王建東，唐玉林，王 敏，張寶所，楊富強，高?；郏?洋，郭延生

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，銀川 750002； 2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)系，銀川 750021；3.寧夏銀川市婦幼保健院，銀川 750001；4.寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司，寧夏 青銅峽 751600)

【研究意義】免疫抑制是指動物機體存在免疫功能障礙，導(dǎo)致免疫力下降，進而更容易受到病原的侵害[1]。目前飼料中禁止添加抗生素已成為養(yǎng)殖業(yè)的常態(tài)，因此有必要找到一種副作用小且有助于提高畜禽免疫力及生產(chǎn)性能的免疫增強劑，而大量研究表明從植物中提取的多糖具有增強免疫、促生長的作用。【前人研究進展】枸杞子是茄科植物枸杞的成熟果實，在中醫(yī)上具有非常重要的地位，李時珍就在《本草綱目》中記載其具有滋腎、潤肺、名目的功效。近年來，枸杞作為藥食兼用的名貴資源受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明枸杞子不僅營養(yǎng)十分豐富而且還具有多種保健功能。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)是枸杞生物活性功能的主要有效成分，具有無耐藥性、無殘留、安全、制造工藝簡單等特點[2]。研究表明LBP具有抗氧化[3-4]、抗炎[5]、神經(jīng)保護[6]、降血糖血脂[7]、免疫調(diào)節(jié)[8-9]等功能。LBP可以誘導(dǎo)NK細胞活化，增強NK細胞的細胞毒性，并能夠通過Notch信號誘導(dǎo)樹突狀細胞的表型和功能成熟，并促進樹突狀細胞介導(dǎo)的細胞毒T淋巴細胞活性[10]。張海燕等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在海蘭褐蛋雞日糧中添加50 mg/kg LBP可顯著提高胸腺和法氏囊的重量，增加血清中白蛋白和溶菌酶含量，促進血液中CD3+T淋巴細胞增殖，由此可見，枸杞多糖具有提高機體免疫功能的臨床功效。而枸杞糖肽(Lyciumbarbarumglycopeptide，LbGp)是從LBP中進一步分離純化后得到的具有更強免疫活性的糖綴合物。【本研究切入點】病原微生物、營養(yǎng)、飼養(yǎng)管理、應(yīng)激和藥物等因素極易誘發(fā)雞群免疫抑制，因此本試驗擬研究通過肌注環(huán)磷酰胺(CY)誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生免疫抑制，再通過飲水口服高、中、低劑量的LbGp，以生長狀況、脾臟指數(shù)、外周血液淋巴細胞增殖率為評價指標，再輔以脾臟組織學(xué)切片分析，旨在探討LbGp對CY誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制雞的免疫調(diào)節(jié)作用。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究結(jié)果將為進一步研究枸杞糖肽拮抗免疫抑制雛雞的作用機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及藥品 1 d齡海蘭蛋雞購自北京市華都峪口禽業(yè)有限公司。枸杞糖肽購自于寧夏天仁枸杞生物科技股份有限公司，試驗地點在寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 環(huán)磷酰胺(貨號：A0505A，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；雞外周血淋巴細胞分離液試劑盒(貨號：LTS1090C，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)；一次性試驗動物靜脈血樣采集容器枸櫞酸鈉抗凝劑(貨號：TBDTM-0001，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)；中性福爾馬林固定液(10%NBF)(貨號：G2161，索萊寶公司)；雞外周血淋巴細胞完全培養(yǎng)基(貨號：CM-C007，武漢普諾賽生命科技有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(批號：2012171911，陜西圣奧動物藥業(yè)有限公司)；電子秤(型號LT502，上海第二天平儀器廠)自；CO2培養(yǎng)箱購自上海力申科學(xué)有限公司；組織切片機(型號：LEICA-RM2235，德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組與處理 將200羽1 d齡海蘭蛋雞，適應(yīng)性飼養(yǎng)至7 d齡后隨機分成5個組，每組40羽，即空白組(NC)、環(huán)磷酰胺組(CY)及LbGp高(LbGpH)、中(LbGpM)、低(LbGpL)3個劑量組，除NC組注射生理鹽水外，其余4組連續(xù)3 d肌注80 mg/(kg·d) CY進行造模，造模后LbGp各組連續(xù)7 d分別給予10、5、2.5 mg/(kg·d) LbGp。在首次給藥后的第7、14、21和28 天，每組隨機選取5只雞稱重，隨后取下脾臟稱重，記錄數(shù)據(jù)計算脾臟指數(shù)，其公式為：脾臟指數(shù)=脾重(g)/體重(g)×100。

1.2.2 淋巴細胞增殖測定 在首次給藥后第7、14、21和28天，每組隨機選取5只雞無菌心臟采血，隨后離心分離淋巴細胞，培養(yǎng)后采用MTT法測定淋巴細胞OD490nm值。

1.2.3 脾臟組織切片 在首次給藥后第7、14、21和28天，每組隨機選取5只雞處死后取脾臟，將其完全放入10%NBF中，室溫保存3 d，按常規(guī)操作制備石蠟切片后HE染色并鏡檢。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 使用SPSS 25.0進行One-way ANOVA檢驗分析各組間的差異顯著性，結(jié)果用平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞糖肽對CY免疫抑制雞體重的影響

由表1可知，在第7、14、21和28天，CY組免疫抑制雛雞的體重均低于其余各組。其中第7天時，NC組體重顯著高于LbGpH、LbGpL和CY組(P<0.05)；第14 天時，LbGpM組體重顯著高于CY組和NC組(P<0.05)；第21天時，LbGpM組顯著高于LbGpH，LbGpH顯著高于CY組(P<0.05)，LbGpM極顯著高于LbGpL、CY和NC組(P<0.01)；第27天時，LbGpM組體重顯著高于LbGpH和LbGpL組(P<0.05)，LbGpM極顯著高于CY和NC組(P<0.01)。

表1 枸杞糖肽對雞體重的影響

2.2 枸杞糖肽對CY免疫抑制雞脾臟指數(shù)的影響

由表2可知，在第7、14、21和28 天，CY組免疫抑制雛雞的脾臟指數(shù)均低于其余各組。第7 天時，NC組顯著高于CY組(P<0.05)；第14、21和28天時，LbGpM組均顯著高于CY組(P<0.05)。

表2 枸杞糖肽對雞脾臟指數(shù)的影響

2.3 枸杞糖肽對免疫抑制雞外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響

由表3可知，在第7、14、21和28 天，CY組免疫抑制雛雞的外周血淋巴細胞OD490 nm值均低于其余各組。其中第7 天時，LbGpM組外周血淋巴細胞OD490 nm值顯著高于CY組(P<0.05)；第14天時，LbGpH、LbGpM和LbGpL組外周血淋巴細胞OD490 nm值均極顯著高于CY組(P<0.01),NC組顯著高于CY組(P<0.05)；第21天時，LbGpH、LbGpM組外周血淋巴細胞OD490 nm值極顯著高于NC與CY組(P<0.01)；第28天時，LbGpH、LbGpM組外周血淋巴細胞OD490 nm值極顯著高于LbGpL、NC和CY組(P<0.01)。

表3 枸杞糖肽對雞外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響(OD490nm)

2.4 枸杞糖肽對免疫抑制雞脾臟組織切片的影響

如圖1所示，首次給藥后的第7天各組淋巴細胞分布均勻，分組之間無明顯差異(P>0.05)。如圖2所示，第14 天時NC組生發(fā)中心個數(shù)約為25～30個；CY組生發(fā)中心個數(shù)約為20個，且生發(fā)中心縮小，邊緣區(qū)模糊，脾竇增寬；LbGp各組生發(fā)中心個數(shù)約40～50個，顯著高于NC和CY組(P<0.05)。如圖3所示，第21 天時NC、LbGp各組生發(fā)中心個數(shù)約為30～40個；CY組生發(fā)中心個數(shù)約25～30個，顯著低于NC和LbGp各組(P<0.05)，且生發(fā)中心縮小、脾竇增寬。如圖4所示，第28 天時各組生發(fā)中心個數(shù)約為30～40個，分組之間無明顯差異(P>0.05)。

圖1 7 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，×10)

圖2 14 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，×10)

圖3 21 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，×10)

圖4 28 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，×10)

3 討 論

3.1 CY對雛雞免疫功能的影響

CY是一種烷化劑類藥物，常用于治療自身免疫病和癌癥，具有細胞毒性作用[12-13]，它可以破壞DNA結(jié)構(gòu)，干擾其進行正常復(fù)制，并導(dǎo)致細胞死亡[14]。有研究表明，CY能降低T細胞的增殖能力以及減少Th1細胞和Th2細胞分泌細胞因子[15]，長期使用可導(dǎo)致機體出現(xiàn)免疫抑制等嚴重副作用[16]，因此CY常被用來構(gòu)建免疫抑制模型。楊樹寶等[17]在使用CY進行雛雞免疫抑制造模，CY組雛雞在體重、脾臟指數(shù)及外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化作用等指標上明顯低于正常組。周亞琳等[18]在使用CY誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫抑制，其脾臟組織學(xué)病理切片鏡檢可見紅髓和白髓界限不清、脾竇增寬，且出現(xiàn)脾臟淋巴細胞減少的現(xiàn)象。本試驗結(jié)果顯示CY組出現(xiàn)生長性能抑制、脾臟指數(shù)降低和外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化減弱現(xiàn)象，并且脾臟組織學(xué)切片可見生發(fā)中心縮小、邊緣區(qū)模糊、脾竇增寬，說明本試驗雛雞免疫抑制構(gòu)建成功。

3.2 枸杞糖肽對CY免疫抑制雞體重和脾臟指數(shù)的影響

體重可直接反映畜禽的生長情況，而脾臟則是畜禽最重要的免疫器官，免疫器官的發(fā)育情況能夠直接影響機體的免疫功能[19]，尤其從脾臟衍生的一些巨噬細胞亞群能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[20]。因此，通過體重和免疫器官指數(shù)可以在一定程度上反映機體的生長性能和免疫功能。而已有研究證明，CY可以明顯減少脾臟淋巴細胞數(shù)量進而導(dǎo)致小鼠生長減緩和免疫器官重量明顯降低[21-22]。同時，研究表明LbGp可以改善肉雞的生長性能[23]，可以提高CY誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)和減輕免疫器官損傷[24]，LbGp還能夠增加腸通透性和改變腸道組織學(xué)結(jié)構(gòu)，抑制嗜中性粒細胞積累，降低TNF-α水平，提高脾臟淋巴細胞增殖率[25]。本研究也發(fā)現(xiàn)LbGp具有能提高CY誘導(dǎo)免疫抑制產(chǎn)蛋雛雞的生長性能和脾臟指數(shù)的作用，其中LbGp中劑量濃度[5 mg/(kg·d)]效果最好。

3.3 枸杞糖肽對免疫抑制雞外周血淋巴細胞的影響

淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在防御機體疾病方面發(fā)揮著巨大的作用[26]。淋巴細胞的作用是產(chǎn)生針對細菌、病毒、真菌、寄生蟲和有毒化學(xué)物質(zhì)的抗體，殺死入侵生物和感染細胞，并釋放細胞因子以警告其他細胞存在危險[27]。外周血淋巴細胞，是指存在于外周血液循環(huán)中的淋巴細胞，能夠引起機體免疫抑制劑量的CY可以導(dǎo)致外周血淋巴細胞數(shù)量迅速減少和免疫器官細胞異常凋亡[28]。有研究表明，淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低也可在一定程度上反映出機體免疫水平[29]。劉永利等[30]在日糧中添加4 g/kg LbGp可顯著提高肉雞外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化作用。徐占云等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)外周血淋巴細胞液中分別加入4、16、64、256 μg/mL LbGp均能夠促進雛雞淋巴細胞增殖，其中16 μg/mL濃度效果最好。另有研究表明，LbGp可以激活轉(zhuǎn)錄因子NFAT和AP-1，誘導(dǎo)IL-2和IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，并刺激T細胞產(chǎn)生Th1細胞因子，其誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖速度為原來的3～4倍[32]。本試驗結(jié)果也證明LbGp可以提高產(chǎn)蛋雛雞外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化作用。

3.4 枸杞糖肽對免疫抑制雞脾臟組織學(xué)的影響

生發(fā)中心(GC)是在次級淋巴器官中發(fā)育的專門的微體系結(jié)構(gòu)，是B細胞增殖、分化和產(chǎn)生高親和力抗體的區(qū)域，在體液免疫過程中發(fā)揮著重要作用[33]。郝文麗[34]研究發(fā)現(xiàn)LbGp可修復(fù)亞健康小鼠被破壞的脾臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，顯著增加淋巴細胞數(shù)量，說明LbGp可以起到恢復(fù)脾臟損傷的作用。本試驗通過對雞脾臟的組織學(xué)變化的觀察，發(fā)現(xiàn)CY能夠損傷雞脾臟，減少生發(fā)中心數(shù)量和淋巴細胞數(shù)量，而LbGp能夠在一定程度上促進脾臟損傷恢復(fù)。

4 結(jié) 論

本試驗采用CY誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生免疫抑制狀態(tài)，研究LbGp對免疫抑制的拮抗作用，結(jié)果表明LbGp可以顯著提高CY誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制雛雞的生長性能，顯著促進脾臟的發(fā)育，加快脾臟因CY帶來損傷的恢復(fù)過程，極顯著提高了CY誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制雛雞外周血淋巴細胞的增殖能力，以LbGp中劑量組[5 mg/(kg·d) ]效果最好。