田陽陽，王軍偉，胡 陽，曹洋川，楊進(jìn)飛，朱學(xué)偉，楊毓玲，劉迎龍

[1.紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.玉溪市煙草公司新平縣分公司，云南 玉溪 653100]

中國(guó)是世界上煙葉生產(chǎn)第一大國(guó)，煙草行業(yè)在經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)中具有獨(dú)特地位，是國(guó)家經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。煙草的種植范圍極廣，從北緯55°到南緯40°之間的南北各地區(qū)均有栽培[2]。然而，由煙草疫霉（Phytophthora nicotianaeBreda de Haan）引起的煙草黑脛病是一種毀滅性的土傳病害，自1896 年在印度尼西亞的爪哇首次發(fā)現(xiàn)后在各地廣泛傳播，發(fā)病率高、分布范圍廣，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。煙草黑脛病菌有無性和有性階段，在侵染植物的過程中，會(huì)形成孢子囊、游動(dòng)孢子、卵孢子和厚垣孢子等多種形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，種群大小、基因交流、變異、生殖方式和環(huán)境選擇作用等諸多因素均能影響微生物群體遺傳結(jié)構(gòu)的演化[6]。因此，不同菌株在生物學(xué)性狀及分子水平上表現(xiàn)出特征性差異，展現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，但同時(shí)也使病害越發(fā)嚴(yán)重，難以控制[7]。

近年來，云南省煙葉生產(chǎn)發(fā)展迅速，已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收致富的重要途徑。該省玉溪市是紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司的核心采購(gòu)區(qū)域之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)在集團(tuán)卷煙配方中占有重要位置。然而，隨著種植面積擴(kuò)大，煙區(qū)地塊難以實(shí)現(xiàn)輪作，推廣品種抗病性較差，例如KRK26 和紅花大金元等品種易感染黑脛病。隨著該類感病品種的推廣，黑脛病發(fā)生面積和嚴(yán)重程度加大。因此，對(duì)煙草黑脛病的防治工作一直是煙草生產(chǎn)的重點(diǎn)。病菌群體的地理分布特征既能反映群體的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)，也能反映病菌群體的演化規(guī)律[8]。為了探究玉溪市煙區(qū)煙草黑脛病菌的遺傳差異及群體演化規(guī)律，研究以玉溪市新平縣與澄江市煙區(qū)為取樣點(diǎn)，通過RAPD 標(biāo)記技術(shù)，從DNA 分子水平探討云南省玉溪市煙草黑脛病菌群體的遺傳多樣性，以期為玉溪市煙草黑脛病綜合防治提供一定的理論依據(jù)與研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試的164 個(gè)煙草疫霉菌株分離自云南省玉溪市植煙區(qū)土壤及煙草黑脛病標(biāo)本，在燕麥培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)備用，菌株來源及分布見表1。

表1 煙草疫霉的地理來源及菌株數(shù)量

1.1.2 主要試劑和儀器 RAPD 隨機(jī)引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；其他試劑如PCR 相關(guān)試劑、5 000 DNA Marker、Agarose、CTAB、氯 仿、異戊醇、乙醇、異丙醇等均購(gòu)自Sigma 公司。主要儀器有：PCR 擴(kuò)增儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）、電泳儀（DYY6C，購(gòu)自北京六一廠）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（Biotop，220V，上海山富科學(xué)儀器有限公司）；核酸蛋白定量?jī)x（Nano Drop 2000，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 的提取 采用CTAB 法提取煙草疫霉DNA[9]，用核酸蛋白定量?jī)x（Nano Drop 2000）測(cè)定其OD260與OD280的比值。質(zhì)量較好的DNA 純度較高，蛋白質(zhì)含量較少，其OD260/OD280值介于1.8～2.0 之間[10]。將接近于該比值的DNA 樣品置于-20℃冰柜內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]，從已報(bào)道的煙草疫霉RAPD 隨機(jī)引物和上海捷瑞生物工程有限公司合成的2 000 個(gè)寡聚核苷酸隨機(jī)引物中篩選出擴(kuò)增譜帶多且清楚的6 條隨機(jī)引物，對(duì)供試菌株全基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和RAPD 分析。

1.2.3 擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系 （1）反應(yīng)體系（20 μL）：10×buffer 2 μL，1 U Taq 酶 0.2 μL，0.2 mmol/L dNTP 混合液 1.6 μL，0.5 μmol/L 的RAPD 引物 1 μL，菌絲DNA 模板0.5 μL，最后加ddH2O 補(bǔ)至20 μL，陰性對(duì)照為ddH2O。（2）反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；94℃變性1 min，38℃退火1 min，72℃延伸2 min，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min[12]。取10 μL PCR 產(chǎn)物與3 μL 含核酸染料（花青素）的Loading Buffer 混合均勻后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓設(shè)置為50 V，持續(xù)2～3 h，結(jié)果在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析方法 電泳圖譜中的每一條帶均為一個(gè)分子標(biāo)記，根據(jù)各分子標(biāo)記的遷移率及其有無轉(zhuǎn)化為二進(jìn)制數(shù)據(jù)，具體原則為：在重復(fù)擴(kuò)增中穩(wěn)定出現(xiàn)的帶無論強(qiáng)弱均記為1，無穩(wěn)定的帶記為0。相似系數(shù)的計(jì)算和聚類分析均由NTSYS 軟件完成，并采用UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）構(gòu)建遺傳系統(tǒng)樹狀圖譜[12]。

1.2.5 遺傳差異分析 根據(jù)遺傳系統(tǒng)樹狀圖譜以不同相似水平將供試菌株劃分為不同的遺傳相似組群，按地理來源、海拔高度、煙草品種等相關(guān)因素統(tǒng)計(jì)各組群的菌株數(shù)量，繪制圖表并分析供試菌株的遺傳差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD 引物篩選結(jié)果及多態(tài)性分析

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，篩選出6 條多態(tài)性較好的引物作為RAPD 擴(kuò)增引物，詳見表2。根據(jù)圖1 可知，6 條隨機(jī)引物共擴(kuò)增出了53 條DNA 條帶，平均每條引物擴(kuò)增出8.83 條DNA 條帶，所擴(kuò)增出的DNA 條帶大部分為多態(tài)性譜帶，多態(tài)率為71.70%。不同引物對(duì)供試菌株擴(kuò)增出的DNA 譜帶結(jié)果也不相同，條帶總數(shù)在6～10 條。以上結(jié)果表明，云南省玉溪市煙草黑脛病病菌存在較豐富的遺傳多樣性。

圖1 部分供試菌株的RAPD 擴(kuò)增圖譜

表2 6 條RAPD 供試引物擴(kuò)增譜帶數(shù)量

2.2 不同煙草疫霉菌株的聚類分析

利用NTSYS 軟件以UPGMA 對(duì)164 個(gè)菌株全基因組DNA 擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，在0.95 相似水平上每一支各取一株菌株構(gòu)建遺傳系統(tǒng)樹狀圖譜，如圖2 所示。根據(jù)不同相似水平可劃分為不同的遺傳相似組，例如在0.74 相似水平上可將164 個(gè)菌株劃分為4 個(gè)組群；在0.84 相似水平上可將其劃分為6 個(gè)組群；在0.94 相似水平上可將其劃分為12 個(gè)組群。其中，在0.84 相似水平上劃分的6 個(gè)組群中，Ⅰ組群的數(shù)量最多，為146 株，占89.02%，其他5 組總和僅占10.98%（表3）。

圖2 云南省玉溪市煙草疫霉菌株RAPD 聚類分析結(jié)果

2.3 煙草疫霉與地理來源、海拔高度、煙草品種關(guān)系的遺傳差異分析

根據(jù)0.84 相似水平將供試的164 個(gè)菌株劃分為Ⅰ～Ⅵ個(gè)組群（表3），按地理來源、海拔高度、煙草品種等相關(guān)因素統(tǒng)計(jì)不同組群的菌株數(shù)量，如圖3 所示，大多數(shù)煙草疫霉菌株聚集在Ⅰ組群；少量則分散于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ各組群內(nèi)。根據(jù)地理位置分析，各組群在玉溪市新平縣與澄江市境內(nèi)大致均勻分布；但從新平縣和澄江市不同海拔高度（1 694～1 970 m）來看，Ⅰ組群內(nèi)有較多菌株分布于低海拔地區(qū)，其余較高海拔地區(qū)無較明顯差異；對(duì)該地區(qū)品種分布與煙草疫霉遺傳差異分析可知，煙草品種KRK26 種植區(qū)有較多數(shù)量的Ⅰ組群煙草疫霉出現(xiàn)，而另外2 個(gè)主栽品種則相對(duì)較少，但云煙87 也多于K326。

表3 供試菌株在0.84 相似水平上的組群分布及數(shù)量

圖3 菌株與地理來源、海拔高度、煙草品種關(guān)系的遺傳差異

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

通過6 條具有多態(tài)性的RAPD 引物，隨機(jī)擴(kuò)增164 個(gè)煙草黑脛病菌菌株的DNA，對(duì)供試菌株進(jìn)行種群遺傳差異分析和基因型劃分研究，結(jié)果顯示，在0.84 相似水平上，這些菌株可分為6 個(gè)組，其中146個(gè)菌株聚集在Ⅰ組，占89.02%，其他5 組總和僅占10.98%。這表明新平縣和澄江市的煙草疫霉遺傳上具有高度同源性。分析該地區(qū)煙草疫霉遺傳分化差異發(fā)現(xiàn)，其群體基因型劃分與地理來源沒有直接關(guān)系，但與海拔高度、煙草品種分布存在一定關(guān)聯(lián)。該結(jié)論對(duì)玉溪煙區(qū)煙草黑脛病的防控具有重要的指導(dǎo)意義。

3.2 討 論

RAPD 技術(shù)自問世以來，因其成本較低，運(yùn)用范圍廣泛而得到快速發(fā)展。到目前為止已在物種多態(tài)性檢測(cè)、品種及親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜等多個(gè)方面得到應(yīng)用。如錢旎[7]和劉芳等[14]用RAPD 與McRAPD標(biāo)記技術(shù)，分析重慶和河南地區(qū)煙草黑脛病菌的生理小種和遺傳多樣性；劉曉俠等[15]通過RAPD 標(biāo)記和集團(tuán)分離分析法（BSA）篩選，找到了與煙草抗黑脛病基因Bs1（t）連鎖的RAPD 標(biāo)記OPB023000 和OPM112500，為該基因的進(jìn)一步研究利用以及煙草抗病品種的選育積累了基礎(chǔ)；Qamer 等[16]基于RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)東南亞地區(qū)的蜜蜂、美洲蜜蜂群體遺傳差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明，它們之間的遺傳變異水平較低，但也有較小程度的遷移存在，這一結(jié)論為保護(hù)該地區(qū)特有蜂種的生物多樣性提供了指導(dǎo)。

該研究運(yùn)用RAPD 技術(shù)對(duì)玉溪煙區(qū)的164 株煙草疫霉進(jìn)行種群遺傳差異分析，結(jié)果表明，玉溪新平縣和澄江市煙區(qū)中的煙草疫霉在遺傳上具有高度同源性，分化差異較小，遺傳變異并不明顯，這與付靜等[17]的研究結(jié)果相似。然而，同一地區(qū)也存在少量遺傳差異較明顯的菌株。通過分析這些差異較明顯的菌株與地理來源、品種等因素的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)，遺傳差異較大的供試菌株，其群體基因型劃分與地理來源沒有直接的關(guān)系，但與海拔高度、煙草品種分布有一定的關(guān)聯(lián)，這與前人的一些研究結(jié)果相類似[7,11]。

導(dǎo)致少數(shù)煙草疫霉分化差異較大的原因目前尚不清楚，但根據(jù)該研究結(jié)果并聯(lián)系生產(chǎn)實(shí)際可知，通過種苗或其他工具使內(nèi)部病菌頻繁交流可能是導(dǎo)致少數(shù)病菌分化差異較大的原因之一。在玉溪煙區(qū)的3 個(gè)主栽品種中，種植KRK26 這一品種的區(qū)域內(nèi)有較多數(shù)量的Ⅰ型煙草疫霉，而云煙87 和K326 品種中Ⅰ型煙草疫霉相對(duì)較少。這可能與品種之間的抗病性差異相關(guān)，該結(jié)果也說明不同煙草疫霉與其互作的煙草寄主之間存在一定聯(lián)系，這為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了警示，即煙草品種不能單一化種植。若品種單一，當(dāng)感病寄主遇到強(qiáng)致病性菌株時(shí)往往無法抵御，造成大面積的病害流行，導(dǎo)致大量減產(chǎn)甚至絕收。此外，通過基因型分類與生理小種鑒定相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)快速鑒定植煙區(qū)不同的煙草疫霉生理小種，對(duì)后續(xù)的品種布局和種植規(guī)劃具有重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義[14]。而氣象因素與煙草疫霉種群遺傳差異之間是否存在關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步深入研究。