馬新豫，關(guān)玲霞，張國坡

恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流是臨床治療缺血性心臟病的常用手段，但血流灌注后易誘發(fā)新的心臟損傷，這一現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。MIRI中最先受累部位是心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是觸發(fā)MIRI的重要因素[2-3]。因此，尋找有效減輕和改善CMECs損傷的措施對治療MIRI具有重要意義。延胡索乙素是中草藥延胡索的有效成分之一，多用于臨床鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜[4]。有研究指出，延胡索乙素可通過抑制氧化應(yīng)激和鈣敏感受體/磷脂酶C-γ1途徑減輕大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)[5]，但其對CMECs損傷的作用報(bào)道鮮見。既往研究顯示，激活蛋白激酶B(Akt)/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路是延胡索乙素發(fā)揮保護(hù)MIRI的重要機(jī)制[6]；而Akt/eNOS通路活化異常與CMECs損傷密切相關(guān)[7]。本研究旨在探討胡索乙素對缺氧(hypoxia，H)/復(fù)氧(reoxygenation，R)所致CMECs損傷的影響，為延胡索乙素保護(hù)MIRI提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 細(xì)胞：大鼠CMECs，購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)：CP-R135，使用專用培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

試劑：CMECs專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)：CM-R135)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒和大鼠白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)：BC0685，BC0170，BC0025，SEKR-0005，SEKR-0002，SEKR-0009)；Akt抑制劑LY294002(北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：V1201)，Akt、磷酸化(phosphorylated，p)-Akt、eNOS、p-eNOS、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、活化的Caspase-3(cleaved-Caspase 3，C-Caspase-3)抗體(中國Abcam，貨號(hào)：ab38449，ab8933，ab76198，ab76199，ab32124，ab32503，ab184787，ab214430)。

儀器：細(xì)胞缺氧實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(北京世聯(lián)博研科技有限公司，型號(hào)：MIC-101)，酶標(biāo)儀(山東競道光電科技有限公司，型號(hào)：JD-SY96A)，流式細(xì)胞儀(北京眾力挽生物科技有限公司，型號(hào)：FACSCanto Ⅱ)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及H/R模型構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[8]構(gòu)建H/R模型：以5% CO2和95% N2預(yù)處理無血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，放入缺氧箱內(nèi)缺氧處理3 h后，再常規(guī)復(fù)氧處理2 h。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8(CCK-8)法檢測大鼠CMECs活力[9]將對數(shù)生長期的大鼠CMECs以每孔2×104個(gè)細(xì)胞密度接種至96孔細(xì)胞板上，加入100 μL終濃度為0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL和320 μg/mL的延胡索乙素；孵育48 h后，加入10 μL CCK-8試劑孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測細(xì)胞吸光度(A)值，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A-調(diào)零組A)/(對照組A-調(diào)零組A)×100%。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為7組。正常對照組：正常培養(yǎng)不做處理；模型組：構(gòu)建H/R模型；溶媒對照組：以溶媒二甲基亞砜(DMSO)預(yù)處理2 h后行H/R處理；延胡索乙素低劑量組：以20 μg/mL延胡索乙素預(yù)處理2 h后行H/R處理；延胡索乙素中劑量組：以40 μg/mL延胡索乙素預(yù)處理2 h后行H/R處理；延胡索乙素高劑量組：以80 μg/mL延胡索乙素預(yù)處理2 h后行H/R處理；延胡索乙素高劑量+Akt抑制劑組：以80 μg/mL延胡索乙素和20 μmol/L LY294002預(yù)處理2 h后行H/R處理。

1.5 檢測大鼠CMECs LDH、SOD、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及Caspase-3活性 收集1.4處理結(jié)束后的各組大鼠CMECs及其上清液，分別參照各試劑盒說明書檢測各組大鼠CMECs LDH、SOD、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及Caspase-3活性。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠CMECs凋亡率 收集1.4處理結(jié)束后的各組大鼠CMECs，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液200 μL于EP管中，避光條件下加入5 μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ-FITC)、5 μL碘化丙啶(PI)溶液室溫孵育15 min；補(bǔ)加200 μL上樣緩沖液后，上流式細(xì)胞儀檢測各組大鼠CMECs凋亡率[10]。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測大鼠CMECs中Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3蛋白表達(dá) 收集1.4中處理結(jié)束后的各組大鼠CMECs，加入裂解液提取總蛋白后，參照二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒說明書檢測蛋白濃度。將變性蛋白樣品按照每孔60 μg行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；待電泳分離結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上；采用5%脫脂奶粉封閉1 h后，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3特異性一抗在4 ℃下孵育過夜；次日，以二抗孵育2 h后，化學(xué)發(fā)光法暗室內(nèi)顯影曝光；運(yùn)用Quantity One軟件分析各組大鼠CMECs中Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平，其中GAPDH為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度延胡索乙素對大鼠CMECs存活率的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示：經(jīng)5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL延胡索乙素作用后CMECs存活率同對照0 μg/mL比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)160 μg/mL、320 μg/mL延胡索乙素作用后CMECs存活率較對照0 μg/mL明顯降低(P<0.05)。詳見圖1。與正常對照組比較，模型組CMECs存活率明顯降低(P<0.05)，而溶媒對照組和模型組CMECs存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與溶媒對照組比較，延胡索乙素作用后CMECs存活率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈先升高后降低的趨勢；其中，當(dāng)延胡索乙素濃度在80 μg/mL時(shí)，CMECs存活率最高，40 μg/mL和20 μg/mL次之。詳見圖2。因此，選取20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL延胡索乙素作為低劑量、中劑量、高劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。詳見圖2。

與0 μg/mL比較，＊ P<0.05。

模型組與正常對照組比較，＊P<0.05；延胡索乙素各劑量組與溶媒對照組比較，#P<0.05。

2.2 延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs LDH、SOD和MDA水平的影響 與正常對照組比較，模型組CMECs LDH和MDA水平明顯升高(P<0.05)，且SOD水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，溶媒對照組CMECs LDH、SOD和MDA水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與溶媒對照組比較，延胡索乙素作用后CMECs LDH和MDA水平明顯降低(P<0.05)，SOD水平明顯升高(P<0.05)，且呈延胡索乙素劑量依賴性；給予LY294002作用后，高劑量延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs LDH、MDA和SOD水平的影響明顯受到抑制(P<0.05)。詳見表1。

表1 延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs LDH、SOD和MDA水平的影響(±s，n=9)

2.3 延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，溶媒對照組大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與溶媒對照組比較，給予低劑量、中劑量和高劑量延胡索乙素作用后大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平呈劑量依賴性降低(P<0.05)；而給予LY294002作用后，高劑量延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平的抑制作用明顯削弱(P<0.05)。詳見表2。

表2 延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響(±s，n=9) 單位：pg/mL

2.4 延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs凋亡的影響 模型組CMECs凋亡率和Caspase-3活性較正常對照組明顯升高(P<0.05)；溶媒對照組和模型組CMECs凋亡率和Caspase-3活性比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給予低劑量、中劑量、高劑量延胡索乙素作用后，CMECs凋亡率和Caspase-3活性呈劑量依賴性降低；而給予LY294002作用后，高劑量延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs凋亡率和Caspase-3活性的抑制作用明顯減弱(P<0.05)。詳見圖3、表3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組大鼠CMECs凋亡情況

表3 延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs凋亡率及Caspase-3活性的影響(±s，n=9)

2.5 延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs中Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax、Caspase-3、C-Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組比較，模型組CMECs中p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低，且Bax、C-Caspase-3/Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；而溶媒對照組和模型組之間上述指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與溶媒對照組比較，低劑量、中劑量、高劑量延胡索乙素作用后大鼠CMECs中p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性；中劑量、高劑量延胡索乙素作用后C-Caspase-3/Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；給予LY294002作用后，高劑量延胡索乙素對H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs中p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS、Bcl-2蛋白表達(dá)水平和Bax、C-Caspase-3/Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響得到明顯逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。詳見圖4。

模型組與正常對照組比較，＊ P<0.05；延胡索乙素各劑量組與溶媒對照組比較，#P<0.05；延胡索乙素高劑量+Akt抑制劑組與延胡索乙素高劑量組比較，△ P<0.05。

3 討 論

微血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持微血管通透性和內(nèi)外物質(zhì)能量交換等過程中發(fā)揮著重要作用[11]；CMECs受損所致的功能異常與MIRI發(fā)生密切相關(guān)[3]。研究顯示，MIRI發(fā)生與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[12]；在炎癥和氧化應(yīng)激等刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞可釋放黏附分子、趨化因子和細(xì)胞因子等，引起血管收縮、白細(xì)胞聚集、血栓形成阻礙復(fù)流，進(jìn)而加重MIRI[2，13]；另外，MIRI可產(chǎn)生大量的氧自由基，而氧自由基的過度積累可增加線粒體膜的通透性，促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，引起細(xì)胞凋亡[3]。本研究中，H/R誘導(dǎo)下，大鼠CMECs氧化應(yīng)激指標(biāo)LDH、MDA水平和促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及細(xì)胞凋亡率、促凋亡因子Caspase-3活性、Bax蛋白表達(dá)水平均明顯升高，而抗氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯降低。該結(jié)果與Chen等[14]和Zhang等[15]研究中H/R刺激可引起CMECs炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡的結(jié)果相一致。結(jié)果表明，H/R可誘導(dǎo)CMECs損傷。

延胡索乙素因?qū)π哪X缺血再灌注損傷有較大的改善作用而備受關(guān)注[16]。近年來，有研究報(bào)道，延胡索乙素可能通過抗氧化、抗炎和抗凋亡機(jī)制來保護(hù)氯胺酮誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[17]；延胡索乙素對大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞有依賴性和非依賴性血管舒張作用，可通過Akt/eNOS信號(hào)通路等途徑改善血管功能障礙[18]。本研究以20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL延胡索乙素作用后發(fā)現(xiàn)，H/R誘導(dǎo)的CMECs LDH、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平以及細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性和C-Caspase-3/Caspase-3蛋白水平、Bax蛋白表達(dá)水平均明顯降低，而SOD水平和Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯升高。提示延胡索乙素可抑制H/R誘導(dǎo)的CMECs氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和凋亡保護(hù)CMECs損傷。

Akt是參與該通路的關(guān)鍵因子，激活后可促進(jìn)包括eNOS在內(nèi)的多種靶蛋白的表達(dá)，在細(xì)胞生長、代謝和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[19]。Akt/eNOS信號(hào)通路活化異常與MIRI發(fā)生密切相關(guān)，一直是MIRI研究的熱點(diǎn)[20]。Akt/eNOS信號(hào)通路還可調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和凋亡參與H/R誘導(dǎo)的CMECs損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R誘導(dǎo)下，CMECs中Akt、eNOS磷酸化水平降低，而給予20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL延胡索乙素作用后，CMECs中Akt、eNOS磷酸化水平明顯升高；另外，給予Akt通路抑制劑LY294002作用后，80 μg/mL延胡索乙素對CMECs中Akt、eNOS磷酸化水平以及對CMECs氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡的影響明顯逆轉(zhuǎn)。提示延胡索乙素可通過激活A(yù)kt/eNOS信號(hào)通路抑制H/R誘導(dǎo)的CMECs氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和凋亡。

綜上所述，延胡索乙素可通過抑制炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)和減輕細(xì)胞凋亡保護(hù)H/R誘導(dǎo)的大鼠CMECs損傷，其作用機(jī)制可能與激活A(yù)kt/eNOS通路有關(guān)；然而，延胡索乙素保護(hù)CMECs損傷的作用機(jī)制是否還與其他通路或基因的調(diào)控有關(guān)，有待后續(xù)進(jìn)一步探討。