丁燕玲,王鵬飛,楊朝云,張巖峰,周小南,史遠剛,康曉龍

(寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021)

【研究意義】在肉牛產(chǎn)業(yè)中，生長性狀是重要的經(jīng)濟性狀，直接影響?zhàn)B殖經(jīng)濟效益。生長性狀屬于數(shù)量性狀，受飼料類型、飼養(yǎng)管理、溫度等環(huán)境因素影響，但遺傳因素起最重要作用。動物個體生長性狀的最終表現(xiàn)型主要受到與其相關的基因影響[1]。因此，利用分子標記輔助育種技術鑒定出與生長性狀相關的分子標記，可節(jié)約養(yǎng)殖場生產(chǎn)成本，為優(yōu)良性狀的選育提供遺傳素材?！厩叭搜芯窟M展】胰島素生長因子(Insulin-like Growth Factors，IGFs)對內(nèi)分泌系統(tǒng)起主要調控作用，最初被描述為生長激素的體液介質，這個信號網(wǎng)絡參與調節(jié)人及動物的發(fā)育[2]、能量平衡及細胞功能[3-4]，在葡萄糖、蛋白質和脂質代謝中發(fā)揮重要作用[5]。構成IGF系統(tǒng)的蛋白質IGF1/IGF2、表面受體和IGF結合蛋白通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(Serine/threonine-protein kinase 1，AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)調節(jié)與生長發(fā)育相關的功能[6]。研究發(fā)現(xiàn)IGF家族成員之一的胰島素樣生長因子2(Insulin-like Growth Factor 2，IGF2)在肌肉細胞發(fā)育中起主要作用，其作用機制為IGF2作為生長激素發(fā)揮作用的中間信使，即生長激素首先作用于IGF2基因，再由IGF2基因作用于靶器官，進而發(fā)揮促進機體生長發(fā)育的作用[7]。Van等[8]研究發(fā)現(xiàn)豬的IGF2基因內(nèi)含子3-G3072A突變是影響肌肉生長和脂肪沉積的關鍵數(shù)量性狀位點；Yan等[9]研究認為IGF2基因中2個SNP(g.281766 G>A 和 g.291322 C>T)與德州母驢的體長和臀高顯著相關(P<0.05)；Huang等[10]研究認為IGF2基因SNP1(內(nèi)含子8-G17A)、SNP2(內(nèi)含子8-C220T)、SNP3(內(nèi)含子8-A221G)及SNP4(內(nèi)含子8-A1393G)4個SNPs位點突變與秦川牛體重、體長、胸圍、胸深顯著相關(P<0.05)；國外肉牛品種中，IGF2基因SNPs位點c.-292C>T、g.73A>g以及g.751A>g與西門塔爾牛胴體重和眼肌面積顯著相關(P<0.05)，且IGF2:c.-292C>T單核苷酸多態(tài)性與西門塔爾公牛群體中脂肪百分比的影響有關[11]?！颈狙芯壳腥朦c】大量的研究表明IGF2基因在不同物種中SNP位點的突變與脂肪沉積，體重、體長、胸深等體尺性狀密切相關，說明IGF2基因對家畜生長性狀和肌肉生長發(fā)育具有重要作用?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用PCR-RFLPs技術探究IGF2第2外顯子多態(tài)位點與秦川牛、西門塔爾牛、安格斯牛及新疆褐牛四種品種牛群體的多態(tài)性及與生長性狀的相關性，以期為肉牛的育種和遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及DNA提取

隨機抽取寧夏地區(qū)某牛場月齡相近(12月齡左右)的4個肉牛品種共91頭(秦川牛29牛，安格斯牛15頭，西門塔爾牛28頭，新疆褐牛19牛)，其中秦川牛分別在12、18、24及30月齡測定收集了體重、體尺相關數(shù)據(jù)，依據(jù)標準方法測定牛體重、體斜長、體高、胸圍、管圍、腰角寬等生長性狀[12]。每頭牛尾根采血3～6 mL放入EDTA真空采血管中，搖勻后迅速放入冰盒中帶回試驗室，-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。牛血液基因組 DNA提取利用天根生化科技(北京)有限公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)。

1.2 引物設計與PCR反應體系

本試驗采用PCR-RFLPs技術，參考Goodall等[13]設計的引物，擴增IGF2基因第2外顯子全長217 bp，然后用限制性內(nèi)切酶BsrⅠ(NEB，北京)酶切。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息為：上游，5′-CCTCAGCCTCATCCCCTCCTTTGC-3′；下游，5′-CTGTGCTCTATTTGCTGTGTTGTCT-3′。PCR擴增體系為20 μL：其中2×Taq酶(5 U/μL)10 μL、血液DNA模板(50 ng/μL)2.5 μL、上下游引物各(10 pmol/μL)0.4 μL、ddH2O 6.7 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s，63.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；4 ℃保存，共40個循環(huán)。

1.3 酶切

酶切總體積為20 μL，其中PCR擴增產(chǎn)物6 μL，限制性內(nèi)切酶BsrⅠ(5 U/μL)0.4 μL、10×Buffer 2 μL、剩余體積加ddH2O 11.6 μL補充，混勻后，根據(jù)說明書指定的條件于65 ℃酶切30 min，待酶切完全后，用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2018軟件統(tǒng)計各基因型在群體中的基因型頻率和等位基因頻率，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗及多態(tài)信息含量(PIC)、群體純合度(Ho)、群體雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)分析。采用SAS統(tǒng)計軟件的一般線性模型(GLM)分析基因型效應對生長性狀的影響，采用固定模型：Yij=u+Gi+Eij，式中Yij為個體表型記錄，u為群體均值，Gi為標記基因型效應，Eij為隨機誤差。

2 結果與分析

2.1 IGF2基因的PCR-RFLPs結果

對不同群體牛IGF2基因第2外顯子進行PCR擴增，擴增片段長度為217 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。擴增條帶明亮清晰，目標片段大小與預期結果一致，可用于PCR-RFLPs分析。

M:50 bp DNA ladder；1～6: PCR擴增產(chǎn)物

在IGF2基因第2外顯子的185 bp 處, 有一個固有的BsrⅠ酶切位點，突變型在150 bp處又有一個酶切位點，從而得到3種基因型，分別為AA型、BB型、AB型。如圖2所示，用限制性內(nèi)切酶BsrⅠ對擴增產(chǎn)物進行酶切，4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)AA基因型包括185、32 bp 2個片段，BB基因型包括150、35、32 bp 3個片段，AB基因型具有185、150、35、32 bp 4個片段，酶切產(chǎn)物電泳條帶清晰，片段大小與預期一致。

M: 50 bp DNA ladder; AA、AB和BB為不同的基因型

2.2 不同肉牛群體IGF2基因遺傳多態(tài)性分析

根據(jù)PCR-RFLPs電泳圖譜進行基因分型，并計算各基因型頻率和等位基因頻率(表1)。結果顯示：秦川牛中AA基因型頻率為0.414，AB基因型頻率為0.517，BB基因型頻率為0.069，A等位基因頻率為0.672，B等位基因頻率為0.328；西門塔爾牛AA基因型頻率(0.500)高于AB、BB基因型頻率(0.464、0.036)，A等位基因頻率為0.732，B等位基因頻率為0.268；安格斯牛AA、AB、BB基因型頻率分別為0.600、0.333和0.067，A等位基因頻率為0.767，B等位基因頻率為0.233；新疆褐牛AA、AB、BB基因型頻率分別為0.421、0.474、0.105，A等位基因頻率為0.658，B等位基因頻率為0.342；在所有檢測品種中，A為優(yōu)勢等位基因。χ2檢驗(表2)表明，在研究的所有牛品種中，IGF2基因第2外顯子SNP位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，該位點在秦川牛、西門塔爾牛及安格斯牛中的純合度高(分別為0.559、0.608、0.643)，雜合度低(分別為0.441、0.392、0.357)，而在新疆褐牛中則相反，其純合度低(0.450)，雜合度高(0.550)；IGF2基因第2外顯子SNP位點的PIC分別為：秦川牛0.344、西門塔爾牛0.315、安格斯牛0.294、新疆褐牛0.449，4個群體都具有多態(tài)性且均屬于中度多態(tài)(0.25

表1 不同牛品種IGF2基因頻率

表2 不同牛品種IGF2基因群體遺傳參數(shù)

2.3 IGF2基因SNP位點多態(tài)性與生長性狀的相關性分析

秦川牛IGF2基因第2外顯子多態(tài)性與生長性能相關性分析表明(表3)，AA、AB型個體12月齡體斜長顯著高于BB型(P<0.05)，其他月齡體斜長無顯著影響(P>0.05)；12、18月齡AA、AB型個體胸圍顯著優(yōu)于BB型個體(P<0.05)，其余各項指標基因型間差異不顯著(P>0.05)。

表3 秦川牛IGF2基因第2外顯子SNP多態(tài)性與生長性狀相關性分析

為了進一步探究不同品種間IGF2基因第2外顯子對不同基因型個體生長性狀的相關性，利用最小二乘法對IGF2基因第2外顯子不同基因型與不同品種生長指標進行顯著性檢驗。如表4所示，IGF2基因第2外顯子PCR-RFLPs多態(tài)位點對秦川牛和安格斯牛胸圍、西門塔爾牛和新疆褐牛體斜長以及秦川牛和西門塔爾牛尻寬有顯著影響(P<0.05)，其中秦川牛AA、AB基因型個體體重、體高、管圍及尻寬顯著優(yōu)于其余品種BB型個體(P<0.05)；AA、AB型個體秦川牛和安格斯牛的胸圍顯著優(yōu)于西門塔爾牛及新疆褐牛(P<0.05)；而腰角寬和胸深在各品種間差異不顯著(P>0.05)，說明該位點在肉用牛品種間基因型分布存在顯著差異，即各個肉牛品種的選育程度不同。

表4 IGF2基因位點對五個品種牛不同基因型生長性狀差異性分析

3 討 論

IGF2基因參與調控膽固醇合成[14-15]、葡萄糖代謝[15]及體重的增長[16]，沉默IGF2基因能顯著減緩出生胎兒的生長速度[17]，且在2-型糖尿病患者中，IGF2基因的低表達與體重增加的風險有關，因此IGF2已經(jīng)成為研究人類2-型糖尿病及肥胖等代謝性疾病的重要候選基因之一[18]；成年轉基因小鼠肝臟中過表達IGF2基因可增加胰島素刺激的葡萄糖攝取，降低脂肪沉積[19]，該基因也可作為肌肉特異性增強子，通過雷帕霉素信號通路調節(jié)成肌細胞的增殖、分化、遷移等，最終影響肌肉生長發(fā)育[20]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因第2外顯子SNP位點與秦川牛、南陽牛、夏洛萊牛等部分生長性狀顯著相關[21]。因此，研究IGF2基因遺傳變異對肉牛生長發(fā)育的影響至關重要。

IGF2基因的多態(tài)性在不同畜禽中均有報道，如Wang等[22]發(fā)現(xiàn)IGF2基因第2外顯子存在G-C的突變，該SNP位點突變與雞生長性狀關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)AA基因型雞與BB基因型雞的3周齡體重、胸寬差異顯著(P<0.05)，BB基因型雞的腹部脂肪顯著高于AA基因型雞(P<0.05)；利用高分辨率溶解曲線(HRM)技術檢測90頭天祝白牦牛IGF2基因外顯子10的基因型，并對基因型與生長性狀進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)AA基因型在體重、體斜長、胸圍方面明顯高于BB基因型(P<0.05)[23]；Huang等[24]對秦川牛IGF2基因SNPs檢測及其與生長性狀相關性分析時，發(fā)現(xiàn)SNP1 AA(內(nèi)含子8 G17A)基因型個體的體重、體斜長及胸寬顯著高于BB基因型個體；本研究中，秦川牛AA基因型個體體高、體斜長、胸圍也顯著高于BB基因型個體(P<0.05)，這與Huang等[6]的實驗結果相同。對IGF2基因第2外顯子基因型與不同品種牛生長指標進行比較，得出秦川牛AA、AB基因型個體體重、體高、管圍及尻寬顯著優(yōu)于其余品種BB型個體(P<0.05)；AA、AB型個體秦川牛和安格斯牛的胸圍顯著優(yōu)于西門塔爾牛及新疆褐牛(P<0.05)，但與西門塔爾牛品種相比，秦川牛具有生長發(fā)育緩慢的特征，本實驗結論卻與此不符，這可能是由于采樣時其他品種牛為新引進個體，受到環(huán)境遷移、飼料改變等應激，導致生長發(fā)育緩慢，也可能是樣本量差異所致。Hardy-Weinberg平衡定律可揭示群體基因頻率和基因型頻率的遺傳規(guī)律，據(jù)此使群體的遺傳性能保持相對穩(wěn)定，這是畜禽保種的理論依據(jù)。本研究中，χ2檢驗表明IGF2基因第2外顯子多態(tài)性在所研究的牛品種中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，說明人工選育、遺傳漂變、遷移和自然選擇等各種干擾因素間相互抵消，使群體依然保持動態(tài)平衡狀態(tài)。安格斯牛作為優(yōu)質肉牛品種，受選擇強度較大，但從該角度考慮，其產(chǎn)肉性能未得到很好的選擇，說明群體經(jīng)人工選育使這一基因座的選擇壓力較小，因此可以通過必要的人工選育來提高突變基因型在群體中的頻率。群體內(nèi)的遺傳變異程度通常用He、Ne和PIC來衡量，其值的高低體現(xiàn)出群體內(nèi)的均勻度，值越高，表明存在的遺傳變異和選擇潛力越大[24]。通過遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，該位點在所研究群體中均屬于中度多態(tài)(0.25

4 結 論

IGF2基因第2外顯子具有中度多態(tài)性，秦川牛、安格斯牛、西門塔爾牛及新疆褐牛在該位點存在遺傳多態(tài)性。生長性狀相關性分析發(fā)現(xiàn)，所有品種中A為優(yōu)勢等位基因；秦川牛AA、AB基因型個體在體斜長、胸圍上顯著優(yōu)于BB型個體(P<0.05)；不同品種相比，AA、AB基因型秦川牛和安格斯牛的胸圍顯著優(yōu)于西門塔爾牛及新疆褐牛(P<0.05)；A等位基因能增加肉牛的生長速度，有利于肌肉的生長發(fā)育，因此該位點可作為肉牛生長性狀選育的潛在分子遺傳標記，可將IGF2基因作為影響肉牛生長性狀的候選基因。