田明明，夏普，張效偉,2,*

1. 污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023 2. 江蘇省生態(tài)環(huán)境保護(hù)化學(xué)品安全與健康風(fēng)險(xiǎn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210023

了解化學(xué)品的毒性機(jī)制是開展化學(xué)品人類健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)?；瘜W(xué)品污染已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的重要因素[1]。一些環(huán)境化學(xué)品的暴露可導(dǎo)致諸多人類慢性疾病，例如肺癌、神經(jīng)退行性疾病等[2-4]。了解和掌握化學(xué)品的毒性機(jī)制是準(zhǔn)確識(shí)別介導(dǎo)化學(xué)品有害效應(yīng)的關(guān)鍵分子事件的基礎(chǔ)，而這對(duì)于指導(dǎo)檢測(cè)化學(xué)品的最大無(wú)效應(yīng)劑量(no observed adverse effect level, NOAEL)是必要的[5-8]。毒理基因組學(xué)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)品的毒性機(jī)制研究中。而傳統(tǒng)的毒理基因組學(xué)方法，例如：轉(zhuǎn)錄組學(xué)，通過對(duì)差異表達(dá)基因的識(shí)別與相關(guān)的生物學(xué)通路的分析，可以提供化學(xué)品潛在的毒性機(jī)制信息[9-11]。但這些分子信息缺乏直接的生物學(xué)表型的關(guān)聯(lián)，因此不能直接將這些分子信息與化學(xué)品的有害效應(yīng)和毒性機(jī)制關(guān)聯(lián)起來(lái)[11-13]。

掌握化學(xué)品有害效應(yīng)的易感性機(jī)制是開展精準(zhǔn)的人類健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要基礎(chǔ)[14-17]。由于人類個(gè)體易感性差異的存在，使得當(dāng)前的化學(xué)品人類健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估往往存在不確定性[5-6, 14, 18]。遺傳變異由于可以在親本和子代間進(jìn)行傳遞，且可以直接在分子水平影響化學(xué)品暴露導(dǎo)致的有害效應(yīng)，因此由遺傳變異介導(dǎo)的易感性差異受到普遍關(guān)注[14-15]。傳統(tǒng)的分子流行病學(xué)方法，例如：全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(genome-wide association studies, GWAS)和基因組-環(huán)境關(guān)聯(lián)分析研究(gene-environment-wide association studies, GEWAS)基于關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)分析，來(lái)研究表型與遺傳變異之間的關(guān)聯(lián)(圖1)，難以提供相關(guān)的分子機(jī)制的解析[17, 19]。另外，傳統(tǒng)的毒理基因組學(xué)也不能提供與遺傳易感性關(guān)聯(lián)的分子響應(yīng)信息。通過測(cè)試細(xì)胞的表型，功能基因組學(xué)可以識(shí)別基因與化學(xué)品有害效應(yīng)的直接關(guān)聯(lián)，進(jìn)而揭示與化學(xué)品有害效應(yīng)直接關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制[20-22]，同時(shí)提供與遺傳易感性相關(guān)的分子響應(yīng)信息[23]。功能基因組學(xué)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)品的毒性機(jī)制研究中。目前，依賴于基因編輯技術(shù)的發(fā)展，功能基因組學(xué)已經(jīng)從傳統(tǒng)的單細(xì)胞生物(酵母)發(fā)展到人類細(xì)胞，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了全基因組水平的基因敲除[13, 20]。這些功能基因組學(xué)方法擁有各自的優(yōu)點(diǎn)與局限性，適合不同類型的化學(xué)品的生物學(xué)測(cè)試。

本論文綜述了功能基因組學(xué)的原理及其主要發(fā)展，介紹了不同功能基因組學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性。重點(diǎn)詳述了CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)的原理與特點(diǎn)，以及其在環(huán)境化學(xué)品毒性機(jī)制研究中的應(yīng)用。最后，本論文對(duì)聯(lián)合運(yùn)用CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)與分子流行病學(xué)分析，開展化學(xué)品有害效應(yīng)的易感性機(jī)制研究進(jìn)行了展望。

1 傳統(tǒng)的功能基因組學(xué)(Conventional functional genomics)

1.1 功能基因組學(xué)的原理與特點(diǎn)1.1.1 功能基因組學(xué)的原理

功能基因組學(xué)通過檢測(cè)化學(xué)品暴露后的表型，篩選出與生物表型直接關(guān)聯(lián)的基因。其中所檢測(cè)的表型既可以是細(xì)胞活性，也可以是特定的細(xì)胞毒性終點(diǎn)，例如氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。通過分析篩選出的基因，可以獲取與特定生物表型或毒性終點(diǎn)直接關(guān)聯(lián)的生物學(xué)通路，進(jìn)而獲取介導(dǎo)化學(xué)品有害效應(yīng)的關(guān)鍵基因和分子通路[20]。目前，功能基因組學(xué)的篩選介質(zhì)已經(jīng)從傳統(tǒng)的酵母細(xì)胞[24]發(fā)展至活體動(dòng)物[25]，但活體動(dòng)物的篩選目前僅用于癌癥藥物研發(fā)，尚未應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)品的毒性測(cè)試。而功能基因組學(xué)所仰仗的基因編輯技術(shù)，已經(jīng)從傳統(tǒng)的RNA干擾(RNA interference, RNAi)[26]發(fā)展至當(dāng)前主流的CRISPR技術(shù)[27]。

功能基因組學(xué)的原理：依靠基因編輯技術(shù)，在細(xì)胞中敲除(knockout)或者敲降(knockdown)全基因組或者特定的基因集，并且實(shí)現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞中只敲除或敲降一個(gè)基因。與環(huán)境化學(xué)品有害效應(yīng)關(guān)聯(lián)的基因，它們的功能缺失會(huì)使細(xì)胞對(duì)化學(xué)品的有害效應(yīng)更加敏感或者更具抗性，通過檢測(cè)化學(xué)品暴露后細(xì)胞的表型，可以將這些敏感性變化的細(xì)胞篩選出來(lái)。因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞內(nèi)均有一個(gè)特定的標(biāo)簽序列(barcode)，可以通過高通量測(cè)序的方法，識(shí)別篩選出的細(xì)胞中被敲除或者敲降的基因，進(jìn)而將與環(huán)境化學(xué)品有害效應(yīng)關(guān)聯(lián)的基因篩選出來(lái)(圖2)[12, 20, 28]。

1.1.2 功能基因組學(xué)的特點(diǎn)

功能基因組學(xué)的特點(diǎn)主要包括：

(1)功能基因組學(xué)識(shí)別的基因具有“表型錨定”。功能基因組學(xué)通過檢測(cè)化學(xué)品暴露后的細(xì)胞表型(這些細(xì)胞表型可以是細(xì)胞活性，或者是基于特定毒性終點(diǎn)的熒光信號(hào))，識(shí)別敏感性變化的突變細(xì)胞，進(jìn)而篩選出與化學(xué)品有害效應(yīng)或者細(xì)胞毒性終點(diǎn)直接關(guān)聯(lián)的基因。這些基因的功能缺失使細(xì)胞對(duì)相應(yīng)的化學(xué)品的有害效應(yīng)變得更敏感或者更加抗性，體現(xiàn)在毒性機(jī)制上，這些基因的功能就是介導(dǎo)化學(xué)品細(xì)胞毒性或者抑制化學(xué)品的細(xì)胞毒性。因此，功能基因組學(xué)可以憑借構(gòu)建基因與化學(xué)品的有害效應(yīng)或者毒性終點(diǎn)的直接關(guān)聯(lián)，發(fā)掘環(huán)境化學(xué)品的新穎的毒性機(jī)制[12, 20]。

(2)功能基因組學(xué)可以提供基于遺傳變異的分子視角。功能基因組學(xué)通過基因編輯技術(shù)，尤其以CRISPR-Cas9為代表的當(dāng)前主流的基因編輯技術(shù)，對(duì)基因的DNA序列進(jìn)行編輯，使其產(chǎn)生突變，形成基因功能缺失。或者通過RNA干擾技術(shù)降低基因的表達(dá)。這些基因的表達(dá)被抑制，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化學(xué)品的暴露產(chǎn)生敏感性變化。人體的有效應(yīng)的遺傳變異，主要分為兩大類：一是影響基因的表達(dá)，二是影響蛋白的活性，而這2種效應(yīng)突變均體現(xiàn)在了基因功能的變化上[29]?；蚬δ艿淖兓M(jìn)而導(dǎo)致人體細(xì)胞對(duì)化學(xué)品暴露的敏感性發(fā)生變化[14-15]。因此，功能基因組學(xué)可以提供具有遺傳變異視角的化學(xué)品毒性機(jī)制[30]。

圖1 全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(GWAS)和基因組-環(huán)境關(guān)聯(lián)分析研究(GEWAS)通過相關(guān)性分析預(yù)測(cè)遺傳變異與疾病表型的關(guān)聯(lián)Fig. 1 The associations between genetic variants and disease phenotypes were predicted by genome-wide association studies (GWAS) and gene-environment-wide association studies (GEWAS) through correlation analysis

圖2 功能基因組學(xué)的原理Fig. 2 The mechanism of functional genomics screen

(3)功能基因組學(xué)同樣可以用于化學(xué)品高通量測(cè)試。利用流式細(xì)胞儀篩選和高通量測(cè)序，可以實(shí)現(xiàn)多種化學(xué)品多劑量暴露下的表型檢測(cè)和基因功能缺失的識(shí)別，進(jìn)而可以開展更多的化學(xué)品的機(jī)制毒理學(xué)研究[20]。

1.2 經(jīng)典的功能基因組學(xué)

早期的功能基因組學(xué)根據(jù)生物載體和基因突變的方式可以分為：?jiǎn)渭?xì)胞生物的功能基因組學(xué)(大腸桿菌和酵母)、雞的DT40細(xì)胞的篩選、單倍體哺乳動(dòng)物細(xì)胞的篩選和RNA干擾。這些傳統(tǒng)的功能基因組學(xué)有各自的優(yōu)點(diǎn)，在對(duì)于某些特定作用機(jī)制的化學(xué)品，例如：遺傳毒性化學(xué)品的檢測(cè)，仍然具有較多的應(yīng)用價(jià)值。但這些方法也存在不少局限性，主要集中于和人類之間的物種差異以及能否實(shí)現(xiàn)全基因組水平的基因敲除(表1)。因此，當(dāng)前的功能基因組學(xué)篩選需要一種基于人類細(xì)胞的且可以實(shí)現(xiàn)全基因組水平的基因的特異性敲除的技術(shù)。由于大腸桿菌屬于原核生物，與人類的物種差異較大，在此，本文主要綜述真核生物的功能基因組學(xué)方法。

1.2.1 酵母的功能基因組學(xué)

以酵母作為生物載體的功能基因組學(xué)篩選，已經(jīng)被廣泛用于環(huán)境化學(xué)品的毒性測(cè)試，尤其以遺傳毒性化學(xué)品為代表。酵母作為功能基因組學(xué)的生物載體，有以下優(yōu)勢(shì)：(1) 酵母是一種常見的真核單細(xì)胞生物，無(wú)論是單倍體或者雙倍體，酵母均是一種易擴(kuò)繁、易培養(yǎng)的非致病性微生物；(2) 酵母的基因組已經(jīng)完全解析，比較容易實(shí)現(xiàn)全基因組的編輯和敲除[33, 45]。(3) 酵母的基因組在進(jìn)化上與其他高等真核生物保持了較高的同源性，與人類遺傳疾病相關(guān)的一半的基因都具有酵母的同源基因。對(duì)于環(huán)境化學(xué)品的暴露，酵母細(xì)胞的基本響應(yīng)的分子機(jī)制與人類細(xì)胞和其他高等真核生物是一致的[31, 46]。

在解析響應(yīng)環(huán)境化學(xué)品暴露的基因功能的時(shí)候，酵母突變株的表型分析是一種有效的方法。構(gòu)建酵母細(xì)胞的突變株，目前主要包括：遺傳印跡法、隨機(jī)突變法和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)的基因突變法[20]。目前已有較多種類的商業(yè)化的酵母突變株細(xì)胞庫(kù)，包括刪除了5 916個(gè)基因(含有1 159個(gè)必需基因)的純合子和雜合子細(xì)胞庫(kù)，以及刪除了4 757個(gè)非必需基因的單倍體細(xì)胞庫(kù)。這些酵母突變株均含有特異性的標(biāo)簽序列，可以開展細(xì)胞庫(kù)的篩選研究[32]。目前，已有大量研究使用酵母的突變細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行環(huán)境化學(xué)品的毒性測(cè)試，主要包括遺傳毒性化學(xué)品和抑制氧化磷酸化的化學(xué)品[20]，例如苯并芘、甲醛和砷[21, 47-48]。使用酵母突變細(xì)胞庫(kù)開展這些化學(xué)品的功能基因組篩選的優(yōu)勢(shì)在于：這些化學(xué)品的作用機(jī)制是通過造成DNA損傷或是線粒體呼吸鏈傳遞的抑制，而這些生物學(xué)過程的分子機(jī)制在真核生物物種進(jìn)化過程中比較保守，便于進(jìn)行同源基因的物種外推[49-50]。

雖然酵母的功能基因組學(xué)篩選在識(shí)別環(huán)境化學(xué)品的比較保守的分子機(jī)制中可以發(fā)揮重要作用，但酵母突變株細(xì)胞庫(kù)在環(huán)境化學(xué)品的毒性測(cè)試中依然有局限性：(1) 酵母是一種單細(xì)胞生物，對(duì)于涉及細(xì)胞間相互作用的分子機(jī)制，無(wú)法依靠酵母的功能基因組學(xué)開展研究；(2) 酵母細(xì)胞可以忍受更高劑量化學(xué)品的暴露，它的一些效應(yīng)濃度往往遠(yuǎn)高于人體細(xì)胞相應(yīng)化學(xué)品的效應(yīng)濃度；(3) 雖然酵母基因組中有很多人類的同源基因，但會(huì)出現(xiàn)一個(gè)酵母基因同時(shí)對(duì)應(yīng)多個(gè)人類基因的情況，這給分子機(jī)制的外推帶來(lái)了困難。因此，需要使用與人類物種差異更小的物種開展功能基因組學(xué)研究[20-21]。

1.2.2 雞DT40細(xì)胞的功能基因組學(xué)

在雞DT40細(xì)胞中可以通過靶向整合(targeted integration)技術(shù)較為容易地實(shí)現(xiàn)基因敲除，因?yàn)樵摷?xì)胞具有非常高的靶向整合效率[51]。目前，DT40細(xì)胞主要應(yīng)用于遺傳毒性化學(xué)品的功能基因組學(xué)的篩選[52]。DT40細(xì)胞具有以下特點(diǎn)使其適合應(yīng)用于遺傳毒性化學(xué)品的毒性測(cè)試：(1) DT40細(xì)胞分裂具有較長(zhǎng)的S期，大概占細(xì)胞循環(huán)的70%，這意味著在遺傳毒性化學(xué)品的暴露期間，大多數(shù)的DT40細(xì)胞處于DNA合成階段，這使細(xì)胞的DNA更容易遭受損傷。(2) 因?yàn)镈T40細(xì)胞P53基因功能缺失，DT40細(xì)胞的細(xì)胞循環(huán)的G1/S檢測(cè)點(diǎn)是沒有激活的，因此就會(huì)導(dǎo)致在G1期沒有被完全修復(fù)的DNA損傷會(huì)隨著細(xì)胞循環(huán)不斷積累，進(jìn)而影響DNA復(fù)制。以上2個(gè)特征使DT40細(xì)胞對(duì)化學(xué)品的遺傳毒性相較于其他類型細(xì)胞更敏感[52]。

目前的DT40細(xì)胞的突變株主要遍及2類與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的生物學(xué)通路。(1)DNA復(fù)制：跨損傷修復(fù)合成(translesion synthesis, TLS)、同源修復(fù)(homologous recombination, HR)、范科尼貧血修復(fù)通路(Fanconi anemia repair)、非同源末端連接(non-homologous end joining)、鏈間交聯(lián)修復(fù)(interstrand cross-link repair)、核苷酸剪切修復(fù)(nucleotide excision repair)和堿基剪切修復(fù)(base excision repair)；

表1 不同功能基因組學(xué)方法比較Table 1 Comparison between different functional genomics

(2)細(xì)胞循環(huán)：DNA損傷檢查點(diǎn)(DNA damage checkpoint)[52]。共有超過100種DT40細(xì)胞突變株遍及以上DNA損傷修復(fù)通路[35, 52]。DT40細(xì)胞突變株由于DNA損傷修復(fù)的基因功能缺失，導(dǎo)致無(wú)法修復(fù)遺傳毒性化學(xué)品的毒性效應(yīng)導(dǎo)致的DNA損傷，進(jìn)而抑制了細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[53]?；诖嗽恚壳耙呀?jīng)開展了較多利用DT40突變細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行遺傳毒性化學(xué)品毒性測(cè)試的研究。Ooka等[36]利用DT40細(xì)胞功能基因組學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)，對(duì)于苯并芘(BaP)和N-亞硝基二甲胺(NDMA)，需要使用S9代謝激活才能顯示出遺傳毒性?？鐡p傷修復(fù)合成缺陷的REV3-/-DT40細(xì)胞對(duì)BaP和NDMA均表現(xiàn)出最高的敏感性，此外雙鏈斷裂修復(fù)缺陷的RAD54-/-/KU70-/-DT40細(xì)胞也對(duì)BaP表現(xiàn)出較高的敏感性。Ooka等[36]使用酵母的功能基因組篩選發(fā)現(xiàn)跨損傷修復(fù)合成通路在三氯乙烯代謝產(chǎn)物的遺傳毒性分子機(jī)制中扮演重要作用，此外，通過DT40的篩選發(fā)現(xiàn)，跨損傷修復(fù)合成通路缺陷的DT40細(xì)胞對(duì)三氯乙烯代謝產(chǎn)物更敏感，相比之下，同源重組修復(fù)缺陷的DT40細(xì)胞對(duì)三氯乙烯代謝產(chǎn)物抗性比野生型DT40細(xì)胞更強(qiáng)。Ji等[54]使用DT40篩選發(fā)現(xiàn)堿基剪切修復(fù)缺陷Polβ-/-和跨損傷修復(fù)合成缺陷REV3-/-DT40細(xì)胞對(duì)tetra-BDEs和OH-tetra-BDEs的敏感性比野生型更高。使用半胱氨酸預(yù)處理可以降低Polβ-/-和REV3-/-DT40細(xì)胞的敏感性，表明多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)和羥基-多溴聯(lián)苯醚(OH-BDEs)通過引發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致遺傳毒性效應(yīng)。

DT40細(xì)胞的功能基因組篩選的局限性表現(xiàn)在：(1) DT40細(xì)胞來(lái)源于雞的淋巴B細(xì)胞，與人類存在物種差異，不利于進(jìn)行跨物種外推；(2) DT40細(xì)胞的功能基因組學(xué)篩選不能覆蓋全基因組水平，只是集中于DNA損傷修復(fù)通路的基因的研究。

1.2.3 單倍體哺乳動(dòng)物細(xì)胞的功能基因組學(xué)

人類近單倍體細(xì)胞的功能基因組學(xué)篩選已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于識(shí)別與化學(xué)品細(xì)胞毒性相關(guān)的基因。人類KBM7細(xì)胞來(lái)源于白血病病人的骨髓，該病人患有近單倍體慢性髓系白血病[55]。P1-55亞克隆細(xì)胞系的構(gòu)建，使得細(xì)胞的單倍體構(gòu)型可以保持至少12周，此外，改良后的KBM7 (HAP1)[56]是貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，其8號(hào)染色體為單倍體。這使得使用KBM7細(xì)胞系進(jìn)行功能基因組學(xué)篩選成為可能[37]。Birsoy等[57]將其應(yīng)用于溴丙酮酸的抗性機(jī)制的識(shí)別，溴丙酮酸是一種糖酵解抑制劑，所識(shí)別的關(guān)鍵基因MCT1所編碼的蛋白是溴丙酮酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且MCT1的mRNA水平可以被用來(lái)預(yù)測(cè)癌細(xì)胞對(duì)溴丙酮酸的敏感性，因此也被看作為腫瘤的潛在生物標(biāo)志物。Shen等[58]利用KBM7細(xì)胞的功能基因組學(xué)識(shí)別了與甲醛和格列衛(wèi)的遺傳毒性相關(guān)的基因，實(shí)現(xiàn)了利用單倍體細(xì)胞的功能基因組學(xué)揭示遺傳毒性化學(xué)品的分子機(jī)制的先例。目前，人類近單倍體細(xì)胞的功能基因組學(xué)篩選往往以細(xì)胞死亡作為檢測(cè)表型，以非細(xì)胞死亡作為毒性終點(diǎn)的功能基因組學(xué)研究也已經(jīng)發(fā)表。Duncan等[39]利用人類單倍體細(xì)胞篩選，基于細(xì)胞熒光檢測(cè)，通過篩選MHC1的細(xì)胞表面表達(dá)缺陷的突變細(xì)胞，識(shí)別了與MHC一類抗原呈遞相關(guān)的基因。Lee等[59]利用轉(zhuǎn)錄因子報(bào)告基因，篩選了KBM7細(xì)胞中參與NF-κB的激活抑制的基因，并發(fā)現(xiàn)了新的分子機(jī)制。

目前可以多代傳代的小鼠的單倍體胚胎干細(xì)胞已經(jīng)被構(gòu)建，這些單倍體細(xì)胞依然具有誘導(dǎo)分化的能力，且分化后依然保持單倍體核型。這些細(xì)胞的構(gòu)建使得研究環(huán)境化學(xué)品對(duì)正常干細(xì)胞的毒性效應(yīng)以及模擬早期生命暴露提供了可能[60-61]。Elling等[60]利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的近于全基因組的基因突變，識(shí)別了與介導(dǎo)蓖麻毒素相關(guān)的基因。此外，小鼠的單倍體胚胎干細(xì)胞的功能基因組學(xué)被應(yīng)用識(shí)別與6-巰基嘌呤的毒性關(guān)聯(lián)的DNA錯(cuò)配修復(fù)基因[40]和介導(dǎo)奧拉帕尼毒性的基因[38]。以上這些研究發(fā)掘了小鼠的單倍體胚胎干細(xì)胞的功能基因組學(xué)的應(yīng)用價(jià)值和潛力，擴(kuò)展了在多種細(xì)胞和篩選多種發(fā)育相關(guān)通路中的應(yīng)用。但是小鼠胚胎干細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件的要求較高，此為該方法的局限性。

使用KBM7細(xì)胞的功能基因組學(xué)具有如下局限性：(1)這些細(xì)胞不是完全的單倍體；(2)使用基因誘捕逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的隨機(jī)突變的方法產(chǎn)生單倍體細(xì)胞突變株，無(wú)法完全覆蓋全基因組[62]。因此，需要靶向且針對(duì)特定基因的方法，例如RNA干擾和由核酸介導(dǎo)的基因編輯，對(duì)基因組進(jìn)行系統(tǒng)性的敲除或者敲降。

1.2.4 使用RNA干擾(RNA interference, RNAi)的功能基因組學(xué)

RNA干擾是一項(xiàng)在眾多真核生物中比較保守的生物過程。通過與一種短的20 bp左右的序列特異地干擾RNA結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致了對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切割和降解[63]。通過向細(xì)胞轉(zhuǎn)染體外合成的siRNA、或者siRNA的前體(short-hairpin RNA, shRNA)以及雙鏈RNA (double stranded RNA)，來(lái)抑制基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染方式包括脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)[41]。RNAi已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)篩選后的單基因功能驗(yàn)證。通過抑制特定基因的表達(dá)，檢測(cè)表型的變化[49]。

RNAi技術(shù)也可以應(yīng)用于功能基因組學(xué)篩選，其篩選方式包括混合篩選和陣列篩選[64]?；旌虾Y選是指在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染siRNA或者shRNA庫(kù)，實(shí)現(xiàn)基因組水平的基因表達(dá)抑制，然后進(jìn)行化學(xué)品暴露，使用高通量測(cè)序或者流式細(xì)胞儀分選的方式，對(duì)細(xì)胞的表型進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞的表型既可以是細(xì)胞活性，也可以是關(guān)聯(lián)特定毒性終點(diǎn)的熒光。陣列篩選是指將細(xì)胞接種在不同的孔中，在不同的孔里面進(jìn)行單獨(dú)的轉(zhuǎn)染、化學(xué)品暴露和表型的檢測(cè)，包括細(xì)胞活性檢測(cè)和熒光檢測(cè)。例如：可以使用高內(nèi)涵細(xì)胞篩選的方法對(duì)已經(jīng)標(biāo)記過多個(gè)熒光標(biāo)簽的細(xì)胞進(jìn)行表型篩選[65]。目前，較為成熟的RNA干擾質(zhì)粒庫(kù)，例如RNAi Consortium Lentiviral Library，可以靶向人類基因組17 200個(gè)基因，且每個(gè)質(zhì)粒均含有一段標(biāo)簽序列，已經(jīng)被廣泛用于RNAi的功能基因組篩選中[42]。通過采用混合篩選的方法，采用慢病毒轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，構(gòu)建全基因組水平表達(dá)抑制的細(xì)胞庫(kù)。在環(huán)境化學(xué)品的暴露下，特定基因的表達(dá)抑制會(huì)賦予細(xì)胞抗性或者敏感性，導(dǎo)致相應(yīng)的細(xì)胞在細(xì)胞庫(kù)中的豐度發(fā)生變化。通過流式細(xì)胞儀篩選以及高通量測(cè)序的方法，獲取不同標(biāo)簽序列的豐度信息，通過比較處理組與對(duì)照組的豐度，識(shí)別介導(dǎo)對(duì)化學(xué)品暴露抗性和敏感性的基因。RNAi功能基因組學(xué)篩選使用細(xì)胞系或者經(jīng)過與特定表型關(guān)聯(lián)的改造后的細(xì)胞，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)品細(xì)胞毒性的抗性(例如環(huán)境毒害重金屬[66-67])、特定的生物學(xué)過程以及病原物的響應(yīng)相關(guān)的研究[68-71]。

和其他功能基因組學(xué)篩選方法一樣，RNAi篩選的局限性主要體現(xiàn)在：(1) RNAi存在顯著的脫靶效應(yīng)[72]，部分siRNA會(huì)結(jié)合到與其只有部分序列匹配的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上，導(dǎo)致基因表達(dá)抑制效應(yīng)的特異性下降[43]。(2) RNAi存在對(duì)基因表達(dá)的抑制效率參差不齊的情況。首先，RNAi不能完全抑制基因的表達(dá)，有些基因的絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即使被抑制，但依然會(huì)有顯著的蛋白表達(dá)。其次，有些siRNA對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抑制效率較低，這就需要對(duì)一個(gè)基因設(shè)計(jì)更多的siRNA來(lái)保證抑制效率[73]。

2 CRISPR功能基因組學(xué)(CRISPR functional genomics)

2.1 CRISPR功能基因組學(xué)的原理和特點(diǎn)2.1.1 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)介紹

CRISPR-Cas9技術(shù)為在各種細(xì)胞類型中進(jìn)行基因組編輯提供了一種有效的方法[28, 74]。與RNAi相比，這種RNA引導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可以在基因組中產(chǎn)生永久性突變，導(dǎo)致基因功能喪失或獲得[74]。CRISPR-Cas9是一種經(jīng)濟(jì)、快速、高效且特異性強(qiáng)的基因編輯方法。Cas9蛋白由一個(gè)單一的引導(dǎo)RNA(single guide RNA, sgRNA)引導(dǎo)并在特定的基因組位點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂。切割位點(diǎn)的識(shí)別和靶向特異性由一個(gè)超過20 bp的與目標(biāo)DNA序列匹配的sgRNA和一個(gè)與之相鄰的短核苷酸序列(一個(gè)序列為NGG的三核苷酸序列，其中N是任意核苷酸)決定[75]。DNA雙鏈斷裂(double-strand DNA breaks, DSB)通過非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ) DNA修復(fù)途徑或同源定向修復(fù)途徑(homology directed repair, HDR)修復(fù)[20]。NHEJ修復(fù)在DSB位點(diǎn)產(chǎn)生插入/缺失(indels)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)譯框位移或提前終止密碼子，導(dǎo)致基因敲除。HDR途徑將修復(fù)模板(供體DNA)并入DSB，將特定核苷酸變化引入靶基因(圖3)。在線性同源修復(fù)供體存在的情況下，通過將2個(gè)sgRNAs與Cas9酶結(jié)合可有效引發(fā)高達(dá)10 kb的DNA的缺失[44]。

通過對(duì)寡核苷酸的引導(dǎo)序列sgRNA的大規(guī)模合成，可實(shí)現(xiàn)在全基因組水平上對(duì)基因功能的探究[76]。與shRNA庫(kù)僅介導(dǎo)基因敲降不同，sgRNA庫(kù)可與Cas9核酸酶結(jié)合用于產(chǎn)生基因敲除突變的細(xì)胞庫(kù)。Sander和Joung[77]運(yùn)用電穿孔法、核裂解和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒DNA中的Cas9和sgRNAs，而慢病毒載體可用于人類和小鼠細(xì)胞中持續(xù)性表達(dá)Cas9和sgRNA。研究人員可以根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞系的類型，從而選擇單一或雙載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)Cas9與sgRNA。在雙載體系統(tǒng)中，首先進(jìn)行的是細(xì)胞Cas9的初轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后篩選出陽(yáng)性克隆體進(jìn)行擴(kuò)增，隨后進(jìn)行sgRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，Sabatini和Lander的團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種雙載體文庫(kù)，該文庫(kù)由73 151個(gè)sgRNA質(zhì)粒組成，共靶向7 114個(gè)人類基因和100個(gè)非靶向?qū)φ栈騕78]。使用單載體系統(tǒng)，Cas9和sgRNA在一個(gè)載體中被轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞。這種系統(tǒng)是由Zhang的團(tuán)隊(duì)開發(fā)的，使用一個(gè)單獨(dú)的慢病毒載體將Cas9、sgRNA和嘌呤霉素選擇性標(biāo)記物轉(zhuǎn)染進(jìn)靶細(xì)胞[28]。Zhang的團(tuán)隊(duì)最初開發(fā)了一個(gè)人類全基因組CRISPR-Cas9敲除文庫(kù)(GeCKOv1)，包含64 751個(gè)特異導(dǎo)向序列，共靶向18 080個(gè)人類基因。該團(tuán)隊(duì)對(duì)GeCKOv1文庫(kù)進(jìn)行了改良，改良后的文庫(kù)含有123 411個(gè)sgRNAs，共靶向19 050個(gè)基因(GeCKOv2)[79](圖4)。GeCKOv2文庫(kù)比GeCKOv1文庫(kù)多靶向約1 000個(gè)基因，每個(gè)基因均擁有6個(gè)靶向的sgRNAs，且均保證了最小的脫靶效應(yīng)。此外，v2文庫(kù)里sgRNA通過產(chǎn)生miRNA前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)突變來(lái)使相應(yīng)的miRNA產(chǎn)生功能缺失。在全基因組小鼠慢病毒sgRNA文庫(kù)開發(fā)方面，Koike-Yusa等[80]開發(fā)了包含87 897個(gè)特異sgRNA、共靶向19 150個(gè)編碼蛋白的基因文庫(kù)，而Sanjana等[79]開發(fā)了130 209個(gè)sgRNA、靶向20 611個(gè)基因的全基因組小鼠慢病毒sgRNA文庫(kù)。

圖3 非同源末端連接(NHEJ)和同源定向修復(fù)途徑(HDR)的原理[20]注：DSB表示DNA雙鏈斷裂，sgRNA表示單一的引導(dǎo)RNA。Fig. 3 The mechanisms of non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR)[20]Note: DSB stands for double-strand DNA breaks; sgRNA stands for single guide RNA.

2.1.2 CRISPR-Cas9功能基因組篩選工作原理和流程

目前廣泛使用的針對(duì)環(huán)境化學(xué)品的CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)篩選均是混合篩選法。以下內(nèi)容均以混合篩選法展開。

由慢病毒轉(zhuǎn)染介導(dǎo)sgRNA和Cas9進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，編碼sgRNA和Cas9蛋白的核酸會(huì)整合到細(xì)胞的基因組中，產(chǎn)生sgRNA和Cas9蛋白的穩(wěn)定表達(dá)(圖4)。整合到細(xì)胞基因組當(dāng)中的sgRNA序列可以發(fā)揮標(biāo)簽序列的作用，進(jìn)而對(duì)被轉(zhuǎn)染進(jìn)sgRNA的細(xì)胞進(jìn)行特異性的標(biāo)記。由于基因的功能缺失，使得細(xì)胞在暴露于環(huán)境化學(xué)品的時(shí)候，參與介導(dǎo)化學(xué)品毒性效應(yīng)的或者維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)過程會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)環(huán)境化學(xué)品的有害效應(yīng)的敏感性發(fā)生變化，表現(xiàn)為細(xì)胞活性或者其他特定表型的不同?；趯?duì)這些變化的生物表型的檢測(cè)(細(xì)胞活性或者熒光標(biāo)記)，可以將與特定表型關(guān)聯(lián)的基因功能缺失篩選出來(lái)。通過深度測(cè)序，可以通過識(shí)別每個(gè)細(xì)胞的基因組中的sgRNA序列來(lái)構(gòu)建基因功能缺失與特定表型的關(guān)聯(lián)[12, 28]。

圖4 GeCKOv2的工作原理Fig. 4 The working mechanisms of the GeCKOv2 library

CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)篩選工作流程主要包括以下6個(gè)環(huán)節(jié)(圖5)。

(1)合成靶向全基因組的基因的sgRNA質(zhì)粒文庫(kù)。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)質(zhì)粒文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，獲取每個(gè)sgRNA克隆數(shù)超過500的質(zhì)粒文庫(kù)[81]。

圖5 CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)篩選工作流程[11]Fig. 5 The workflow of CRISPR-Cas9 functional genomics screen [11]

(2)用以轉(zhuǎn)染人類細(xì)胞的慢病毒的制備。制備慢病毒需要將sgRNA載體質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞(圖4)，通過超高速離心的方法收集慢病毒顆粒。同時(shí)需要測(cè)定純化后的慢病毒的滴度，一般需要超過1×108IFU·mL-1的滴度[81]。

(3)利用慢病毒將sgRNA和Cas9轉(zhuǎn)染進(jìn)人類細(xì)胞系。因?yàn)橥瑫r(shí)需要考慮覆蓋所有的sgRNA，一般對(duì)于一個(gè)包含100 000個(gè)sgRNA的庫(kù)，在進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染的時(shí)候，最少需要1.7×108個(gè)細(xì)胞。慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)束后，需要維持一定劑量的抗生素選擇壓力，去除掉那些沒有轉(zhuǎn)染進(jìn)質(zhì)粒的細(xì)胞。

(4)通過深度測(cè)序，進(jìn)行細(xì)胞庫(kù)的質(zhì)控。

(5)進(jìn)行環(huán)境化學(xué)品的CRISPR功能基因組篩選。這種篩選分為2種：正向篩選(positive screen)和反向篩選(negative screen)[30]。

(6)通過深度測(cè)序，識(shí)別sgRNA標(biāo)簽序列，構(gòu)建基因功能缺失與特定生物表型的關(guān)聯(lián)。

2.2 CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)在化學(xué)品毒性機(jī)制研究中的應(yīng)用

基于CRISPR-Cas9技術(shù)開發(fā)的功能基因組學(xué)篩選可以實(shí)現(xiàn)在全基因組水平系統(tǒng)性基因敲除的基礎(chǔ)上，以人類細(xì)胞和高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞為生物載體，開展環(huán)境化學(xué)品的毒性機(jī)制研究。以此方法獲取的全基因組水平的分子響應(yīng)信息可以提供基因與化學(xué)品有害效應(yīng)的直接關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)基因功能的表型錨定，進(jìn)而發(fā)掘環(huán)境化學(xué)品的新的毒性機(jī)制，為在有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)框架下的環(huán)境化學(xué)品毒性預(yù)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供分子機(jī)制基礎(chǔ)。另外，由于CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)的一個(gè)重要的表型檢測(cè)是細(xì)胞活性，即以細(xì)胞死亡為毒性終點(diǎn)，這恰恰是某些環(huán)境化學(xué)品產(chǎn)生有害效應(yīng)的重要的中間事件。從AOP的角度看，細(xì)胞死亡往往是通往有害結(jié)局(adverse outcome, AO)的重要關(guān)鍵事件(key events, KE)。目前，以細(xì)胞死亡為關(guān)鍵事件的疾病，往往是一些死亡率較高且難以治愈的疾病，例如神經(jīng)退行性疾病，包括帕金森、老年癡呆等，其重要病因是神經(jīng)細(xì)胞的大量壞死，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的功能退化[82]。近年來(lái)，這些疾病的發(fā)生和環(huán)境污染之間的聯(lián)系受到普遍關(guān)注[4, 83]。應(yīng)用功能基因組學(xué)可以發(fā)掘環(huán)境化學(xué)品暴露導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與基因功能之間的直接關(guān)聯(lián)，因此，CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)篩選在研究環(huán)境化學(xué)品暴露導(dǎo)致細(xì)胞死亡的分子機(jī)制與相應(yīng)疾病之間的聯(lián)系上，具有重大優(yōu)勢(shì)[30]。

2.2.1 建立基因與化學(xué)品有害效應(yīng)的直接關(guān)聯(lián)

目前，CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)篩選已經(jīng)比較廣泛用于藥物和有毒物質(zhì)的生物學(xué)測(cè)試，包括治療癌癥的藥物、微生物毒素、有毒重金屬、農(nóng)藥與空氣污染物的研究。對(duì)于藥物和微生物毒素的報(bào)道，Shen等[20]已做了較為完整的綜述。本文只綜述CRISPR-Cas9功能基因組篩選在環(huán)境化學(xué)品的毒性機(jī)制的研究。

GeCKOv1質(zhì)粒庫(kù)首次被應(yīng)用于識(shí)別化學(xué)品細(xì)胞毒性關(guān)聯(lián)基因。本課題組的Xia等[12]首次將CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)篩選應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)品的毒性機(jī)制研究。他們利用GeCKOv1質(zhì)粒庫(kù)構(gòu)建了全基因組水平敲除的人類肝癌的HepG2細(xì)胞，通過暴露于3種不同劑量(細(xì)胞毒性的IC50、IC20、IC10)的三氯生(triclosan, TCS)，通過檢測(cè)以細(xì)胞死亡為毒性終點(diǎn)的表型，識(shí)別了一些已知的三氯生毒性機(jī)制，同時(shí)也發(fā)掘了三氯生的潛在毒性機(jī)制。排名靠前的2個(gè)重要基因FTO和MAP2K3的功能缺失均介導(dǎo)了HepG2細(xì)胞對(duì)三氯生引發(fā)的細(xì)胞死亡的抗性。三氯生低劑量反向篩選識(shí)別出的基因顯著富集了與免疫相關(guān)的生物學(xué)通路，這與低劑量三氯生暴露下的轉(zhuǎn)錄組提供的分子響應(yīng)信息是一致的。通過聯(lián)合分析疾病數(shù)據(jù)庫(kù)(DisGeNET和CTD)，發(fā)現(xiàn)了FTO和MAP2K3與乳腺癌和肥胖的關(guān)聯(lián)。而流行病學(xué)研究表明乳腺癌和肥胖均與三氯生暴露相關(guān)[84-85]。該研究通過CRISPR功能基因組篩選發(fā)掘了三氯生的潛在毒性機(jī)制，并且提示了與三氯生暴露相關(guān)的疾病的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。

基于GeCKOv2質(zhì)粒庫(kù)的二次篩選增加CRISPR篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。Sobh等[86]利用GeCKOv2質(zhì)粒庫(kù)構(gòu)建了全基因組敲除的人類白血病細(xì)胞K562，揭示了乙醛的潛在毒性機(jī)制。該團(tuán)隊(duì)通過將sgRNA質(zhì)粒文庫(kù)分成2個(gè)亞庫(kù)，并進(jìn)行了2次反向篩選，通過第二次的篩選，對(duì)第一次的篩選結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，該方法是一種利用二次篩選對(duì)多個(gè)備選基因進(jìn)行驗(yàn)證的嘗試與創(chuàng)新。此外，OVCA2被識(shí)別出與細(xì)胞對(duì)乙醛的細(xì)胞毒性相關(guān)，OVCA2的基因功能缺失導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)乙醛導(dǎo)致的細(xì)胞死亡敏感性增加，同時(shí)，OVCA2的缺失導(dǎo)致細(xì)胞在乙醛暴露下的DNA加合物積累的增加，提示OVCA2與乙醛介導(dǎo)的遺傳毒性有關(guān)。此外，該團(tuán)隊(duì)還利用K562全基因組敲除的細(xì)胞庫(kù)識(shí)別了與三價(jià)砷細(xì)胞毒性相關(guān)的基因[87]，其中KEAP1和TXNDC17敲除會(huì)顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)三價(jià)砷細(xì)胞毒性的抗性。AQP3、ZNT1和MTF1的功能缺失也可以增強(qiáng)對(duì)三價(jià)砷的抗性，ABCC1的功能缺失可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)三價(jià)砷的敏感性。硒代半胱氨酸代謝通路上的基因的功能缺失會(huì)顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)三價(jià)砷的抗性，提示細(xì)胞內(nèi)的硒代謝與三價(jià)砷的相互關(guān)系會(huì)影響砷的細(xì)胞毒性。

通過檢測(cè)細(xì)胞熒光識(shí)別基因與低劑量化學(xué)品有害效應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。Panganiban等[88]使用CHOP報(bào)告基因法為檢測(cè)終點(diǎn)，通過CRISPR全基因組篩選識(shí)別了功能缺失會(huì)增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的基因。CRISPR全基因組篩選識(shí)別出L3MBTL2、MGA和microRNA-124-3是打分最高的基因。這3個(gè)基因的功能缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)多種通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的化學(xué)品的敏感性增強(qiáng)，而這些基因的過表達(dá)，可以導(dǎo)致敏感性降低。L3MBTL2在未產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的細(xì)胞中，與CHOP的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制CHOP的表達(dá)，但在發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的細(xì)胞中，與CHOP啟動(dòng)子分離。此外，miR-124-3直接靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的關(guān)鍵基因。

目前，CRISPR功能基因組篩選已經(jīng)通過檢測(cè)細(xì)胞活性或者與特定毒性終點(diǎn)關(guān)聯(lián)的熒光，構(gòu)建了基因與環(huán)境化學(xué)品有害效應(yīng)的直接關(guān)聯(lián)。檢測(cè)細(xì)胞活性的CRISPR篩選可以識(shí)別與介導(dǎo)細(xì)胞死亡關(guān)聯(lián)的基因，而檢測(cè)與特定毒性終點(diǎn)關(guān)聯(lián)的熒光的CRISPR篩選可以識(shí)別與介導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞毒性關(guān)聯(lián)的基因。前者基于檢測(cè)細(xì)胞活性，因此其識(shí)別的基因不受已有毒性機(jī)制的約束，可以在最大程度上獲取與介導(dǎo)細(xì)胞死亡關(guān)聯(lián)的基因。相比之下，檢測(cè)與特定毒性終點(diǎn)關(guān)聯(lián)的熒光的CRISPR篩選，其檢測(cè)指標(biāo)是基于已知毒性機(jī)制設(shè)置的報(bào)告基因，可能導(dǎo)致識(shí)別的基因范圍受限。但這種篩選方法因?yàn)闄z測(cè)細(xì)胞熒光，進(jìn)行篩選所需要的化學(xué)品暴露劑量往往比較低，且暴露時(shí)間更短，便于進(jìn)行對(duì)低劑量化學(xué)品或者基于環(huán)境暴露劑量的化學(xué)品的毒性機(jī)制研究。

2.2.2 識(shí)別導(dǎo)致細(xì)胞死亡的化學(xué)品毒性機(jī)制

由于以細(xì)胞死亡為毒性終點(diǎn)的表型檢測(cè)是CRISPR功能基因組學(xué)篩選最主要的檢測(cè)指標(biāo)，因此，目前大多數(shù)CRISPR篩選研究均是識(shí)別與細(xì)胞死亡關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制。這類研究主要分為對(duì)癌癥藥物和環(huán)境化學(xué)品暴露導(dǎo)致細(xì)胞死亡的功能基因組學(xué)篩選。而對(duì)于環(huán)境化學(xué)品的毒性機(jī)制研究，細(xì)胞死亡是相應(yīng)化學(xué)品所導(dǎo)致有害效應(yīng)的重要中間事件，這類化學(xué)品往往通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、線粒體損傷等而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[89-90]。而與這類化學(xué)品暴露關(guān)聯(lián)的疾病的重要病因就包括靶細(xì)胞的死亡，因此，這類化學(xué)品導(dǎo)致細(xì)胞死亡的分子機(jī)制往往是導(dǎo)致疾病的重要機(jī)制或者是可以開發(fā)成治療靶標(biāo)的生物標(biāo)志物[91]。

CRISPR功能基因組學(xué)篩選可以識(shí)別導(dǎo)致細(xì)胞死亡的分子啟動(dòng)事件。Reczek等[30]使用CRISPR功能基因組學(xué)篩選識(shí)別了與百草枯暴露導(dǎo)致細(xì)胞死亡關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制。百草枯可以通過引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而百草枯誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的根源是不清楚的。該團(tuán)隊(duì)使用覆蓋所有與代謝有關(guān)的基因的CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)篩選，通過進(jìn)行正向篩選(百草枯暴露濃度模擬百草枯急性暴露的人體內(nèi)暴露劑量)，識(shí)別了POR、ATP7A和SLC45A4是百草枯暴露導(dǎo)致細(xì)胞死亡所必需的3個(gè)基因。此外，POR是百草枯誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激的來(lái)源。由于百草枯是誘導(dǎo)帕金森疾病的重要的環(huán)境污染物之一[92]，帕金森病是一種神經(jīng)退行性疾病，其主要病因?yàn)槎喟桶纺苌窠?jīng)元的損傷與壞死。這次報(bào)道中發(fā)現(xiàn)的POR基因所編碼的蛋白位于線粒體呼吸鏈，而線粒體的功能紊亂與帕金森疾病的病因有重要聯(lián)系[93]，此研究的成果對(duì)于開發(fā)治療帕金森疾病的藥物具有重要參考價(jià)值。

多時(shí)間點(diǎn)的CRISPR篩選完善了導(dǎo)致細(xì)胞死亡的分子機(jī)制。Shortt等[23]使用全基因組敲除的人類肝細(xì)胞系HUH7細(xì)胞開展了對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)導(dǎo)致肝損傷機(jī)制的研究。APAP是一種常見的感冒藥，用于鎮(zhèn)痛消炎，但其也是一種可以導(dǎo)致肝損傷的化學(xué)品。該團(tuán)隊(duì)通過開展多時(shí)間點(diǎn)的CRISPR功能基因組學(xué)篩選，發(fā)現(xiàn)了眾多與介導(dǎo)肝細(xì)胞死亡和維持肝細(xì)胞活性的基因，例如BMPR1A和FCGR3A，這些基因富集了鈣離子信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和脂肪酸代謝通路。這些基因和生物學(xué)通路的識(shí)別為解析APAP導(dǎo)致的肝損傷分子機(jī)制提供了依據(jù)，同時(shí)也為肝損傷的治療提供了潛在治療靶標(biāo)。

3 展望(Perspectives)

人類對(duì)化學(xué)品暴露的有害效應(yīng)存在易感性差異，而不同個(gè)體間的遺傳變異是導(dǎo)致這種易感性差異的重要原因。目前，以GWAS為代表的分子流行病學(xué)研究依賴關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)分析來(lái)獲取遺傳變異與疾病表型的關(guān)聯(lián)，但難以為這種關(guān)聯(lián)提供機(jī)制證據(jù)。同時(shí)，基于統(tǒng)計(jì)分析篩選出的備選基因往往數(shù)量較多，GWAS研究無(wú)法提供優(yōu)先性評(píng)估。而CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)可以提供基于遺傳變異視角的化學(xué)品的毒性機(jī)制[30]，通過聯(lián)合CRISPR篩選與分子流行病學(xué)分析，可以開展針對(duì)化學(xué)品有害效應(yīng)的易感性機(jī)制研究，進(jìn)而為有效識(shí)別易感人群提供機(jī)制證據(jù)，為開展環(huán)境化學(xué)品的精準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定基礎(chǔ)(圖6)。

當(dāng)前的CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)依賴于CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行對(duì)基因的編輯或敲除。目前，針對(duì)于其在化學(xué)品毒性機(jī)制研究的應(yīng)用，CRISPR-Cas9技術(shù)主要的局限性表現(xiàn)在脫靶效應(yīng)[94]和物種的限制。脫靶效應(yīng)可以通過生物信息學(xué)的計(jì)算，對(duì)sgRNA序列的設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而降低脫靶概率[94-95]。同時(shí)，可以通過技術(shù)改進(jìn)，例如：可以事先將細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)優(yōu)化設(shè)計(jì)的Cas9蛋白，然后將只含有sgRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中，這樣既增加了轉(zhuǎn)染效率，也可以降低脫靶概率[96]。另一方面，當(dāng)前的CRISPR篩選主要應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在其他物種中的應(yīng)用較少。而這種限制不是來(lái)源于CRISPR技術(shù)本身，而是因?yàn)閷?duì)其他物種的基因組的解析程度不足。目前，已有少量在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行CRISPR功能基因組篩選的報(bào)道，例如家蠶[97]。隨著其他物種的基因組的不斷解析，可以實(shí)現(xiàn)CRISPR功能基因組篩選在更多生態(tài)物種中的應(yīng)用，進(jìn)而為該技術(shù)在生態(tài)毒理學(xué)中的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

分子流行病學(xué)利用基因組學(xué)測(cè)序，通過關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)分析，建立遺傳變異與個(gè)體疾病表型之間的關(guān)聯(lián)。傳統(tǒng)的分子流行病學(xué)方法主要是全基因組關(guān)聯(lián)性研究(GWAS)。依賴于組學(xué)技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，基于人群的環(huán)境化學(xué)品暴露的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和表觀遺傳組學(xué)已經(jīng)逐漸被應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)品的毒性機(jī)制研究。這些人群組學(xué)方法的最大優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)人體樣本，可以直接基于個(gè)體疾病表型進(jìn)行分組和分析[98-99]。雖然這些方法獲取的分子信息具有一定程度的表型錨定，但由于疾病的復(fù)雜性，以上組學(xué)方法獲取的分子擾動(dòng)信息與疾病的關(guān)系不能準(zhǔn)確確定，例如：獲取的生物學(xué)通路擾動(dòng)的信息，不能準(zhǔn)確確定其是導(dǎo)致疾病的原因還是疾病本身所產(chǎn)生的癥狀效應(yīng)，因此，這種類型的表型錨定具有不確定性。此外，由于往往不能及時(shí)獲取化學(xué)品暴露后的人體樣品，所以基于外暴露濃度的劑量-關(guān)系效應(yīng)往往具有不確定性，此時(shí)，必須使用對(duì)應(yīng)的內(nèi)暴露劑量，這又提高了研究的成本與難度。

因此，對(duì)于化學(xué)品有害效應(yīng)的易感性機(jī)制研究，需要有一種低成本且高效的替代測(cè)試方法為分子流行病學(xué)研究所識(shí)別的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素(genetic risk factor)提供機(jī)制證據(jù)和優(yōu)先性評(píng)估。這就要求這種替代測(cè)試方法具備以下功能[20]：(1) 可以獲取全基因組水平的分子響應(yīng)信息；(2) 可以建立化學(xué)品有害效應(yīng)與基因功能的直接關(guān)聯(lián)；(3) 可以提供基于遺傳變異的分子事件視角；(4) 可以實(shí)現(xiàn)高通量的化學(xué)品測(cè)試。而CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)篩選就是一個(gè)可以同時(shí)滿足以上要求的替代測(cè)試方法。由CRISPR-Cas9介導(dǎo)的對(duì)基因的編輯，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因特定片段的特異性敲除，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的基因功能缺失，這種基因功能缺失可以導(dǎo)致細(xì)胞的某些代謝和功能的變化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化學(xué)品有害效應(yīng)的易感性變化。這個(gè)過程與由遺傳變異介導(dǎo)的化學(xué)品有害效應(yīng)的易感性變化類似。遺傳變異與基因編輯所產(chǎn)生的效應(yīng)均體現(xiàn)為基因功能的變化，而化學(xué)品有害效應(yīng)的易感性最終是歸因于基因功能的變化，因此CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)可以提供基于遺傳變異的分子事件視角。

未來(lái)可將CRISPR-Cas9功能基因組學(xué)與分子流行病學(xué)分析聯(lián)合運(yùn)用，來(lái)探究化學(xué)品有害效應(yīng)易感性機(jī)制[13, 20]。Shortt等[23]使用全基因組敲除的人類肝細(xì)胞系HUH7細(xì)胞開展了對(duì)乙酰氨基酚(APAP)導(dǎo)致肝損傷機(jī)制的研究。通過將CRISPR篩選獲取的基因信息與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中人群在APAP暴露下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和肝損傷個(gè)體的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)了一些相同的基因。此外，通過對(duì)比疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，也發(fā)現(xiàn)了一些CRISPR篩選與人群肝損傷相關(guān)基因的相同基因。這些相同的基因可以作為APAP導(dǎo)致肝損傷的易感性機(jī)制的潛在研究對(duì)象。但該研究對(duì)GEO數(shù)據(jù)的分析過于簡(jiǎn)單，只是簡(jiǎn)單地將差異表達(dá)基因與CRISPR篩選識(shí)別的基因進(jìn)行維恩圖分析，尋找其中的相同基因，并未對(duì)GEO數(shù)據(jù)進(jìn)行深入的再分析。此外，針對(duì)與APAP暴露導(dǎo)致的肝損傷相關(guān)的遺傳變異，該研究尚無(wú)對(duì)這些單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)在人群中的基因頻率和藥物導(dǎo)致的肝損傷的患病率或者其他相關(guān)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。因此，該研究后續(xù)仍需要進(jìn)行更多深入的分子機(jī)制的驗(yàn)證和相關(guān)分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)的深入分析，以在更深層次揭示對(duì)APAP導(dǎo)致的肝損傷的易感性機(jī)制。

總之，不同的功能基因組學(xué)具有相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)和局限性，可以根據(jù)具體的研究目的和化學(xué)品特性來(lái)選擇合適的測(cè)試方法開展環(huán)境化學(xué)品的毒性機(jī)制研究。同時(shí)，在化學(xué)品有害效應(yīng)的易感性機(jī)制研究方面，則需要聯(lián)合其他的組學(xué)方法以及分子流行病學(xué)分析來(lái)開展相關(guān)研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：張效偉(1978—)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。