許燕娟，沈斐,2*，魏煥平，魏竹秋，章嘉晴

(1.江蘇省無錫環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 無錫 214121； 2.江南大學環(huán)境與土木工程學院，江蘇 無錫 214122)

磺胺類抗生素是最早人工合成、使用量最大的抗生素之一，具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉等優(yōu)點，被廣泛應用于人工養(yǎng)殖和臨床治療?；前奉惪股卦谌梭w及動物體內(nèi)不能被完全吸收，大部分會隨著排泄物排出體外，進入環(huán)境，進而對自然水體造成污染。近年來，抗生素在國內(nèi)水環(huán)境中檢出的報道屢見不鮮[1-3]。水環(huán)境中的抗生素濃度較低，普遍處于痕量及微量水平，預處理通常使用固相萃取法[4]、固相微萃取法[5-6]和液液萃取法[7]純化和濃縮目標物，從而滿足對痕量抗生素的分析需求。但是傳統(tǒng)的前處理方法需要進行人工萃取，工作量較大，操作及分析測試時間較長。在線固相萃取-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有快速靈敏、定量準確、檢出種類多等優(yōu)勢[8]，是目前國際上最先進的痕量有機污染物快速分析方法之一?，F(xiàn)通過優(yōu)化全自動在線固相萃取、液相色譜和三重四極桿質(zhì)譜三者的實驗條件，建立了快速定性、定量分析地表水中磺胺類抗生素的方法，對完善飲用水源地監(jiān)測預警體系，正確評估水體抗生素污染程度具有重要價值，為環(huán)境管理提供重要的技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

在線固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：2777C全自動在線前處理系統(tǒng)(美國Waters公司)；AQUITY UPLCTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；API4000+三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；Acquity BEH 130 C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm×1.7 μm，美國Waters公司)；Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm×1.7 μm，美國Waters公司)。Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)；HLB Direct Connect HP 在線固相萃取柱(2.1 mm × 30 mm × 20 μm，美國Waters公司)；0.22 μm聚四氟乙烯濾膜(美國Waters公司)。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈和正己烷(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(98%，美國Sigma-Aldrich公司)；磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺甲氧嗪(SMP)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺對甲氧嘧啶(SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SFZ)、磺胺異惡唑(SIZ)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺間二甲氧嘧啶(SMM)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDM’)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺苯吡唑(SPP)和磺胺喹惡啉(SQX) (1 000 mg/L，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)。

1.2 樣品采集及前處理

樣品采集：采用50 mL棕色磨口玻璃瓶采集樣品，預先加入100～150 μL甲醇防止微生物生長。水樣應充滿采樣瓶，在避光4 ℃保溫箱中保存。水樣采集后，12 h內(nèi)送至實驗室。

樣品前處理：取10 mL樣品，經(jīng)0.22 μm的聚四氟乙烯濾膜過濾，如果水樣顆粒物較多，可以先6 000 rmp離心10 min，取上清液后再用濾膜過濾的方式將顆粒物去除。加入甲酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，放入樣品瓶中待測。

1.3 實驗條件

1.3.1 在線固相萃取條件

流動相A為含1%甲酸的超純水溶液，流動相B為含1%甲酸的甲醇，流動相C為甲醇/丙酮/正己烷(體積比為1∶1∶1)。實驗進樣量為5.0 mL。在線固相萃取條件參數(shù)見表1。流動相比例變化在分段結(jié)束時步進至最終條件。

表1 在線固相萃取條件參數(shù)

1.3.2 超高效液相色譜條件

流動相A1為含0.1%甲酸的超純水溶液，流動相B1為乙腈溶液。色譜柱柱溫為40 ℃。超高效液相色譜流動相梯度洗脫程序見表2。

表2 超高效液相色譜流動相梯度洗脫程序

1.3.3 三重四極桿質(zhì)譜條件

采用多反應監(jiān)測(MRM)模式，使用電噴霧電離源(ESI+源)分析，噴霧電壓為5 500 V，氣簾氣壓為2.07×105Pa，霧化溫度為550 ℃，霧化氣壓為3.79×105Pa，輔助氣壓為4.14×105Pa。特征離子經(jīng)過對錐孔電壓和碰撞電壓等因素的優(yōu)化，確定了質(zhì)譜分析參數(shù)(表3)。

表3 質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 在線固相萃取柱選擇

HLB固相萃取柱由特殊的共聚合技術(shù)制備而成，含有疏水性的二乙烯基苯結(jié)構(gòu)和親水性的N-乙烯基吡咯烷酮結(jié)構(gòu)，是酸性、堿性、中性化合物的通用型固相萃取柱，具有良好的吸附萃取效果，相對于C18填料固相萃取柱具有更強的適用性，在抗生素分析中被廣泛使用[9]。因此，本方法采用HLB Direct Connect HP 作為在線固相萃取柱。

2.2 樣品pH值對在線固相萃取效率的影響

由于抗生素含有酸性或堿性官能團，因此樣品的pH值決定了它們的電離狀態(tài)，從而影響其萃取效率[10]。當樣品的pH值高于待測物的pH值時，待測物分子以親水離子存在，無法在疏水基團的固相萃取小柱上保留。水樣的pH值很大程度地影響了目標物在水樣中的存在形態(tài)、穩(wěn)定性以及固相萃取柱對目標物的富集效果，因此將pH值調(diào)節(jié)為2～7，再進行回收率對比實驗?；谝嘿|(zhì)檢測的原理，建議使用甲酸、乙酸或者三氟乙酸(正離子)來調(diào)節(jié)樣品的pH值，本研究采用甲酸調(diào)節(jié)pH值，樣品pH值對回收率的影響見圖2。由圖2可見，pH值為中性時，回收率較差；pH值為2～3時，回收率有明顯提升，在線固相萃取效果較好。

圖2 樣品pH值對回收率的影響

2.3 淋洗液的選擇

復雜基質(zhì)樣品在分析過程中，基質(zhì)成分與待測物在霧滴表面離子化競爭過程中會顯著地降低或增強目標離子的生成效率及離子強度，進而對測定結(jié)果產(chǎn)生嚴重影響。目前關(guān)于基質(zhì)效應的研究在國內(nèi)外已有較多成果發(fā)表[8,11-12]，但水環(huán)境中抗生素相關(guān)成果較少，在復雜基質(zhì)中的抗生素分析更是鮮有報道。在基質(zhì)較為復雜的實際樣品加標實驗中發(fā)現(xiàn)，在線固相萃取小柱未經(jīng)淋洗液淋洗，部分化合物受基質(zhì)效應影響，響應值明顯偏低，導致回收率結(jié)果降低。不同淋洗液有機相比例對目標化合物回收率的影響見表4。由表4可見，采用含有一定比例的有機相水溶液淋洗，能夠降低基質(zhì)效應的影響，提高加標回收率;采用過高比例的有機相水溶液淋洗，則會將目標物洗脫下來，導致回收率下降。因此，選擇最佳淋洗液有機相比例為1%～5%的甲醇水溶液。

表4 不同淋洗液有機相比例對目標化合物回收率的影響

2.4 色譜柱對色譜峰形和分離的影響

本研究選用常見的Acquity BEH 130 C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)、Acquity BEH C18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm) 和 Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm) 色譜柱，通過注射磺胺類抗生素標準品，研究超高效液相色譜柱上的分離效果。3種色譜柱分離磺胺類抗生素的效果具有一定差異，采用Acquity BEH C18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)時，磺胺類抗生素色譜峰形較寬，分離度也不理想。這可能是因為色譜柱較短，理論塔板數(shù)無法滿足多個磺胺類抗生素的測定。而Acquity BEH 130 C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)和Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)由于色譜柱較長，理論塔板數(shù)較前者更高，分離效果和色譜峰形要好于50 mm短柱。特別是Acquity BEH 130 C18色譜柱，由于該色譜柱為肽分析柱，在分析含有大量藻類的富營養(yǎng)化地表水樣品時具有較好的分析效果(圖3)，因此,選擇Acquity BEH 130 C18色譜柱為地表水中磺胺類抗生素的分離色譜柱。

圖3 富營養(yǎng)化地表水樣品分析效果

2.5 標準曲線、相關(guān)系數(shù)與方法檢出限

配制磺胺類抗生素混合標準溶液，以目標組分的響應值y對相應的質(zhì)量濃度x繪制標準曲線，無法進行色譜分離的同分異構(gòu)體使用響應值加和計算。在去離子水中添加低質(zhì)量濃度標準溶液(1.0～5.0 ng/L)，按照上述方法進行測定，計算標準偏差S，按MDL=S×t(n-1，0.95)計算方法檢出限。式中，t(n-1，0.95)為置信度為95%、自由度為(n-1)時的t值；n為重復樣品數(shù)。標準曲線、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限見表5。由表5可見，濃度范圍內(nèi)線性良好，檢出限達到ng/L級，滿足了磺胺類抗生素痕量分析測試的要求。

表5 標準曲線、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限結(jié)果(n=7)

2.6 精密度和準確度

在地表水樣品中添加不同質(zhì)量濃度的加標溶液，按上述方法進行測定，每個質(zhì)量濃度平行測定7次，計算回收率及相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表6。由表6可見，水樣的加標測定值其RSD≤10.6%，回收率為80.6%～113%，能夠滿足日常測定的要求。

表6 精密度和準確度(n=7)

2.7 實際水樣分析

按上述實驗方法對無錫某地表水點位實際水樣進行分析(表7)。由表7可見，部分磺胺類抗生素有檢出。因此，對于地表水中抗生素污染應給予重視，確保水質(zhì)和生態(tài)環(huán)境安全。

表7 實際水樣測定①

3 結(jié)語

采用在線固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法快速測定地表水中磺胺類抗生素，該方法簡便快捷，靈敏度高，分析時間僅需17 min，克服了傳統(tǒng)分析方法工作量較大，前處理及分析測試時間較長，操作煩瑣等缺點?？瞻姿畼拥募訕藴y定值其RSD≤10.6%，回收率為80.6%～113%，能夠滿足日常測定要求，適用于抗生素污染的應急突發(fā)事件的快速定性、定量測定，以及大批量抗生素污染樣品的快速監(jiān)測需求。