞處于藻-溞-魚水環(huán)境食物鏈的中間位置，占據相對重要的生態(tài)位[26]，因此，有關大型溞的毒性效應研究可能對整個水生環(huán)境食物鏈具有一定的參考作用。

本研究在整理歸納三唑酮的毒性效應和機制的基礎上，開展大型溞的多代試驗，探索三唑酮對大型溞的生長和繁殖毒性以及相應的毒性作用機制和途徑。試驗期間記錄并分析大型溞的體長及產溞數量等指標，使用HiSeq平臺進行轉錄組測序，分析處理組與對照組的差異表達基因及其功能富集通路，為探索三唑酮對水生無脊椎動物的毒性機制提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 培養(yǎng)條件

試驗所用大型溞為本實驗室(中國環(huán)境監(jiān)測總站)連續(xù)穩(wěn)定培養(yǎng)5代以上的單克隆品系，個體之間差異較小。按照OECD 211 (Organization for Economic Co-Operation and Development)[27]的要求，大型溞培養(yǎng)使用Elendt M4培養(yǎng)基(配制所需化學藥品均購自上海國藥集團化學試劑有限公司)，置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為(21±1) ℃，每天光照16 h，黑暗8 h，光照強度在1 110～1 480 lx。每日以羊角月牙藻喂養(yǎng)，投餌密度為3.0×105～4×105cells·mL-1。藻類按照OECD 201[28]要求培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度設為(23±1) ℃，每天光照10 h，黑暗8 h，光照強度在4 440～8 880 lx，培養(yǎng)4～5 d后在5 000 r·min-1轉速下離心濃縮5 min，使用滅菌水稀釋以降低營養(yǎng)鹽濃度。

1.2 試驗設計

三唑酮購于阿拉丁有限公司(Aladdin，中國上海)，CAS號為43121-43-3，純度為99.8%。丙酮購自康林科技有限公司(中國北京)。根據ECOTOX數據庫(https:// cfpub.epa.gov/ecotox/search.cfm)中三唑酮毒性效應濃度和以往研究基礎[22]，設置6個濃度梯度，分別為5、12.5、25、50、100和200 μg·L-1(濃度從低到高依次標記為3～8)，每個濃度設置5個重復。以丙酮(<0.1 mL·L-1)為助溶劑，使用M4培養(yǎng)基配制三唑酮母液。試驗空白對照分別為M4培養(yǎng)基和含有0.02 mL·L-1丙酮的M4培養(yǎng)基(分別標記為1和2)。對照組未檢出三唑酮。

采用圖1中描述的試驗設計進行三唑酮暴露的多代試驗(F0、F1、F2)。試驗開始前，選取20只個體大、游泳能力強且懷卵多的母溞置于1 L裝有M4培養(yǎng)基的燒杯中，馴化培養(yǎng)。試驗開始時，隨機選取上述母溞所產<24 h的第三胎幼溞32只分別置于含有80 mL暴露液的100 mL燒杯中，每個燒杯一只溞，記為F0代。F0代所產<24 h的第三胎幼溞32只被選作子代F1，F1代所產<24 h的第三胎幼溞32只被選作子代F2。選擇第三胎是因為早期的幼溞(第一胎和第二胎)存活不穩(wěn)定。每代按照OECD 211[27]慢性毒性試驗標準進行21 d半靜態(tài)暴露試驗，每天更換培養(yǎng)液取出新生兒并記錄F0代大型溞的每胎產溞數量和時間以及每代相隔時間，暴露21 d后在顯微鏡下測定大型溞體長(不包括尾刺)，并取1 mL暴露液過0.22 μm濾膜，隨后保存在-20 ℃下待測。F1代和F2代出生7 d后進行轉錄組測試和基因表達分析。

1.3 三唑酮暴露液濃度檢測

暴露21 d后取暴露液1 mL，經過前處理去除雜質和影響物質，使用LC-MS/MS-8040 (島津，日本)檢測暴露液中三唑酮實際濃度。液相色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18 (1.7 μm, 50 mm×2.1 mm, Waters, MA, USA)，進樣量為5 μL，流動相由0.1%甲酸水溶液和乙腈組成。流動相流速為0.3 mL·min-1，柱溫為40 ℃。洗脫梯度如表1所示。

定量分析使用LC-MS/MS-8040 (島津，日本)完成，采用多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)與電噴霧正離子源(ESI+)模式。氮氣作為脫溶劑和霧化氣。母離子294 (m/z)，子離子197 (m/z)。名義濃度為5.00、12.50、25.00、50.00、100.00和200.00 μg·L-1的三唑酮暴露液實測濃度分別為4.72、11.36、32.02、63.24、116.79和229.00 μg·L-1。

1.4 轉錄組測序

每個處理組隨機挑選約40只大型溞作為一個生物學重復，使用TRIzol(Invitrogen，美國)提取大型溞總RNA，并使用DNaseⅠ(TaKara，大連，中國)去除基因組DNA。利用2100 Bioanalyser(Agilent，美國)、ND-2000微量分光光度計(Thermo Scientific，美國)對所提取RNA的濃度和純度進行檢測，保證所有RNA樣品的完整性(OD260/OD280=1.8～2.2, OD260/OD230≥2.0, RIN≥8.5, 28S/18S≥1.0)并進行轉錄組測序。mRNA測序基于HiSeq平臺，采用Illumina TruSeqTMRNA sample prep Kit方法進行文庫構建，主要操作流程為：提取總RNA(>1 μg)，富集mRNA，mRNA片段化，反轉成cDNA，adaptor連接，Illumina測序。

圖1 多代試驗示意圖Fig. 1 Diagram of multi-generational experiment

1.5 差異表達基因

使用RSEM(https://deweylab.biostat.wisc.edu/resm/)對基因的表達水平進行定量分析，獲得基因/轉錄本的Read Counts數后，使用DEGseq (http://bioconductor.org/packages/stats/bioc/DESeq/)軟件進行樣本間基因的表達差異分析，以FPKM(fragments per kilobases per millionreads)衡量差異表達的顯著性，使用錯誤發(fā)現率(false discovery rate, FDR)和差異倍數(fold change, FC)作為評判標準，當一個基因同時滿足FDR<0.05和|log2FC|>1時，視該基因為差異表達基因(differentially expressed gene, DEG)。

1.6 差異表達基因的KEGG富集

使用KOBAS(https:// kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)對不同組別的差異表達基因進行功能富集分析，在基因功能水平上闡述三唑酮暴露對大型溞可能的作用機制和途徑。利用KEGG數據庫，可將基因按照參與的通路或行使的功能分類，能夠識別出與生物現象最相關的生物學過程。使用BH(Benjamini and Hochberg)方法進行多重檢驗矯正P值，P≤0.05，認為此GO富集功能或KEGG通路存在顯著富集情況。

1.7 統(tǒng)計分析

本研究涉及的數據統(tǒng)計分析使用Origin 2021(OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)，The R Programming Language 4.0.3和IBM SPSS Statistics 26(BM Corporation, Armonk, NY, USA)。使用單因素方差分析進行顯著性檢驗和方差同質性檢驗，重復組取算術平均值，表示為平均值±標準差(standard deviation, SD)。P<0.05表示兩樣本間存在顯著性差異。

2 結果(Results)

2.1 三唑酮對大型溞F0代生長和繁殖的影響

F0代的體長是大型溞的生長指標，暴露結束后，在顯微鏡下測定不同三唑酮暴露濃度下大型溞的體長(不包括尾刺)，結果顯示，僅在200 μg·L-1濃度時體長明顯降低(P=0.000)，其他濃度下體長變化不顯著(圖2(a))。本研究大型溞為孤雌生殖，將F0代大型溞21 d平均每胎產溞量作為大型溞的繁殖指標，結果顯示，在濃度為100 μg·L-1和200 μg·L-1時21 d平均每胎產溞量均明顯降低(P=0.014,P=0.000)，而其他濃度下的繁殖能力差異不明顯(圖2(b))。除體長和繁殖外，本研究也記錄了不同濃度下F0代產下一代F1以及F1代產下一代F2所需要的時間間隔。通過組間方差分析發(fā)現，濃度為5、12.5、25、50和100 μg·L-1時F0從出生到產下F1的間隔時間和F1從出生到產下F2的間隔時間增加不明顯，而當濃度為200 μg·L-1時兩代世代間隔時間均顯著增加(P=0.008，P=0.000)(表2)。比較不同濃度下兩代世代間隔時間的差異可知(表2)，與對照組相比，12.5 μg·L-1(P=0.033)和100 μg·L-1(P=0.008)濃度處理下世代間隔時間顯著增加。

2.2 差異表達基因

F1和F2代大型溞在三唑酮中暴露7 d后，進行轉錄組測試分析，共獲得162.94 Gb Clean Data，且各樣品Clean Data均達到6.38 Gb以上，Q30堿基百分比在93.5%以上。轉錄組測試共檢測到20 187個基因。分別將各樣品的Clean Reads與指定的參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gen-ome/10953?genome_assembly_id=434305)進行序列比對，比對率為79.02%～91.76%?；诟鳚舛认禄虮磉_量，進行樣本間相關性分析和PCA分析，分別如圖3和圖4所示，樣本間相關性分析表明樣本間相關性較高，PCA分析可以發(fā)現高濃度(200 μg·L-1)處理組與其他濃度組間有較大差異，同時，F1代和F2代間的轉錄組響應也存在顯著差異。因此我們對F1代、F2代以及F1 vs F2的基因表達情況進行了進一步分析。

表1 目標物質的洗脫梯度Table 1 Elution gradient of target substance

表2 三唑酮暴露對大型溞世代間隔時間的影響Table 2 Influences of triadimefon exposure on generation interval time of Daphnia magna

基于上述表達量分析，F1代對照組(空白對照和溶劑對照)與處理組(試驗設置的6個濃度組)的差異表達基因共376個，其中上調基因322個，下調基因54個(圖4(a))。F2代對照組與處理組的差異表達基因共422個，其中上調基因87個，下調基因335個(圖4(b))。而F1和F2代的差異表達基因共2 604個，其中上調基因1 101個，下調基因1 503個(圖4(c))，由火山圖可知，F1代上調基因明顯高于下調基因，而F2代則相反。相比之下，F1代與F2代比較的差異表達基因上調與下調基因數基本相似。F1代對照組(空白對照和溶劑對照)與所有處理組(試驗設置的6個濃度組)共有差異表達基因36個，F2代對照組與所有處理組共有差異表達基因82個，將F1代的基因與F2代的基因對比得到兩者共有差異表達基因共336個(如圖4(d)～(f)所示)。

圖3 樣本間相關性分析和PCA分析注：F1_1～F1_8分別代表F1代空白對照組、丙酮對照組以及5、12.5、25、50、100、200 μg·L-1三唑酮處理組；F2_1～F2_8分別代表F2代空白對照組、丙酮對照組以及5、12.5、25、50、100、200 μg·L-1三唑酮處理組；(d)和(e)中紅色虛線圈出是200 μg·L-1處理組，(f)中紅色虛線圈出是F1代，藍色虛線圈出是F2代。Fig. 3 Correlation analysis and PCA analysis among samplesNote: F1_1～F1_8 represent control group, acetone control group, and 5, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg·L-1 triadimefon treatment group, respectively; F2_1～F2_8 represent control group, acetone control group, and 5, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg·L-1 μg·L-1 triadimefon treatment group; circled by a red dotted line in (d) and (e) is treatment group of 200 μg·L-1; circled by a red dotted line and a blue dotted line in (f) represent F1 and F2, respectively.

圖4 差異表達基因火山圖(a)、(b)、(c)和Venn圖(d)、(e)、(f)注：F1_0和F2_0分別代表F1代和F2代對照組，F1_3～F1_8分別代表F1代5、12.5、25、50、100、200 μg·L-1三唑酮處理組；F2_3～F2_8分別代表F2代5、12.5、25、50、100、200 μg·L-1三唑酮處理組。Fig. 4 Volcano figures of differentially expressed genes (a), (b), (c) and Venn figures of differentially expressed genes (d), (e), (f)Note: F1_0 and F2_0 represent control group in F1 and F2, respectively; F1_3～F1_8 represent 5, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg·L-1 triadimefon treatment group in F1, respectively; F2_3～F2_8 represent 5, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg·L-1 triadimefon treatment group in F2.

2.3 關鍵通路和關鍵基因

通過上述基因表達差異的分析，對F1代和F2代的所有差異表達基因進行功能聚類和通路分析(表3和表4)。結果表明，F1代差異表達基因顯著富集的主要通路包括甾類激素生物合成、視黃醇代謝、酮體的合成與降解等代謝通路、氧化應激、內質網應激以及與壽命調節(jié)和消化系統(tǒng)相關的通路。其中壽命調節(jié)和蛋白質消化吸收是富集最為顯著的通路。F2代顯著富集通路主要有酮體的合成與降解、類固醇生物合成和谷胱甘肽代謝等代謝通路、抗原的處理和呈遞以及造血細胞譜系等免疫系統(tǒng)通路、內分泌系統(tǒng)和氮代謝。其中氮代謝和造血細胞譜系是富集最顯著的通路。對富集到關鍵通路的顯著差異表達基因在不同濃度水平下進行表達量分析(圖5)。F1代中富集到關鍵通路的絕大部分關鍵基因在濃度100 μg·L-1和200 μg·L-1時顯著上調(圖5)，僅基因trypsin alpha-1-like和基因zinc metalloproteinase nas-12-like在濃度200 μg·L-1時顯著下調，且其他與蛋白質消化吸收相關的基因在該濃度下與對照組之間無顯著差異，而在較低濃度時上調。這說明在較低濃度下，機體通過上調蛋白質消化吸收相關基因應對外界脅迫，而200 μg·L-1可能已經超過其基因水平的毒性閾值，從而引起不利的基因表達。而與藥物代謝相關的CYP3A (CYP3A是一種重要的CYP450酶系，可催化許多外源藥物的代謝)和UGT(葡萄糖醛酸轉移酶)相關基因的表達在不同濃度下呈現不同的表達模式，這些基因富集在甾類激素生物合成通路，這可能導致內分泌干擾作用[29-30]。3-羥基丁酸脫氫酶、全反式視黃醇13,14還原酶相關基因在各處理濃度下均上調。不同于F1代，在F2代中，大部分關鍵基因顯著下調。LIPA(脂肪酶)、CD13(氨肽酶類)、CD63(四磷酸腺苷)相關基因在高濃度處理組(50、100和200 μg·L-1)顯著下調，CA(碳酸酐酶)、CTSL(組織蛋白酶L)和BDH(3-羥基丁酸脫氫酶)相關基因在各處理組顯著下調。F1代和F2代基因表達的差異說明F1代的暴露會影響其子代的基因表達，加劇對子代的毒性作用。

圖5 關鍵差異表達基因表達量(log(TPM+1))分布圖注：F1_0和F2_0分別代表F1代和F2代對照組，F1_3～F1_8分別代表F1代5、12.5、25、50、100、200 μg·L-1三唑酮處理組；F2_3～F2_8分別代表F2代5、12.5、25、50、100、200 μg·L-1三唑酮處理組。Fig. 5 Expression distribution (log(TPM+1)) of key differentially expressed genesNote: F1_0 and F2_0 represent control group in F1 and F2, respectively; F1_3～F1_8 represent 5, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg·L-1 triadimefon treatment group in F1, respectively; F2_3～F2_8 represent 5, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg·L-1 triadimefon treatment group in F2.

表3 F1代差異表達基因KEGG富集主要信號通路Table 3 Main pathways of KEGG enrichment of differentially expressed genes in F1

表4 F2代差異基因KEGG富集主要信號通路Table 4 Main pathways of KEGG enrichment of differentially expressed genes in F2

3 討論(Discussion)

本研究依據OECD 211[27]測試方法開展大型溞多代實驗，評估三唑酮對大型溞的毒性效應。結果表明：(1)三唑酮濃度為200 μg·L-1時，顯著影響大型溞體長。劉娜等[22]探究了三唑酮對大型溞不同測試終點的毒性效應，發(fā)現當三唑酮濃度≤100 μg·L-1時，大型溞體長與對照組無明顯差別，計算以體長為生長指標的最大無影響濃度(no observed effect concentration, NOEC)為100 μg·L-1；(2)當三唑酮濃度≥100 μg·L-1時，大型溞繁殖能力顯著降低，說明該濃度可能已經達到造成繁殖毒性的閾值；(3)三唑酮的暴露可能導致世代間隔時間延長。胡方華等[31]關于三唑酮對大型溞的慢性毒性效應的研究表明，三唑酮對第2代大型溞染毒的影響比對第1代的影響更大。這說明三唑酮對大型溞存在長期毒性效應，有必要考慮三唑酮對大型溞的傳代效應。

對比F1代和F2代的KEGG通路和關鍵基因，KEGG通路均與代謝和免疫相關，但F2代內分泌干擾作用和免疫反應更加明顯，F1代更多表現在氧化應激和消化系統(tǒng)相關的通路。F1代上調基因占比高而F2代下調基因占比高，在F1代中顯著上調的BDH相關基因在F2代中顯著下調。這些差異可能是由于F1代的暴露降低了三唑酮對F2代的毒性閾值，從而加劇了F2代的毒性作用，長期暴露后，氧化損傷最終導致細胞凋亡和機體功能損失等。F1代在低濃度暴露時，生物體通過提高基因表達來適應污染環(huán)境，而高濃度時可能超過了部分基因表達毒性閾值從而引起基因表達量的變化。F2代在低濃度暴露時基因下調，可能是因為其母代F1暴露于三唑酮從而加劇了對子代的毒性。因此，隨著時間和代際延長，三唑酮對大型溞的毒性作用可能會加強，大型溞對某一閾值濃度的三唑酮有一定的調控能力，但超過一定濃度，可能會存在傳代效應。

綜上所述，低濃度三唑酮長期暴露大型溞會引起慢性毒性，≥200 μg·L-1的三唑酮顯著影響大型溞的體長和繁殖。三唑酮可能會引起大型溞的氧化應激反應、神經毒性、免疫毒性和內分泌干擾，存在傳代效應，長期暴露會下調免疫反應等相關基因的表達，降低毒性閾值。

通訊作者簡介：金小偉(1985—)，男，博士，正高級工程師，主要研究方向為生態(tài)毒理學和生態(tài)風險評價。