黃彩霞，高 卓，李 浩，王志慧，劉炳炎，潘宇睦，蘆光新

(青海大學農牧學院，青海 西寧 810016)

近年來，隨著我國農業(yè)集約化的快速發(fā)展，每年產生大量的農業(yè)有機廢棄物[1]，這些廢棄物中產量最大的是畜禽糞便及農作物秸稈[2]。高溫好氧堆肥是畜禽糞便無害化處理和肥料化利用的重要途徑[3]，已被廣泛應用在固體廢棄物的處理中[4-5]。我國油菜種植面積大，秸稈資源豐富，然而很大一部分秸稈未被合理利用[6]。油菜秸稈C/N較高，不適宜單獨堆肥，與豬糞混合堆肥,加入調理劑調節(jié)為適合堆肥發(fā)酵的C/N[7]。C/N對堆肥中微生物的正?；顒雍陀袡C肥的品質有重要影響，因此,合適的C/N對堆肥發(fā)酵過程的進行有重要的意義[8-9]。

堆肥過程的本質是一種由群落結構復雜多樣的微生物相互作用而形成的復雜、動態(tài)的生化過程，其中微生物對基質的轉化和分解發(fā)揮著重要作用[10-11]。因此，研究微生物群落組成對了解堆肥過程至關重要。在堆肥過程中，細菌是分解有機物和產熱的主要微生物種群，也是整個堆肥過程中最普遍、數量最多的微生物。有研究者認為，堆肥過程中不同階段細菌的種類和數量相差很大，且不同的細菌主導不同的階段[2,12]。李昌寧等[13]和王建才等[14]利用高通量測序技術研究了豬糞與秸稈堆肥中細菌群落的變化特征，發(fā)現不同溫度階段細菌的相對豐度和優(yōu)勢門、屬都不同。張喆[15]從土和牛糞樣品中以涂布平板分離法篩選并鑒定出耐冷細菌，能快速啟動堆肥升溫。可見，用高通量測序技術研究堆肥過程中細菌群落變化特征是較為常見的方法，另外，在堆肥過程可培養(yǎng)細菌的研究中對功能菌篩選鑒定的研究較多，對整個堆肥發(fā)酵過程中全部可培養(yǎng)細菌的研究鮮少報道，特別是針對高寒地區(qū)自然堆肥發(fā)酵過程中全部可培養(yǎng)細菌菌落特征變化的研究甚少。鑒于此，本研究以高寒地區(qū)的油菜秸稈與豬糞為主要原料，研究其在自然堆制過程中可培養(yǎng)細菌的數量和種類變化，旨在為當地農作物秸稈的高效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油菜秸稈由青海省互助土族自治縣昱青投資開發(fā)有限公司提供，新鮮豬糞由青海泰和宛生物有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基配制

LB培養(yǎng)基制備：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏粉3 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃、0.1MPa滅菌30 min，備用。

1.3 堆肥方法

堆肥試驗在青海大學農林科學實驗站進行，采用戶外堆制方式，堆體為底部直徑1 m、高0.7 m的圓錐形。油菜秸稈切成3～5 cm的碎片，將豬糞與秸稈按3∶1的質量混合，用麩皮調節(jié)C/N為25%左右，含水量控制在50%～70%。堆肥前，先在地面上鋪一層塑料，將豬糞、秸稈混勻，然后成堆，再用塑料布遮雨，便于翻堆。

1.4 測溫方法

堆肥時間為2020年6月1日至7月20日。每天上午9：00、下午16：00用TP300溫度計從堆體中上部分(堆體距地面垂直距離60 cm左右處)的不同方向測溫5次，取上午和下午溫度的平均值作為當日的堆體溫度。試驗中溫度可劃分為四個階段：由堆肥初期的常溫上升至50 ℃為升溫階段，溫度持續(xù)在50～70 ℃為高溫階段，隨后從高溫逐漸下降至40 ℃為降溫階段，溫度繼續(xù)下降至穩(wěn)定為腐熟階段。

1.5 采樣時間及方法

自堆肥開始后的第1、4、8、12、17、21、25、29、34、38、42、51天進行取樣，方法如下：在離地面40～50 cm處，從3個方向的不同縱切面上進行取樣，取樣深度為20～30 cm。樣品混勻后分成2份：1份用于細菌數量測定(樣品暫時保存于4 ℃冰箱，在24 h內進行試驗)，另1份用于測定其他指標。

1.6 可培養(yǎng)細菌的分離及純化

采用稀釋平板涂布法進行細菌的分離。具體方法為取1 g新鮮樣品放入裝有99 mL滅菌水的三角瓶(已滅菌)中，封口。在25 ℃、120 r/min條件下振蕩30 min，用已滅菌的紗布過濾得到濾液，并依次稀釋至10-6，取10-4、10-5、10-6均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)24 h。根據菌落形態(tài)初步統計固體LB培養(yǎng)基中所有細菌的菌落數，乘以水樣的稀釋倍數即為細菌總數。采用平板劃線分離法在固體LB培養(yǎng)基上將不同的菌落進行純化，純化后的細菌接種到斜面固體LB培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)，保存。優(yōu)勢菌按照農澤梅等[16]的方法進行確定。

1.7 可培養(yǎng)細菌分子鑒定

(1)菌株基因組DNA的提取。用接種環(huán)蘸取經純化的菌落放入液體LB培養(yǎng)基中，35 ℃、120 r/min條件下振蕩，至培養(yǎng)基由澄清變?yōu)闇啙?，制備的菌液用于提取細菌的DNA。采用Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒(編號：B518255-0050)提取菌株DNA，用16S rDNA的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)進行擴增。PCR擴增條件：模板DNA 1 μL，上、下游引物各2 μL(濃度10 μmol/L)，2X SanTaq PCR Mix 25 μL，ddH2O 20 μL；反應程序：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，57 ℃、1 min，72 ℃、1.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃、15 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，將PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

(2)細菌16S rDNA序列分析。將測序所得的序列用Contig Express軟件做序列拼接，在NCBI網站上進行比對，下載同源性高的序列及模式菌株的序列，選用MEGA 7.0軟件上的Clustal W功能進行序列比對，用鄰接法(NJ)構建系統發(fā)育樹，bootstrap值設為1 000。

1.8 數據分析

采用Excel 2019對數據進行整理，采用SPSS 26進行數據統計分析，試驗數據以平均值±標準誤差表示，采用單因素ANOVA檢驗對試驗結果進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 堆制過程溫度的變化

由圖1可知，隨著堆肥時間的延長，堆體溫度整體趨勢表現為先升高后不斷下降并趨于穩(wěn)定。1～2 d為升溫階段，該階段隨著堆肥時間延長，溫度不斷上升，第2天溫度升至51.5 ℃。3～27 d為高溫階段，其中3～10 d為55 ℃以上的高溫持續(xù)期；在發(fā)酵第8天溫度達到最高，為68.0 ℃；第11天溫度降低至55 ℃以下；第16天溫度又升高至55 ℃以上，并維持了11 d，但此階段最高溫度(66.4 ℃)低于第8天的溫度(68.0 ℃)。28～40 d為降溫階段，溫度降低至55 ℃以下，在40～55 ℃維持了12 d。41～47 d為腐熟階段，溫度降低至40 ℃以下，并逐漸穩(wěn)定。在豬糞與秸稈的自然堆制發(fā)酵過程中，堆肥溫度達50～55 ℃超過5 d，符合GB 7959—2012《糞便無害化衛(wèi)生要求》[17]。

圖1 堆制過程中溫度的變化

2.2 堆制過程可培養(yǎng)細菌物種數和菌落數的變化

由表1可看出，隨著堆肥時間的延長，細菌物種數先減少后增加再減少并趨于穩(wěn)定，細菌菌落數先增加后逐漸減少。升溫階段中，堆肥第1天的樣品中細菌物種數11種、菌落數6.30×107CFU/g。高溫階段中，第4天細菌菌落數迅速升高，為23.16×107CFU/g，且顯著高于其他時間段(P<0.05)，之后堆體中細菌菌落數逐漸減少(第12天除外)。降溫階段和腐熟階段中，隨著堆肥時間的延長，細菌菌落數逐漸趨于穩(wěn)定，但在第51天細菌菌落數增加，為2.08×107CFU/g。整個堆肥過程中，第1天和第8天細菌物種數最多，第4天細菌菌落數最多。第8天后，隨著堆肥時間的延長，物種數逐漸減少并趨于穩(wěn)定。由此可知，隨著堆肥時間及溫度的變化，堆體細菌菌落數和物種數逐漸減少。

表1 堆制過程中細菌物種數和細菌菌落數

2.3 堆制過程可培養(yǎng)細菌的序列分析

在堆體發(fā)酵過程中，共篩出細菌菌株30株，有9株菌株的16S rDNA PCR擴增結果無法用于測序和鑒定微生物所屬種類，因此對21株細菌進行了測序。菌株的序列分析結果如表2所示，可以看出除菌株DF200828和DF200104的相似度低于98%外，其余菌株與參比菌株的相似度和完整性高達98%及以上。

表2 菌株BLAST結果

2.4 堆制過程可培養(yǎng)細菌的群落特征分析

在堆體發(fā)酵過程中，共篩出細菌菌株30株，分離頻率高于20%的菌株如表3所示，可以看出分離頻率較高(50%及以上)和相對多度較高(10%以上)的菌株均是Stenotrophomonassp.、Bacillusvelezensis、Salmonellaenterica，其中Bacillusvelezensis的相對多度占42.31%，是所有可培養(yǎng)細菌中的最大優(yōu)勢菌；Stenotrophomonassp.為第二大優(yōu)勢菌，占20.76 %;Salmonellaenterica為第三大優(yōu)勢菌，占13.84%；其余菌株均為非優(yōu)勢菌。

表3 堆肥中細菌的分離頻率及相對多度

2.5 堆制過程優(yōu)勢菌菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色鑒定

在油菜秸稈與豬糞自然堆肥發(fā)酵過程中，共篩出可培養(yǎng)細菌菌株30株，其中編號為DF200114、DF200102、DF200107的3株菌為可培養(yǎng)細菌中的優(yōu)勢菌。DF200114的菌株菌落細小，呈土黃色，較透明，有光澤，易于培養(yǎng)基脫離，革蘭氏染色為陰性的桿狀細菌(圖2a)；DF200102的菌株菌落光滑、細小，稍透明，呈淺黃色，較濕潤，易挑起，革蘭氏染色為陽性的桿狀細菌(圖2b)；DF200107的菌株菌落邊緣稍透明，較濕潤，淡黃色，革蘭氏染色為陰性的桿狀細菌(圖2c)。

圖2 優(yōu)勢細菌菌株菌落形態(tài)特征照片和革蘭氏染色鏡檢結果(×1 000)

2.6 系統發(fā)育樹的構建及分析

對測序得到的21個菌株進行系統發(fā)育樹的構建，從圖3可以看出，這21個菌株隸屬于8個屬，分別為Bacillus、Lysinibacillus、Sphingobacterium、Comamonas、Stenotrophomonas、Acinetobacter、Salmonella、Escherichia。本研究中編號為DF200523的菌株與Genbank中編號為Bacillussp.strain 201705CJKOP-15的菌株單獨聚為1枝，兩者的親緣關系非常近，支持率達100%，初步鑒定為芽孢桿菌屬；DF200827、DF201033、DF201036也鑒定為芽孢桿菌屬。其中，DF200114鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，DF201035為解淀粉芽孢桿菌，DF200312為枯草芽孢桿菌，DF200418、DF200524為副地衣芽孢桿菌。DF200217鑒定為克氏單胞菌，DF200519為不動桿菌，DF200107為傷寒沙門氏菌。DF200104、DF200105、DF200115鑒定為大腸桿菌屬。

圖3 系統發(fā)育樹

3 討論與結論

堆肥過程是一個由微生物主導的生物學過程。在堆肥發(fā)酵過程中，堆體溫度的上升是微生物代謝產熱積累的結果，反映了微生物代謝強度和堆肥物質轉化速度[18]，細菌是整個堆肥過程中最普遍、數量最多的微生物。本研究在高寒地區(qū)油菜秸稈與豬糞自然堆肥發(fā)酵過程中得出，發(fā)酵初期可培養(yǎng)細菌物種數有11種、菌落數為6.30×107CFU/g，之后溫度由第2天的51.5 ℃升高到第4天的66.1 ℃，可培養(yǎng)細菌菌落數迅速增加，這與王瑤等[19]研究發(fā)現在豬糞堆肥試驗中堆體內可培養(yǎng)細菌菌落數隨著堆體溫度升高而迅速增加的結果一致。升溫階段中嗜溫性微生物利用可溶性和易降解性有機物作為營養(yǎng)和能量來源，迅速增殖；高溫時，隨著堆肥時間延長，溫度不斷升高，糞便中的大多數病原微生物被殺滅，堆體中可培養(yǎng)細菌菌落數下降明顯；第28天后，堆肥進入降溫期，溫度逐漸降低并趨于穩(wěn)定，細菌種群結構基本保持穩(wěn)定，可培養(yǎng)細菌菌落數也逐漸趨于穩(wěn)定。這與王瑤等[19]在豬糞堆肥研究中發(fā)現，可培養(yǎng)細菌菌落數隨著堆肥時間延長和溫度變化先增加后減少的結果一致；與劉有勝等[20]在城市餐廚垃圾堆肥研究中發(fā)現堆肥升溫期細菌種群豐富，高溫期減少，降溫期基本保持穩(wěn)定的結果一致。在整個自然堆肥發(fā)酵過程中，可培養(yǎng)細菌的菌落數與溫度有相關性，可培養(yǎng)細菌菌落數隨著溫度的升高而增加，隨著溫度的降低而減少，這與敖靜等[21]在雞糞堆肥研究中發(fā)現，可培養(yǎng)細菌菌落數的變化趨勢與堆體溫度變化趨勢相近的研究結果一致。由此可見，在高寒地區(qū)自然堆肥發(fā)酵過程中，可培養(yǎng)細菌菌落數與堆體溫度之間的相關關系和其他地區(qū)相一致。

本文在油菜秸稈與豬糞自然堆肥過程中得到，芽孢桿菌屬的菌株優(yōu)勢度最高，這與李敬波[22]在大連地區(qū)牛糞堆肥試驗中得出的研究結果相一致。芽孢桿菌能夠生成很厚的孢子壁，可以抵抗高溫，極易成為中高溫階段的優(yōu)勢菌。本研究中芽孢桿菌屬的貝萊斯芽孢桿菌的優(yōu)勢度最高，達到了42.31%。李玥等[23]從雞糞堆肥中篩選出了貝萊斯芽孢桿菌，李曉宇等[24]在大連地區(qū)從牛糞、玉米秸稈和牛屠宰廢棄物的堆肥中也篩選出此菌，本研究也表明貝萊斯芽孢桿菌容易從高寒地區(qū)堆肥中分離得到。此外，寡養(yǎng)單胞菌屬優(yōu)勢度也較高，相對多度達到了20.76%，目前，此菌從植物根際、污水、污泥等環(huán)境中分離出得較多，從豬糞堆肥中篩選出的還未見報道。

綜上可知，在高寒地區(qū)油菜秸稈與豬糞自然堆肥過程中，隨著溫度的升高，可培養(yǎng)細菌菌落數增加；在降溫階段，可培養(yǎng)細菌菌落數減少，物種數也減少并趨于穩(wěn)定。同時，共分離篩選出可培養(yǎng)細菌菌株30株，對21株菌株進行鑒定，系統發(fā)育樹結果顯示此21株菌株隸屬于8個屬，其中菌株Bacillusvelezensis、Stenotrophomonassp.、Salmonellaenterica為堆肥發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌。