杜曉丹,徐維國(guó),朱 靜,李 琳,吳君華

(電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽(yáng)醫(yī)院/綿陽(yáng)市中心醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,四川 綿陽(yáng),621000)

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因之一，約占所有癌癥死亡人數(shù)的1/5,其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見(jiàn)的病理類(lèi)型[1]。由于缺乏典型的臨床癥狀及有效的早期篩查程序,NSCLC患者的5年相對(duì)生存率僅為19%[1-3]。因此，尋找簡(jiǎn)單、靈敏、高效的生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義。三磷酸腺苷(ATP)除了作為細(xì)胞內(nèi)的能量分子，還參與了細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其相關(guān)受體被稱(chēng)為嘌呤能型2受體家族受體(P2Rs),由P2XR和P2YR這2個(gè)亞家族組成。P2XR是一類(lèi)配體門(mén)控離子通道，由7個(gè)不同亞型組成，其中 P2X7受體(P2X7R)定位于細(xì)胞膜，具有獨(dú)特而重要的生物學(xué)功能，被認(rèn)為是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì)，在炎癥和有氧糖酵解中發(fā)揮重要作用[4]。因此,P2X7R可能是多種癌癥的新的生物標(biāo)志物，也可能是靶向治療的新選擇[5]。本研究探討腫瘤組織P2X7R高表達(dá)對(duì)可切除NSCLC患者生存預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010—2015年在本院接受肺葉切除或全肺切除術(shù)的NSCLC患者120例，平均年齡(56.03±15.00)歲，收集所有患者術(shù)中腫瘤標(biāo)本，其中67例組織標(biāo)本包括了癌旁正常肺組織(距離手術(shù)切緣≥5 cm)。經(jīng)本院電子數(shù)據(jù)中心獲取患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):① 經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷為NSCLC者;②由2位病理學(xué)家分別從腫瘤定位、組織病理類(lèi)型、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期等方面對(duì)患者病理資料進(jìn)行了評(píng)估;③ 接受根治性手術(shù)和肺門(mén)縱隔淋巴結(jié)清掃，且術(shù)后接受輔助放療者;④ 排除術(shù)前接受新輔助化療者。組織學(xué)檢查和腫瘤細(xì)胞分化的分級(jí)依據(jù)世界衛(wèi)生組織2004年修訂的分類(lèi)方案和國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)的2009年TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行;患者生存數(shù)據(jù)是從醫(yī)院的醫(yī)療數(shù)據(jù)處理記錄中收集的;將手術(shù)日期至死亡日期的間隔時(shí)間確定為總生存期(OS)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得所有患者的書(shū)面知情同意，并按照機(jī)構(gòu)指南的規(guī)定采集組織樣本。

1.2 免疫組化法(IHC)檢測(cè)組織P2X7R表達(dá)

將使用福爾馬林固定、石蠟包埋的病理組織制成5 μm切片，在60 ℃恒溫箱內(nèi)加熱1 h,然后進(jìn)行IHC分析。使用二甲苯脫蠟，并在梯度乙醇中再水化，在室溫下于含3% H2O2的甲醇溶液中孵育30 min,消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性;將組織切片于98 ℃下在pH值為9.0的目標(biāo)修復(fù)溶液(Dako,丹麥)中孵育40 min;采用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(Dako,丹麥)洗滌數(shù)次后，將組織切片與抗P2X7抗體(ABCAM,英國(guó),1∶100)或抗CD8抗體(ABCAM,英國(guó),1∶250)在4 ℃下孵育過(guò)夜。與一抗孵育后，將切片組織在PBS中沖洗2次，并在室溫下與Dako Envision System HRP偶聯(lián)兔抗體孵育30 min;在PBS中洗滌組織切片，與3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)(Dako,丹麥)在室溫下孵育6～10 min顯色以用于蛋白質(zhì)檢測(cè)，并用蘇木素復(fù)染1 min。采用ICH檢測(cè)P2X7R在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度和分布;采用CD8染色法評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TILs)密度。每個(gè)樣本的免疫染色由2位病理學(xué)專(zhuān)家獨(dú)立審閱。

1.3 IHC結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

P2X7R的表達(dá)通過(guò)IHC評(píng)分進(jìn)行評(píng)估，該評(píng)分是將胞漿和胞膜染色強(qiáng)度(0分為陰性,1分為弱染色,2分為中等染色,3分為強(qiáng)染色)乘以染色程度(<10%為0分,10%～<25%為1分,25%～70%為2分,>70%為3分)。IHC評(píng)分范圍為0～9分，根據(jù)既往研究[6]數(shù)據(jù)，將3分作為最佳臨界值,<3分是低P2X7R組,≥3分是高P2X7R組。評(píng)估CD8+TILs的密度:隨機(jī)選擇5個(gè)視野，首先進(jìn)行半定量染色評(píng)分，分為1分(<1%)、2分(1%～<10%)、3分(10%～<33%)、4分(33%～66%)、5分(>66%);免疫反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿和(或)質(zhì)膜部分或全部陽(yáng)性;染色密度分別為缺失、輕(+)、中()、強(qiáng)();計(jì)算得分(1～8分)，按CD8+TILs密度的平均值分為低密度組和高密度組。

1.4 隨訪預(yù)后情況

所有NSCLC患者術(shù)后每半年隨訪1次，隨訪需進(jìn)行胸部增強(qiáng)CT，并根據(jù)需要進(jìn)行腹部、頭部等部位檢查。自手術(shù)后次日開(kāi)始，記錄腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的部位及時(shí)間，隨訪日期截至2021年10月31日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用卡方檢驗(yàn)分析NSCLC與癌旁正常肺組織P2X7R表達(dá)的差異，并采用卡方檢驗(yàn)分析P2X7R表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系。生存率采用Kaplan-Meier分析，生存率曲線的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。采用單因素和多因素Cox回歸模型分析影響NSCLC患者預(yù)后的因素。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，分析P2X7R表達(dá)診斷NSCLC及預(yù)測(cè)預(yù)后不良的曲線下面積(AUC)。P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 P2X7R的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系

NSCLC組織中P2X7R陽(yáng)性表達(dá)率為51.67%(62/120),高于癌旁正常組織中的25.37%(17/67),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。在P2X7R表達(dá)與臨床病理特征的分析中,TNM分期Ⅲ期、淋巴結(jié)狀態(tài)N1或N2期、腫瘤直徑≥3 cm及CD8+TILs低密度的NSCLC患者的P2X7R高表達(dá)率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

A:P2X7R強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);B:P2X7R陰性表達(dá);C:CD8+TILs高密度;D:CD8+TILs低密度。圖1 NSCLC組織中P2X7R及CD8+TILs的免疫組化結(jié)果

表1 NSCLC組織中P2X7R表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 生存曲線分析

隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)82例(68.33%)，包括局部復(fù)發(fā)18例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移52例，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移12例?；颊?年總生存率為43.33%(52/120)。經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)顯示,P2X7R低表達(dá)者5年無(wú)病生存率(57.89%對(duì)比7.94%)和總生存率(66.67%對(duì)比22.22%)更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖2。

A:P2X7R低表達(dá)與高表達(dá)者無(wú)病生存期的比較;B:P2X7R低表達(dá)與高表達(dá)者總生存期的比較。

2.3 預(yù)后影響因素的單因素和多因素分析

經(jīng)單因素分析，腫瘤直徑、NSCLC組織CD8+TILs密度及NSCLC組織P2X7R表達(dá)均是NSCLC患者5年無(wú)病生存率的預(yù)后影響因子(P<0.05),而吸煙史、TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、NSCLC組織CD8+TILs密度及NSCLC組織P2X7R表達(dá)均是NSCLC患者5年總生存率的預(yù)后影響因子(P<0.05),見(jiàn)表2。多因素Cox回歸分析顯示,TNM分期、吸煙史是患者總生存率的獨(dú)立預(yù)后影響因子，而NSCLC組織中P2X7R表達(dá)是影響5年無(wú)病生存率和總生存率的獨(dú)立預(yù)后影響因子(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 單因素分析影響NSCLC患者預(yù)后不良的預(yù)后因素

表3 多因素分析NSCLC患者預(yù)后不良的影響因素

2.4 P2X7R表達(dá)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后不良的效能

經(jīng)ROC曲線分析,NSCLC組織P2X7R表達(dá)預(yù)測(cè)NSCLC患者5年復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、總生存期的AUC分別為0.850(95%CI:0.770～0.930)、0.780(95%CI:0.696～0.864),cut-off值均為2.5分，特異度分別為70.7%、73.1%,靈敏度分別為86.8%、72.1%。見(jiàn)圖3。

A:P2X7R表達(dá)預(yù)測(cè)5年內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的效能;B:P2X7R表達(dá)預(yù)測(cè)5年內(nèi)總生存期的效能。

3 討 論

肺癌是癌癥死亡的主要原因，約占癌癥死亡總數(shù)的19%,肺癌早期缺乏典型癥狀，大多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，故很難達(dá)到有效治療。局部肺癌的5年生存率為53.2%,但在晚期和發(fā)生轉(zhuǎn)移后的生存率僅有23.7%和3.5%。因此，肺癌的早期診斷對(duì)降低患者病死率至關(guān)重要[7-10]。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中的P2X7R表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且通過(guò)多因素Cox回歸模型和ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),P2X7R表達(dá)是影響5年無(wú)病生存率和總生存率的獨(dú)立預(yù)后影響因子,NSCLC組織中P2X7R陽(yáng)性表達(dá)對(duì)患者預(yù)后不良有一定的預(yù)測(cè)效能，提示P2X7R可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。

P2X7R是嘌呤受體的亞型，其被發(fā)現(xiàn)可作為多種疾病的治療靶標(biāo)。P2X7R已被證實(shí)在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，幾乎所有炎癥細(xì)胞類(lèi)型中都有表達(dá)，包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，以促進(jìn)適應(yīng)性免疫和先天免疫。健康組織中細(xì)胞外ATP的含量很低，在發(fā)生組織損傷、炎癥、缺氧、缺血以及腫瘤微環(huán)境中會(huì)顯著增加，這種核苷酸通過(guò)作用于P2受體來(lái)影響癌癥和浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞反應(yīng)，而定位于胞質(zhì)膜的P2X7R被認(rèn)為是腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì)，在炎癥和有氧糖酵解過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-14]。DE MARCHI E等[15]發(fā)現(xiàn)P2X7R過(guò)表達(dá)與白血病微環(huán)境中ATP水平、急性髓系白血病及對(duì)化療的反應(yīng)有相關(guān)性，并且認(rèn)為P2X7及其遺傳變異體可以被視為血液系統(tǒng)惡性腫瘤的潛在的新的生物標(biāo)志物以及新的治療靶點(diǎn)。ZHANG Y C等[16]研究表明,P2X7激活促進(jìn)PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin和mTOR/HIF1α/VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，從而介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的促腫瘤作用，并且P2X7激動(dòng)劑全身給藥誘導(dǎo)了骨肉瘤裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和腫瘤相關(guān)的骨破壞，而P2X7拮抗劑則逆轉(zhuǎn)了這些作用。CALIK I等[6]還發(fā)現(xiàn)P2X7R過(guò)表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素,P2X7R高表達(dá)與胃癌患者的晚期TNM分期及轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)TNM分期III期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≥3 cm及CD8+TILs低密度的NSCLC患者的P2X7R高表達(dá)率顯著更高。研究[17]證實(shí)NSCLC患者組織中CD8+TILs高密度是有利于患者預(yù)后的標(biāo)志物，表明P2X7R可能參與NSCLC疾病的進(jìn)展，并可能與患者不良預(yù)后相關(guān)。

研究[18]對(duì)P2X7 mRNA與NSCLC的相關(guān)性進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)與表現(xiàn)出P2X7 mRNA高表達(dá)的樣品相比,P2X7 mRNA低表達(dá)的樣品表現(xiàn)出更高的miR-21表達(dá)量,K-Ras突變型NSCLC患者的腫瘤樣本中觀察到顯著升高的miR-21表達(dá)，這些過(guò)程可能與腫瘤進(jìn)展相關(guān);此外，與P2X7 mRNA低表達(dá)患者相比，高表達(dá)NSCLC患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期顯著更低。本研究中,P2X7R低表達(dá)者5年無(wú)病生存率和總生存率更高。吳丹等[19]認(rèn)為P2X7R 高表達(dá)導(dǎo)致NSCLC臨床預(yù)后不佳的機(jī)制可能為:P2X7R高表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移;P2X7R可能通過(guò)影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而影響NSCLC的進(jìn)展;P2X7R高表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞中新生血管形成。QIN J L等[20]研究發(fā)現(xiàn)P2X7在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，并且P2X7缺乏可通過(guò)在體內(nèi)和體外下調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6(STAT6)和干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)磷酸化來(lái)削弱巨噬細(xì)胞的“M2樣”極化,P2X7缺乏可通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成、促進(jìn)T細(xì)胞動(dòng)員和逆轉(zhuǎn)M2樣巨噬細(xì)胞極化來(lái)限制烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生和Lewis肺癌的進(jìn)展;通過(guò)P2X7抑制劑及O-ATP、A-438079鹽酸鹽和A-740003共同給藥，克服了對(duì)免疫療法[抗程序性死亡受體1(PD-1)抗體]和化學(xué)療法(順鉑)的耐藥性，證明了P2X7可能成為治療NSCLC的新靶點(diǎn)[21-22]。

綜上所述,NSCLC組織中P2X7R高表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，并且與TNM III期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)。P2X7R蛋白表達(dá)與CD8+TILs腫瘤組織浸潤(rùn)的負(fù)相關(guān)性亦揭示了其在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的重要作用，這些發(fā)現(xiàn)均支持P2XR7可能是理想的NSCLC預(yù)測(cè)因子和生物分子靶點(diǎn)。