王克英 徐 凱 強金偉 方雨函 李勇愛 韓翠平*

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，其起病隱匿、發(fā)展迅速，傳統(tǒng)的影像學檢查方法（超聲、CT、MRI）主要以解剖顯像為主， 常難以發(fā)現(xiàn)早期階段的腫瘤，故75%的患者確診時已屬中晚期，5 年生存率小于50%，而早期卵巢癌的生存率可高達92%［1］，故對卵巢癌的早期精確的診斷和治療是提高卵巢癌治愈率及改善患者生存質量的關鍵。因此發(fā)展一種安全的具有高靈敏度及特異度的診斷方法對于卵巢癌的早期診斷及治療尤為重要。本研究擬采用簡單合成策略，制備出熒光性能優(yōu)良、T1 弛豫效率高、生物相容性較好的卵巢癌靶向Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 納米探針，為卵巢癌早期精確診斷提供理論和實驗基礎。

方 法

1. 納米探針的制備

1.1 Mn-CNSs制備、純化

將二乙三胺五乙酸0.197 g（0.5 mmol）、四水氯化亞錳0.098 g（0.5 mmol）去離子水（40 mL）在空氣中55℃下磁力攪拌1 h（500 r/min），得到無色透明的水溶液；取上述溶液1 mL，加入0.01 mL 的乙二胺，在200℃的烘箱內加熱1.5 h，得到固態(tài)的Mn-CNSs。加入0.1 mL 去離子水溶解，再加入0.2 mL 丙酮，在離心機中離心（10 000 r/min，5 min），丟棄上清液，保留底部沉淀，同樣方法重復3 次后，得到純凈的Mn-CNSs，在37℃真空干燥箱烘干后室溫保存?zhèn)溆谩Ｓ秒姼旭詈系入x子體質譜儀檢測Mn-CNSs 中錳離子的濃度。

1.2 Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb的制備

在室溫攪拌條件下將硼酸鈉（200 μL，500 mmol/L，pH=9.5）逐滴加入到Mn-CNSs 溶液（300 μL，9.5 mg/mL）中，加入戊二醛（100 μL，質量體積分數(shù)5%）攪拌1 h，再加入單克隆抗HE4 抗體（10 μL，1 mg/mL）攪拌1 h。然后，在冰浴攪拌條件下逐滴加入硼氫化鈉（100 μL，20 mg/mL），1 h后將溶液保存在4℃冰箱12 h，即得到卵巢癌靶向納米探針Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb。用紫外吸收光譜及Zeta電位驗證偶聯(lián)。

2. 納米探針的形貌表征

使用發(fā)射透射電子顯微鏡（TEM） 觀察Mn-CNSs 的形態(tài)、大小、分布等。采用熒光分光光度法測定不同波長時的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜，以0.001 mol的硫酸奎寧為參比物，計算Mn-CNSs的熒光量子產(chǎn)率。將純化后的Mn-CNSs根據(jù)ICP-MS檢測出錳離子的含量，分別配制成0.15、0.52、1.05、2.01、3.14 mmol/L 的Mn-CNSs 水溶液，用3.0 T GE 750 W MR 儀測量各濃度的T1 弛豫時間，計算Mn-CNSs 的T1 弛豫效率。掃描參數(shù)如下。①T1WI：TE=Min Full，TR=425 ms，F(xiàn)OV=18 cm×18 cm，矩陣=224×224，層厚=3.0 mm；②T1-Map 序列：TE=Min Full，TR=5 100 ms，F(xiàn)OV=18 cm×18 cm，矩陣=224×224，層厚=3.0 mm。

將純化后的固態(tài)Mn-CNSs配制成1.5 mg/mL的水溶液，取100 μL滴在單晶硅板上，烘干，反復5遍后完成制樣，進行X 射線衍射分析（XPS）分析。測試參數(shù)：單色Al Ka（hv=1 486.6 eV），功率150 W，500 μm 束斑。取適量純化后的固態(tài)Mn-CNSs，分別與溴化鉀按1∶20 質量比混勻、研磨、壓片。用傅立葉變換紅外光譜儀進行掃描，掃描波長約400～4 000 cm-1，疊加平均次數(shù)為16次。

3. Mn-CNSs的毒性

3.1 Mn-CNSs的細胞毒性

采用新型四唑化合物（MTS）法測定細胞生長存活率，取HO-8910 細胞及EA.hy926 細胞，均勻接種于96 孔培養(yǎng)板，分別加入質量濃度為0 mg/mL（對照組）、0.03 mg/mL、0.09 mg/mL、0.18 mg/mL、0.37 mg/mL、0.55 mg/mL、0.74 mg/mL 的 含Mn-CNSs 培養(yǎng)基溶液，每個濃度設置8 組平行實驗。培養(yǎng)24 h 后加入MTS 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標儀讀取每孔的光密度（OD）值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=As的OD值/Ac的OD值×100%。

3.2 Mn-CNSs的活體毒性

將小鼠尾靜脈注射150 μL（0.35 mg/mL）Mn-CNSs，對照組小鼠注射等體積的去離子水，設置3組平行實驗，分別在7 天后解剖實驗組和對照組小鼠，獲得心、肝、脾、肺、腎器官并用甲醛進行固定，送病理科用蘇木精-伊紅染色法制作切片，在光學顯微鏡下觀察組織結構。

4. Mn-CNSs的穩(wěn)定性與生物相容性

4.1 常溫下Mn-CNSs熒光及磁性的穩(wěn)定性檢測

將Mn-CNSs 水溶液制成3 個平行樣本，常溫下放置，分別在0、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0個月時測量發(fā)射光譜的峰值強度及磁共振T1 弛豫時間變化情況。

4.2 Mn-CNSs的生物相容性

將用肝素鈉穩(wěn)定的新鮮血液離心（1 200 r/min，15 min），用PBS 洗滌以獲得小鼠紅細胞（MRBC）。用0.8 mL 水（作為陽性對照）、0.8 mL PBS（作為陰性對照）及0.8 mL（0.35 mg/mL）Mn-CNSs 分別稀釋MRBCs。放置2 h 后離心（10 000 r/min，1 min），留存上清液，用UV-2450UVeVis 分光光度計測定吸光度值，按公式計算溶血率。溶血率（%）=（A試-A陰）/（A陽-A陰）×100%。

5. 卵巢癌細胞靶向熒光及磁共振成像

將HO-8910細胞及EA.hy926細胞培養(yǎng)孔中分別加入350μg/mL Mn-CNSs、350μg/mL Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb及磷酸鹽緩沖液各600μL，分別記為Ab（-）組、Ab（+）組、PBS組，每組設3個平行樣本。樣品置于熒光倒置顯微鏡下觀察，用不同波長的激發(fā)光進行激發(fā)，行相同視野下的熒光顯像。用3.0 T Discovery 750 W MR儀掃描樣品，測量各組樣品的T1弛豫時間。

6. 統(tǒng)計學分析

采用SPSS16.0 軟件包進行統(tǒng)計學分析。定量資料以均數(shù)±標準差(xˉ±s)表示。兩組間計量資料的比較采用t檢驗，多組間計量資料的比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD 法檢驗。按檢驗水準α=0.05，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. Mn-CNSs的形貌、表征、性能

制備的Mn-CNSs 加入去離子水后，在自然光源下呈淡黃色、透明均質溶液（圖1A），在紫外燈365 nm 反射光源下呈明亮的藍色熒光（圖1B））。磁共振掃描T1WI呈明顯的高信號（圖1C）），ICP-MS測得Mn-CNSs 中錳的含量為22.99 mg/L。透射電鏡圖顯示Mn-CNSs 呈斑片狀，分布尚均勻，無明顯的聚集現(xiàn)象（圖1D），其內可見間距為0.22 nm 的平行晶格條紋。Mn-CNSs 的粒徑（n=30）為（20.3±0.75）nm（圖1E）。最佳激發(fā)波長位于380 nm 處（圖2A），最大發(fā)射波長位于442 nm 處（圖2B）。以0.001 mol的硫酸奎寧為參比物，計算得到Mn-CNSs 的熒光量子產(chǎn)率為52.53%［2］，T1 弛豫率r1 為（10.41±1.84）L·mmol-1·s-1（圖3）。

Mn-CNSs 的XPS（圖4A）結果顯示：290.68、407.58、540.98 和659.58 eV 處的5 個主要峰對應于C1s、N1s、O1s和Mn2p，原子濃度分別為59.75%C、20.08%O、19.27%N 和0.91%Mn。C1s、N1s、O1s（圖4B～D）高分辨譜顯示Mn-CNSs 中存在位于284.6 eV 的C-C 鍵、285.2 eV 的C-N 鍵、287.3 eV 的C=O鍵、398.2 eV 的N-H 鍵及531.1 eV 的C=O 鍵。Mn 2p3/2 譜（圖4E）顯示在639.3 eV 有一明顯的波峰及在641.2 eV 有一較小波，提示Mn-CNSs 中錳的價態(tài)是二價和三價，且二價錳居多。

Mn-CNSs 的FTIR 圖譜（圖4F）顯示：在3 000～3 700 cm-1處出現(xiàn)一寬大的吸收峰，其代表O-H 和N-H 的吸收峰，同時還可以觀察到在2 960 cm-1處和1 105 cm-1處C-H 的伸縮振動、1 587 cm-1處C=O 的伸縮振動、1 402 cm-1處C=C 的伸縮振動，1 325 cm-1處C-N 的伸縮振動。而Mn-O/Mn-N 在615 cm-1處的伸縮振動峰則代表Mn 離子與N-CNSs 的配位吸收峰。

Mn-CNSs、Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 的紫外吸收光譜圖（圖5）顯示，Anti-HE4 mAb 在278 nm 處存在特征性吸收峰，而Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 比Mn-CNSs在301 nm 處新增了Anti-HE4 mAb的特征性吸收峰，說明Anti-HE4 mAb 已成功組裝到與Mn-CNSs 分子探針表面，由于納米粒子與抗體結合后相鄰粒子間作用力的改變，Anti-HE4 mAb 的吸收峰出現(xiàn)藍移現(xiàn)象。

2. Mn-CNSs的毒性

圖6A 為加入不同質量濃度Mn-CNSs 后HO-8910細胞、EA.hy926 細胞的生存率。如圖所示，Mn-CNSs 在0～0.37 mg/mL 質量濃度時對兩種細胞均無明顯毒性，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且每種細胞的平均生存率均在90%以上；而在0.55～0.74 mg/mL 時呈現(xiàn)細胞毒性作用，隨著質量濃度的遞增，兩種細胞生存率均遞減（P＜0.05）。

從小鼠的腎、脾、肝、心和肺的組織病理結果（圖6B）可以看出，所有被檢器官與對照組相比較，均無明顯的器質性病變、炎癥或其他異常。說明Mn-CNSs應用于活體時無明顯毒性作用。

3. Mn-CNSs的穩(wěn)定性、生物相容性

常溫條件下，Mn-CNSs 不同時間點熒光強度曲線（圖7A）及磁共振信號強度變化曲線（圖7B）顯示，對不同時間點Mn-CNSs 的熒光強度、T1 弛豫時間進行分析時未見明顯變化。采用單因素重復測量方差分析，結果顯示不同時間點間差異無統(tǒng)計學意義（F=1.547，P＞0.05；F=2.012，P＞0.05）。根據(jù)溶血實驗公式可得（0.35 mg/mL） Mn-CNSs 的溶血率為2.41%（＜5%），說明Mn-CNSs 應用于細胞及活體時無明顯溶血作用。

4. 卵巢癌細胞靶向熒光及磁共振成像

卵巢癌靶向熒光分子探針Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 的靶向熒光成像結果（圖8）示HO-8910 細胞的Ab（+）組在不同激發(fā)光下通過熒光顯微鏡觀察到明顯的熒光。在同樣條件下，HO-8910細胞Ab（-）組及EA.hy926 細胞的Ab（+）組未出現(xiàn)明顯的熒光信號。實驗結果說明在本實驗條件下，卵巢癌靶向分子探針Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 實現(xiàn)了對HO-8910 卵巢癌干細胞的靶向熒光成像。

T1WI 圖像（圖9）顯示，Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 與HO-8910 細胞作用后，HO-8910 細胞的Ab（+）組的T1WI 信號明顯增高，而HO-8910 細胞的Ab（-）組、PBS 組及EA.hy926 細胞的Ab（+）組、Ab（-）組、PBS 組的T1WI 信號均明顯低于HO-8910 細胞的Ab（+）組。并且，HO-8910 細胞的Ab（+）組在不同激發(fā)波長激發(fā)下通過熒光顯微鏡觀察到多色的熒光，具備激發(fā)依賴的特性。

討 論

近年來，熒光-磁共振雙模態(tài)納米探針的研究發(fā)展迅速，它以MRI 高分辨率的優(yōu)勢獲得解剖和病理生理信息，以熒光成像的高靈敏度、光穩(wěn)定性獲得分子和細胞層面的信息，將兩種成像技術相結合，設計、開發(fā)出熒光-磁共振雙模態(tài)納米探針，實現(xiàn)優(yōu)勢互補和交叉驗證，進一步提高腫瘤早期診斷的準確性與靈敏度，是腫瘤成像技術未來主要的發(fā)展方向［3-4］。

理想的靶向納米探針需要同時具備熒光性能優(yōu)良、弛豫效率高、穩(wěn)定性好、低毒性和靶向性。釓基復合物（如Gd-DTPA，Gd-DOTA）是目前已經(jīng)被廣泛使用的磁共振造影劑，然而，從復合物釋放的Gd3+在體內累積并且不能被完全代謝，Gd3+通過抑制鈣離子通道可以引起相當大的生物毒性，并可導致腎功能不全患者的腎系統(tǒng)纖維化［5］。為了提高生物安全性，本研究用Mn2+來代替Gd3+，錳是生理代謝的必需元素，體內生物系統(tǒng)可以有效地控制錳在體內的平衡，錳基螯合物由于其良好的生物相容性，可作為潛在的釓基替代造影劑用于T1加權成像［6］。但Mn基納米粒子的成像性能（典型r1＜0.5 L·mmol-1·s-1）遠低于商業(yè)基于釓的對比劑（r1≈3.4 L·mmol-1·s-1）［7］，故提高Mn 基對比劑的弛豫效率是開發(fā)設計錳基對比劑的關鍵。

碳元素是生命體最重要的組成元素之一，以碳元素為主要組成成分的熒光碳點具備熒光性能優(yōu)良、毒性低、生物相容性好、易于大規(guī)模合成及功能化修飾、制備成本低廉、反應條件溫和以及穩(wěn)定性好等無可比擬的優(yōu)勢［8］。其中碳納米片是一種新型的二維碳納米材料，具有獨特的結構（二維單晶結構）、超大的比表面積（吸附性強）、血液循環(huán)時間長等優(yōu)勢，可作為多種生物分子、藥物的有效載體，有希望取代量子點成為新型熒光納米材料［9］。

我們研究組既往選擇與Mn2+有較強絡合能力的有機小分子為碳化原料，通過一步反應得到兼具熒光和MRI 的雙模態(tài)Mn2+摻雜的碳點（Mn-CDs），進一步靶向修飾得到腫瘤靶向熒光/MRI 雙模態(tài)分子影像探針［10］，該探針具有較低的生物毒性和較高的熒光發(fā)光效率，但T1 弛豫效率相對較低（3.26 L·mmol-1·s-1），導致活體成像的靈敏度不高，其主要原因是由于碳點的顆粒較小，負載的Mn2+的量較少。故本研究選擇表面積較大的二維碳納米材料為載體，提高Mn2+的負載量，則有可能改善這一問題，所得納米材料弛豫效率高達（10.41±1.84）L·mmol-1·s-1，為臨床上常用的釓基對比劑（r1≈3.4 L·mmol-1·s-1）的3倍。既往研究表明，摻雜氮元素可以顯著地改變碳納米粒子的光學性質、化學活性及熒光量子產(chǎn)率［11］，故本研究將乙二胺作為表面純化劑，同時提供氮源，所得納米材料量子產(chǎn)率高達52.53%，為傳統(tǒng)碳點（約10%）的5倍［12］。

當納米探針被應用于生物傳感器和細胞成像的前提是具有低毒性和良好的生物相容性。溶血實驗結果顯示Mn-CNSs 的溶血率＜5%，表明Mn-CNSs 不會引起明顯的溶血反應，可用于細胞及活體研究。碳納米粒子具有毒性低、生物相容性好等優(yōu)勢，但摻雜后的納米粒子可能會產(chǎn)生過量的活性氧自由基，引起細胞膜的破壞、DNA 的斷裂、染色體的固定、線粒體功能的受損，最終造成細胞的死亡［13］。本研究從細胞和活體兩個層面對其毒性進行了探究，Mn-CNSs 的質量濃度達到0.52 mg/mL，對細胞和活體均無明顯毒性。在常溫下，Mn-CNSs 納米材料穩(wěn)定性較高，這對材料的生產(chǎn)、包裝、貯存、運輸均提高了便利。

腫瘤細胞特有的分子靶點已成為腫瘤特異性診治的有效依據(jù)，納米探針靶向分子與腫瘤分子靶點的特異性識別作用，促使探針在腫瘤細胞處富集，進而實現(xiàn) 腫 瘤 靶 向 成 像［14］。 人 附 睪 蛋 白4 （human epididymis protein 4，HE4）在卵巢癌組織及患者血清中高表達，而在正常組織（包括卵巢）中表達較低，靈敏度為72%，特異度高達78%［15］，因此，HE4可作為卵巢癌的一個潛在的靶目標及具有診斷價值的標志物。本研究以Anti-HE4 mAb 為靶向親和成分，以Mn-CNSs 探針為信號響應分子，通過戊二醛交聯(lián)法，將戊二醛的兩個醛基分別與分子和抗體蛋白的氨基形成希夫堿，再將它們以5 個碳原子連接起來，成功構建卵巢癌靶向納米探針Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb，并實現(xiàn)了對HO-8910 卵巢癌細胞的熒光-磁共振雙模態(tài)主動靶向成像。除此之外，在HO-8910細胞的靶向熒光成像中Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb 組在不同激發(fā)光下通過熒光顯微鏡觀察到多色的熒光，與單一熒光相比，可以為細胞成像提供更精確的信息，這大大提高了檢測的效率及準確度，為多色熒光納米標記奠定了基礎。

總之，本研究通過簡單的策略成功制備了熒光性能好、T1 弛豫效率高的新型熒光-磁共振雙模態(tài)納米對比劑，通過戊二醛交聯(lián)法構建了卵巢癌腫瘤靶向-熒光-磁性多功能納米探針Mn-CNSs@Anti-HE4 mAb，并實現(xiàn)了對HO-8910 卵巢癌細胞的多色熒光-磁共振成像和靶向性，為卵巢癌早期精確診斷提供理論和實驗基礎。然而本研究仍停留在體外細胞實驗的基礎上，尚未對活體內的主動靶向雙模態(tài)成像進行研究，后續(xù)我們將對以上內容進行深入探究。