黃莎莎，何鵬飛，何月秋，李興玉，吳毅歆

( 1.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學基礎(chǔ)與信息工程學院，昆明 650201)

【研究意義】解淀粉芽孢桿菌W1是實驗室從一種自然死亡的二斑葉螨中分離出來的，具有很強的導致二斑葉螨死亡的能力。通過研究可為二斑葉螨的防治提供一種新的微生物資源和防治策略，為后續(xù)開發(fā)利用更多微生物資源奠定基礎(chǔ)，也為新型微生物殺螨劑的研發(fā)與應用提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】二斑葉螨是一種分布于世界各溫帶、亞熱帶地區(qū)的害螨。寄主植物種類廣泛，共有140多個科1100余種[1]，嚴重為害蔬菜、花卉、果樹和溫室栽培等經(jīng)濟作物。該螨以刺吸式口器吸取植物的汁液,幼螨、若螨和成螨均能危害寄主的葉片、芽和嫩莖[2]。因其具有個體小、世代短、繁殖快、寄主廣、適應性強及易產(chǎn)生抗藥性等特點，極易爆發(fā)成災，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的影響[3]。因此，二斑葉螨防治成為農(nóng)作物蟲害亟待解決的重要問題之一。目前常用的防治手段包括農(nóng)業(yè)防治、化學防治和生物防治，但農(nóng)業(yè)防治周期長、可控性小，而化學防治雖見效快，但可持續(xù)利用性低、易產(chǎn)生抗藥性且對環(huán)境污染大等缺點，生物防治具有不易產(chǎn)生抗性、對環(huán)境安全等優(yōu)點，越來越受到廣泛的關(guān)注。生物防治中主要是利用捕食螨且均已不同程度商品化利用[4]。而微生物中具有殺螨效果的主要群體是真菌，有研究報道新接霉屬的一些種在很多作物上寄生于葉螨[5-7]。豹斑毒鵝膏菌、褐鱗環(huán)柄菇、被毛孢屬以及頂孢霉屬等對二斑葉螨具有致病性[8-10]。而關(guān)于細菌有殺螨活性的報道少，目前研究最多的是蘇云金芽孢桿菌(BacillusthuringiensisBerliner，簡稱Bt)和內(nèi)共生菌Wolbachia。研究發(fā)現(xiàn)，Bt除了對鱗翅目昆蟲有高效殺蟲活性外[11]，對朱砂葉螨的幼螨、若螨、成螨具有毒殺作用，對幼螨的毒殺作用效果最好，其次生代謝產(chǎn)物蘇云金素對二斑葉螨幼螨的毒殺作用高效且無選擇性[12-14]。Macrolactins是一類具有抗菌活性的新型大環(huán)內(nèi)酯類化合物，由深海細菌、放線菌屬和芽孢桿菌屬代謝產(chǎn)生。目前，對macrolactins類物質(zhì)研究最多的是大環(huán)內(nèi)酯A，它最早是由Gustafson等[15]從一些未分類的深海細菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)。研究表明，大環(huán)內(nèi)酯A具有選擇性的抗菌活性，除此之外還能夠抑制B16-F10小鼠黑色素瘤癌細胞的生長以及哺乳動物單純性皰疹病毒的增殖，也能通過抑制艾滋病病毒的復制以此來保護淋巴細胞[15]。Lee等[16]于2003年從土壤中分離鑒定出一株解淀粉芽孢桿菌 CHO104,并從其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯A，對Staphylococcusaureus、Eescherichiacoli、Botrytiscinerea等有很強的抑制作用。但對其具有殺蟲活性的報道少見。【本研究切入點】對解淀粉芽孢桿菌W1的次級代謝產(chǎn)物的活性化合物進行研究，已確定其對紅蜘蛛的殺蟲活性物質(zhì)為二酮哌嗪類，大環(huán)內(nèi)酯類及巨桿菌素類等化合物[17]。大環(huán)內(nèi)酯類化合物中以大環(huán)內(nèi)酯A為主要殺螨活性物質(zhì)，而大環(huán)內(nèi)酯A是由mln基因簇調(diào)控合成，通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建mlnB基因缺陷突變體，研究其對殺螨抑菌活性的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過同源重組構(gòu)建大環(huán)內(nèi)酯生物合成缺陷突變體并利用PCR和HPLC-MS/MS技術(shù)驗證，檢測其殺螨抑菌活性，為解淀粉芽孢桿菌W1殺螨活性的機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細菌菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

大腸桿菌TG1、解淀粉芽孢桿菌以及供試植物病原細菌(大白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜黑腐病菌及茄科青枯病菌)均使用LB固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。除供試植物病原真菌的培養(yǎng)溫度為30 ℃外，大腸桿菌和解淀粉芽孢桿菌均置于37 ℃培養(yǎng)；液體振搖培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為160 r/min。所使用的抗生素種類及終濃度分別如下：氨芐青霉素100 μg/mL(大腸桿菌)、氯霉素10 μg/mL(解淀粉芽孢桿菌)及卡那霉素30 μg/mL(解淀粉芽孢桿菌)。

二斑葉螨飼養(yǎng)于實驗室溫室的玉米(會單4號)幼苗植株上。阿維菌素由安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 敲除載體pBS-mlnB-kanR的構(gòu)建

研究所用的引物見表1。為獲取解淀粉芽孢桿菌W1的大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體，以大環(huán)內(nèi)酯生物合成基因簇mln中的基因成員mlnB為敲除對象，構(gòu)建對應的敲除質(zhì)粒。

構(gòu)建的基本流程如下：首先使用引物mlnB-F/mlnB-R擴增出解淀粉芽孢桿菌W1菌株體內(nèi)mlnB部分序列(此片段中央處含有單個Hind III切點)；利用膠回收純化試劑盒回收靶標條帶，BamHI/XhoI雙切，隨后將之克隆到被相同酶組合消化的pBS(即pBluescript)質(zhì)粒內(nèi)部，即生成中間載體pBS-mlnB；Hind III單切pMD18-kanR，膠回收含有卡那霉素抗性基因的條帶，然后插入到Hind III單切且去磷酸化的pBS-mlnB，即獲得最終的敲除載體pBS-mlnB-kanR。

1.3 解淀粉芽孢桿菌W1-comK的誘導轉(zhuǎn)化

參照前人采用的方法[18]，以IPTG為誘導物，誘導解淀粉芽孢桿菌W1-comK(胞內(nèi)含有pHT01-comK[17]的W1菌株)形成自然感受態(tài)，完成pBS-mlnB-kanR向解淀粉芽孢桿菌W1-comK自然感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化。37 ℃培養(yǎng)16～24 h后，在含有卡那霉素的LB瓊脂平板上挑選轉(zhuǎn)化子。

采用水煮凍融法快速提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，以DNA為模板，使用表1中的引物PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶的有無以及長度是否符合預期，并送交PCR產(chǎn)物給昆明擎科生物技術(shù)公司測序。分析測序結(jié)果以確認卡那霉素抗性基因是否被整合插入到轉(zhuǎn)化子mlnB基因內(nèi)部。將正確的重組子轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃振搖過夜。次日，加入等體積無菌40%(v/v)甘油，均勻混合后，-80 ℃冰箱保存。

表1 研究所使用的引物

1.4 解淀粉芽孢桿菌W1菌株大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體的HPLC-MS/MS驗證

1.4.1 樣品前處理 從-80 ℃冰箱中取出所保存的解淀粉芽孢桿菌W1大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體甘油菌，待其呈熔融狀態(tài)，使用無菌接種環(huán)蘸取少許甘油菌液體，劃線于含有卡那霉素的LB瓊脂平板。37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落，接種到試管內(nèi)裝有5 mL含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃振搖培養(yǎng)過夜。然后，按1∶100的接種比例轉(zhuǎn)接入裝有50 mL含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，37 ℃振搖培養(yǎng)。72 h后，12 000 r/min室溫離心2 min，收集上清液。使用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后稱重。使用甲醇溶解乙酸乙酯萃取出的蒸干產(chǎn)物，隨后用0.22 μm孔徑的纖維素微孔濾膜過濾，獲得無菌的萃取物甲醇飽和液，貼好標簽即可上樣。野生型W1也是同樣的操作，只是培養(yǎng)基中無需加入抗生素。

1.4.2 色譜條件 色譜柱使用UltimateAQ-C18柱，流動相為甲醇/水(含甲酸)，梯度洗脫條件及操作

見表2，流速控制為1 min/mL。柱溫40 ℃，檢測波長為254 nm，進樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序

1.4.3 質(zhì)譜條件 離子化模式：ESI 離子源；掃描方式：正、負離子掃描；檢測器電壓：1.70 kV；CDL溫度：200 ℃；加熱模塊溫度：200 ℃；霧化氣：氮氣，1.5 L/min；干燥氣：氮氣，1.5 L/min；碰撞氣：氬氣；采集范圍：一級和二級質(zhì)譜均為m/z 100-1500。

1.5 W1 大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體對植物病原細菌的拮抗活性

分別在LB瓊脂平板內(nèi)劃線培養(yǎng)出解淀粉芽孢桿菌W1野生型及其大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體、白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜黑腐病菌和茄科青枯病菌的單菌落。挑取各菌株的單菌落，轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基內(nèi)振搖培養(yǎng)。36 h后，利用10倍稀釋法測定芽孢桿菌和供試植物病原細菌培養(yǎng)物的菌體細胞濃度，將芽孢桿菌和植物病原細菌的濃度分別調(diào)整為106和107CFU/mL。取病原菌菌液(107CFU/mL)200 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)平板(9.0 cm)，超凈臺吹干平板表面水分；使用移液槍吸取上述芽孢桿菌菌液(106CFU/mL)各2.0 μL，分別滴加至表面涂有植物病原細菌的固體平板上(4點/皿)。30 ℃恒溫培養(yǎng)數(shù)天不等，觀察芽孢桿菌菌落生長情況及其周圍有無抑菌圈。

1.6 W1大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體的殺螨活性

解淀粉芽孢桿菌W1菌株大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體對二斑葉螨的毒殺活性采用玻片浸漬法[19]進行，具體細節(jié)略有改動，主要是將其中的載玻片替換成毛細管。選取行動活潑、大小一致的成螨個體，毛細管黏附成螨背部(20頭活螨/根)。將上述毛細管浸于W1野生型或其突變體培養(yǎng)物(108CFU/mL)內(nèi)5 s，取出并使用濾紙吸干殘留菌液。定時用毛筆輕觸螨體觀察其反應，統(tǒng)計各處理組的成螨死亡情況。以對照組死亡率小于5%為有效試驗[20]，按下式計算出各組的校正死亡率。

死亡率(%)=死亡蟲數(shù)(頭)/處理總蟲數(shù)(頭)×100

校正死亡率(%)=(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)×100

以阿維菌素(3000倍液)和稀釋相同倍數(shù)的無菌液體LB培養(yǎng)基分別為正、負對照，每個處理設(shè)有3次重復。獨立重復此試驗至少3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除載體pBS-mlnB-kanR 的構(gòu)建

通過0.8%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測引物對mlnB-F/R的PCR擴增產(chǎn)物，可見在與250 bp I型 DNA Marker(上海捷瑞)中的2.0 kb條帶水平位置處下方有清晰的單一亮帶(圖1-A)，表明含有部分mlnB編碼基因的片段(1584 bp)被成功地從W1菌株中擴增出來。菌落PCR檢測結(jié)果還顯示，mlnB片段已插入到pBS內(nèi)部(圖1-B)。mlnB-F/R的菌液PCR產(chǎn)物檢測顯示，卡那霉素抗性基因順利地克隆到中間載體pBS-mlnB(圖1-C)，獲得最終的敲除載體pBS-mlnB-kanR。最終載體pBS-mlnB-kanR的Hind III單切產(chǎn)物電泳帶型(圖1-D)也表明，kanR已插入到中間載體pBS-mlnB內(nèi)部。

A：mlnB的PCR擴增(CK擴增模板為ddH2O)；B：攜帶pBS-mlnB的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌液PCR(1～8道擴增模板為轉(zhuǎn)化子，CK和W1分別為負和正對照)；C：攜帶pBS-mlnB-kanR的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌液PCR(1～6道擴增模板為轉(zhuǎn)化子，CK和W1分別為負和正對照)；D：Hind III分別切pBS-mlnB和pBS-mlnB-kanR的電泳檢測(1道為pBS-mlnB，2道為和pBS-mlnB-kanR);M:DNA marker；箭頭:本實驗最終選擇的攜帶pBS-mlnB和pBS-mlnB-kanR的大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化子

2.2 解淀粉芽孢桿菌W1大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體的構(gòu)建

通過IPTG人工誘導W1-comK菌株形成自然感受態(tài)及隨后轉(zhuǎn)化導入整合型敲除載體pBS-mlnB-kanR等操作，在含有卡那霉素的LB平板發(fā)現(xiàn)有多個轉(zhuǎn)化子菌落。從中隨機挑取13個抗性轉(zhuǎn)化子，通過特異性引物PCR擴增檢測，發(fā)現(xiàn)從大部分轉(zhuǎn)化子的基因組DNA中均能擴增到與kanR大小相近的條帶(1.1 kb，圖2-A)，PCR產(chǎn)物的測序分析顯示其序列與金黃色葡萄球菌pUB110質(zhì)粒內(nèi)部卡那霉素抗性基因一致性達95.6%(數(shù)據(jù)未顯示)。使用最外圍引物mlnB-F/R從突變體中擴增出的產(chǎn)物電泳位置明顯高于以W1野生型基因組DNA為模板所擴增的，與陽性對照(敲除載體pBS-mlnB-kanR為擴增模板)的相接近(圖2-B)，表明卡那霉素抗性基因的確被成功地整合插入到解淀粉芽孢桿菌W1菌株的mlnB基因內(nèi)部。故將此大環(huán)內(nèi)酯合成突變體命名為解淀粉芽孢桿菌W1-comK △mlnB::kanR。

A：mlnB-F/R的PCR擴增檢測(1～12道擴增模板為W1 ΔmlnB::kanR轉(zhuǎn)化子；13道擴增模板為質(zhì)粒pBS-mlnB-kanR為陽性對照：W1作為陰性對照，CK為空白對照)；B：卡那霉素抗性基因表達盒的PCR擴增檢測(2～13道擴增模板為W1 ΔmlnB:kanR轉(zhuǎn)化子；1道擴增模板為質(zhì)粒pMD18-kanR作為陽性對照，W1作為陰性對照，CK為空白對照);M:DNA marker；箭頭:本實驗最終選擇的攜帶pBS-mlnB-kanR的解淀粉芽孢桿菌陽性轉(zhuǎn)化子

2.3 解淀粉芽孢桿菌W1-comK ΔmlnB::kanR發(fā)酵上清的HPLC-MS/MS質(zhì)譜分析

從pubchem網(wǎng)站上查到化合物大環(huán)內(nèi)酯A的相對分子量(Mr)為402.241 Da。圖3-A為野生型W1在47.288 min時的一級質(zhì)譜圖，正離子模式下，該化合物的[Mr+Na]+和[Mr+K]+的離子峰分別為425.224和441.251 Da，可斷定其分子量為402 Da,與pubchem網(wǎng)站上查詢結(jié)果一致，推測此化合物為大環(huán)內(nèi)酯A。根據(jù)其二級質(zhì)譜圖(圖3-C)可推測其斷裂方式如圖3-B所示。相同時間點,將解淀粉芽孢桿菌W1大環(huán)內(nèi)酯合成突變體發(fā)酵上清的HPLC/MS結(jié)果與其野生型相對比(圖4-A)，雖然大環(huán)內(nèi)酯合成突變體在一級質(zhì)譜中也有此兩類信號，但與W1野生型相對應的信號峰在二級質(zhì)譜圖中沒有再出現(xiàn)(圖4-B)，表明突變體因大環(huán)內(nèi)酯合成基因簇成員基因mlnB被插入破壞而不再合成大環(huán)內(nèi)酯A。

A：以正離子模式檢測大環(huán)內(nèi)酯A的一級質(zhì)譜；B：推測大環(huán)內(nèi)酯A的二級質(zhì)譜的斷裂方式；C：以正離子模式檢測大環(huán)內(nèi)酯A的二級質(zhì)譜

A：以正離子模式檢測大環(huán)內(nèi)酯A的一級質(zhì)譜；B：以正離子模式檢測大環(huán)內(nèi)酯A的二級質(zhì)譜

2.4 大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷對解淀粉芽孢桿菌W1-comK ΔmlnB::kanR病原拮抗活性的影響

如圖5所示，在解淀粉芽孢桿菌W1野生型及其大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體的菌落周圍并沒有看到肉眼可見的透明抑菌圈，但明顯可見W1野生型菌落，而突變體菌落色澤較淡，與供試植物病原細菌的界限不清晰，顯示野生型菌株在表面長滿有供試植物病原細菌的LB瓊脂平板中仍有一定的競爭優(yōu)勢，但大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷削弱了突變體在上述平板對柑橘潰瘍病菌、大白菜黑腐病菌及茄科青枯病菌的拮抗活性。

A：白菜軟腐病菌；B：柑橘潰瘍病菌；C：大白菜黑腐病菌；D：茄科青枯菌；垂直方向上點樣菌落均為野生型W1,水平方向上點樣菌落均為缺失突變體W1 ΔmlnB::kanR

2.5 大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷對解淀粉芽孢桿菌W1-comK ΔmlnB::kanR殺螨活性的影響

在4個處理組中，浸蘸阿維菌素的處理組二斑葉螨的死亡率最高(91.67%～93.33%)，W1野生型菌株次之(73.33%～77.22%)，而大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體的殺螨活性(26.67%)僅高于液體LB(3.89%～4.44%)，顯著低于野生型(圖6)。定時檢測結(jié)果顯示在W1野生型、阿維菌素和液體LB對照組3個處理組中，成螨死亡率6 h后的均略高于30 min的，而突變體卻并未表現(xiàn)這一點。

圖6 野生型W1與缺失突變體W1 ΔmlnB::kanR殺螨活性測定

3 討 論

解淀粉芽孢桿菌是一種被廣泛研究的微生物,其基因組中有至少4%～5%的基因信息與抗生素的合成相關(guān),大約能夠合成二十幾種拮抗物質(zhì)[21]。在這些拮抗物質(zhì)中,surfactin和iturinA家族是研究和發(fā)現(xiàn)最多的,不同家族的脂肽可以讓芽孢桿菌在各種生境與其他微生物的競爭中保持優(yōu)勢[22]。除了在制酶等工業(yè)領(lǐng)域有廣泛應用外，解淀粉芽孢桿菌還是一類重要的植物生防資源，表現(xiàn)出良好的植物促生、抗逆以及病蟲害防控特性[23-25]。解淀粉芽孢桿菌AG1菌株合成表面活性物質(zhì)被證實可破壞番茄斑潛蠅幼蟲中腸上皮細胞的完整性，從而具有殺蟲活性[25]。前期研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌W1菌株毒殺二斑葉螨的活性物質(zhì)較為多樣，其中大環(huán)內(nèi)酯(Macrolactin)在其中扮演著重要角色[17]。不同于合成大環(huán)內(nèi)酯A、7-O-丙二酰大環(huán)內(nèi)酯A及7-O-琥珀酰大環(huán)內(nèi)酯A的解淀粉芽孢桿菌NJN-6[26]及合成大環(huán)內(nèi)酯A、大環(huán)內(nèi)酯D、7-O-丙二酰大環(huán)內(nèi)酯A及7-O-琥珀酰大環(huán)內(nèi)酯A的解淀粉芽孢桿菌FZB42[27]，通過研究W1菌株發(fā)酵上清液中目前只檢測到合成了其中的大環(huán)內(nèi)酯A，與另一株近緣海洋細菌——解淀粉芽孢桿菌ESB-2相類似[28]，表明大環(huán)內(nèi)酯合成及后續(xù)加工修飾可能會因菌株種類不同而有所差異。

研究發(fā)現(xiàn)相比于野生型，mlnB發(fā)生突變的W1菌株對白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜黑腐病菌以及茄科青枯病菌的抑制活性均下降，但兩者均未看到常見的透明抑菌圈，僅能通過自身菌落生長來判斷，這可能與植物病原細菌和生防芽孢桿菌的數(shù)量比例不理想等原因有關(guān)。需更有力的數(shù)據(jù)來支持W1大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體對植物病原細菌的拮抗活性出現(xiàn)削弱跡象。但拮抗活性試驗結(jié)果仍說明解淀粉芽孢桿菌W1合成的大環(huán)內(nèi)酯A具有抑制植物病原細菌的活性，與前人報道也相一致[29]。W1菌株作為二斑葉螨生防菌株被應用，實驗結(jié)果表明了其在防治細菌性病害方面的潛力。

殺螨活性研究則顯示大環(huán)內(nèi)酯A不再合成后，W1-comK ΔmlnB::kanR的殺螨能力下降明顯，再次證實大環(huán)內(nèi)酯A是解淀粉芽孢桿菌W1菌株殺螨的活性物質(zhì)。浸潤W1野生型發(fā)酵液后6 h的成螨死亡率比30 min的成螨死亡率略有增加，而大環(huán)內(nèi)酯突變體卻未表現(xiàn)出這一點，表明W1菌株對二斑葉螨的殺滅活性有一定的持效期。此特點是否與W1野生型菌株及其大環(huán)內(nèi)酯突變體在害螨體內(nèi)定殖能力差異有關(guān)，尚待研究。

4 結(jié) 論

解淀粉芽孢桿菌W1菌株合成的大環(huán)內(nèi)酯A具有殺二斑葉螨活性，同時還能抑制大白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜黑腐病菌以及茄科青枯病菌。大環(huán)內(nèi)酯A合成受阻后，W1菌株的活性均明顯地被削弱。