李 霞，杜 娟，楊曉夢，普曉英，楊加珍，楊 濤，李玉萍，曾亞文

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，昆明 650205; 2. 玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，云南 玉溪 653106)

【研究意義】云南稻種資源豐富，有色米資源幾乎占云南地方稻種資源的一半[1]。有色稻米種皮富含天然色素，在抗癌[2]、抗炎癥[3]、抗菌、保護視力、預防心血管疾病和糖尿病等方面都具有重要生理功能[4-6]。其中紅米是有色米中數(shù)量最多的一類，對云南紅米種質(zhì)資源進行系統(tǒng)鑒定與利用，將有助于功能稻米品種選育?！厩叭搜芯窟M展】紅米的遺傳模式研究發(fā)現(xiàn)，種皮顏色性狀大多屬于質(zhì)量性狀，由1對顯性基因控制。石幫志等[7]利用紅米材料‘天紅’和8種白米水稻材料對種皮顏色性狀遺傳模式進行分析，結(jié)果顯示F1代種皮顏色均為紅色，而對應F2分離群體中種皮顏色紅和白的分離比為3∶1，表明‘天紅’的紅色種皮性狀受1對獨立的顯性基因控制。趙輝等[8]用綠色果皮的緊穗野生稻和白色果皮的栽培稻‘中花九號’進行雜交，利用BC4F2群體確定紅色種皮的性狀受1對顯性基因控制。相似的結(jié)果也出現(xiàn)在王麗華等[9]利用紅米水稻品種‘紅金石’和白米品種進行遺傳模式分析的研究中，以上結(jié)果均說明紅色種皮的性狀是受1對顯性基因控制的。但也有少數(shù)研究表明，紅米種皮顏色受兩對顯性基因控制或呈現(xiàn)數(shù)量遺傳特性。廖金花等[10]選擇紅米品種‘紅寶石’和四個恢復系進行種皮顏色性狀遺傳分析，發(fā)現(xiàn)其F2代群體中種皮顏色在紅色中又有深紅、淺紅、粉白之分，其三者之和和白色的分離比為15∶1，以上結(jié)果表明‘紅寶石’的種皮顏色性狀由兩對具有互補作用的顯性基因控制的。隨著生物學技術的不斷發(fā)展，國外學者對紅米種皮顏色基因的研究發(fā)現(xiàn)，該基因位點位于第7染色體，隱性白米種皮無著色是源于Rc基因第6外顯子內(nèi)的14 bp缺失，缺失導致該基因失去功能[11]。國內(nèi)學者通過對長雄野生稻、紅寶石及紅米品種培雜191的種皮顏色基因定位也得到相似的結(jié)論，初步定位結(jié)果均顯示種皮顏色基因位于第7染色體上，紅白米之間Rc基因存在類似的缺失變異[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c】紅米種質(zhì)‘rm257’，是一份優(yōu)異的功能稻米育種材料，具有良好的應用前景和遺傳研究價值。但針對該紅米資源的遺傳研究尚未開展，那么該紅米種質(zhì)種皮顏色遺傳模式如何，該性狀受幾對基因控制，是否與紅米種皮顏色基因Rc直接相關？這些都是高效利用該材料進行有色米新品種選育所需解決的問題?！緮M解決的關鍵問題】利用云南高黃酮紅米種質(zhì)‘rm257’與9份云南地方白米品種構建測交組合及F2分離群體，通過觀察統(tǒng)計其種皮顏色分離情況，推測其遺傳模式；同時利用Rc基因變異缺失位點序列開發(fā)功能標記，再利用F2分離群體進行驗證，初步明確紅米種質(zhì)‘rm257’種皮顏色與Rc基因的關系；并利用96份云南地方核心種質(zhì)材料對該功能標記的通用性進行檢驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料：高黃酮紅米材料‘rm257’，9份云南地方種白米材料毫換、合系35、曼丫谷、昌寧糯、高腳糯、黃殼糯、旱揚谷、毫門共、白酒谷。9個測交組合及其F2分離群體。地方種材料：96份云南地方種質(zhì)材料，其中包括51份白米材料，45份紅米材料。以上材料分別種植于云南省農(nóng)業(yè)科學院嵩明基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 田間取幼嫩葉片，CTAB小樣法提取基因組總DNA，紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量及濃度，稀釋到50 ng/μL備用。

1.2.2 功能標記開發(fā)及PCR體系Rc基因功能標記開發(fā)及檢測：Rc基因(LOC_Os07g11020)全序列下載于RGAP網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，依據(jù)已報導的Rc基因第6外顯子14 bp缺失差異區(qū)段[11]，利用引物設計軟件Primer5設計功能標記引物，其中RCGXL: 5′-TGAAGGAAGTGATGACAACAAGACC-3′， RCGXR5′-ATGGTTGGCACTGAAATCACCTTGG-3′，擴增結(jié)果穩(wěn)定，條帶清晰分別用于分離群體檢驗和通用性檢驗。

PCR反應體系總體積為25 μL：2×TsingKe Master Mix 12.5 μL，50 ng/μL DNA模板3 μL，上下游引物各1 μL，最后以7.5 μL ddH2O補平。2×TsingKe Master Mix 購買自昆明碩擎有限公司。 PCR 反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 30～35個循環(huán)；72 ℃ 延伸5～15 min。擴增產(chǎn)物用8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法顯色，待條帶清晰可見后，將膠片轉(zhuǎn)入透明自封袋后置于白熾燈箱上照相、記錄。

功能標記群體檢驗：利用功能標記RCGX對9個組合的F2分離群體單株基因型進行分析，基因型為RcRc和Rcrc的單株對應表型為紅色，基因型為rcrc的單株對應表型為白色。最后完成基因型與對應單株種皮顏色表型的對應關系，判斷Rc基因是否為‘rm257’種皮顏色性狀的目標基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘rm257’遺傳模式分析

‘rm257’與9個云南地方白米品種配置的測交組合發(fā)現(xiàn)，9個組合的F1代種皮顏色均為紅色，紅色種皮呈顯性。次年對9個組合F2代群體單株種皮顏色考察發(fā)現(xiàn)，9個測交組合中，7個組合的后代主要呈現(xiàn)2種類型，紅色和白色。通過7個測交組合的F2代單株紅色種皮和白色種皮數(shù)量經(jīng)卡方檢驗均符合3∶1的分離比(表1)，但在以毫換和合系35為父本的2個測交組合分離群體中紅色類型又可分為紅色和紅褐色(圖1)。同時對紅色，紅褐色，白色的單株分離情況經(jīng)卡方測驗也符合9∶3∶4分離比?；谝陨蠑?shù)據(jù)表明，‘rm257’種皮顏色性狀與不同測交父本表現(xiàn)出不同的遺傳模式，在大部分組合中‘rm257’的種皮顏色主要受1對顯性基因控制，而在少數(shù)組合中其種皮顏色的分離表型可能同時受到2個基因位點影響。同時以上結(jié)果也說明同一份材料在和不同材料組配時種皮顏色這一性狀可能呈現(xiàn)不同的遺傳模式的。

圖1 F2分離群體種皮顏色類型

表1 種皮顏色性狀在F2群體中的分離情況

2.2 分離群體功能標記驗證

利用功能標記RCGX對9個測交組合進行群體驗證，分析9個測交組合的1156個單株的基因型，因功能標記RCGX為共顯性標記，所有測交組合分離群體單株都呈現(xiàn)出3種基因型RcRc、Rcrc、rcrc帶型(圖2)。通過統(tǒng)計各組合3種基因型單株數(shù)量發(fā)現(xiàn)，其中7個組合3種基因型基本符合1∶2∶1的分離比例，而以毫換和合系35為父本的2個測交組合分離群體中Rcrc基因型占比較高(表2)。基于以上基因型數(shù)據(jù)結(jié)合測交組合的分離群體單株種皮顏色表型，該功能標記基因型與表型呈現(xiàn)了一一對應關系。

M：Marker；1，2，3分別表示rcrc、Rcrc、RcRc基因型對應檢測帶型，下同

表2 F2分離群體功能標記RCGX基因型鑒定

2.3 RCGX功能標記的通用性檢驗

基于分離群體的功能標記RCGX基因型與表型間的對應性，表明該功能標記作為種皮顏色預判的一種有效技術手段，可以為紅米‘rm257’的育種應用提供分子標記輔助支持。為進一步驗證該標記在云南地方種質(zhì)資源中的通用性，選取96份云南地方種質(zhì)資源(白米51份，紅米45份)，利用該標記對上述種質(zhì)資源的基因型進行鑒定(圖3)，通過96份材料基因型和表型的比對，同樣表現(xiàn)出基因型與表型的一致對應，即RcRc基因型為紅色種皮，rcrc基因型為白色種皮。以上結(jié)果初步表明，Rc基因在水稻紅色種皮顏色中的變異是相對保守的，且云南地區(qū)多數(shù)的白米突變都是由該缺失變異導致種皮顏色變化的。

圖3 功能標記RCGX檢測96份地方種基因型

3 討 論

有色米作為天然的功能性食品，其營養(yǎng)成分遠高于普通精白米[14]。因此，研究有色米種質(zhì)資源的遺傳特性，可為深層次開發(fā)利用有色米資源，促進有色米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定基礎。紅米種質(zhì)‘rm257’在籽?？傸S酮和抗性淀粉含量方面表現(xiàn)突出，分析該材料種皮顏色遺傳模式，利于其在實際育種中應用。遺傳分析表明，‘rm257’的種皮顏色在7個組合中表現(xiàn)出受1對顯性基因控制，這與前人對紅米遺傳模式分析的實驗結(jié)果相似[7-8]。但以毫換和合系35為父本的2個測交組合分離群體中紅色類型又可分為紅色和紅褐色(圖1)，與已報道的RcRd和Rcrd基因型的表型對應[15]。同時對其紅色，紅褐色，白色的單株分離情況進行卡方測驗，符合9∶3∶4的分離比，以上結(jié)果均符合2個基因位點共同作用的遺傳模式，這與廖金花等[10]的研究結(jié)果一致。綜上所述，該紅米種皮顏色性狀遺傳可能受2對基因的控制，只是針對不同的測交父本材料表現(xiàn)出不同的遺傳模式。

針對紅米種皮顏色性狀相關基因，多數(shù)定位研究認為位于第7和1染色體[8-10]。已有研究證實第7染色體的Rc基因?qū)t米種皮顏色的形成起決定性作用，Rc基因的突變導致紅米變?yōu)榘酌譡11]。因此本研究基于Rc基因開發(fā)共顯性標記RCGX，對9個測交組合的F2分離群體單株基因型數(shù)據(jù)進行分析，對照每個單株的種皮顏色表型，結(jié)果呈現(xiàn)一一對應關系。該結(jié)果表明功能標記RCGX與種皮顏色性狀共分離，加之對9份測交父本Rc基因變異區(qū)段的序列分析發(fā)現(xiàn)，測交父本的Rc基因序列在該區(qū)域確實存在14 bp缺失[16]。據(jù)此推測，Rc基因極有可能為控制‘rm257’種皮顏色的目標基因。而以毫換和合系35為父本的2個測交組合中，依據(jù)F2群體紅色，紅褐色，白色的單株分離比來看，‘rm257’種皮顏色性狀可能不僅受Rc單一位點的影響。前人報道中[15]Rc基因位點正常的情況下，Rd基因位點的變異導致紅褐色表型的出現(xiàn)，以上結(jié)果表明在這2個組合中，Rd基因可能也影響了‘rm257’種皮顏色性狀，但對Rd基因的變異情況有待下一步研究。

水稻作為功能基因組研究的模式植物，近年來在該領域研究發(fā)展迅速，大批重要功能基因被分離鑒定[17]。一大批控制水稻產(chǎn)量[18-23]、抗病蟲害[24-25]、抗逆[26-27]和營養(yǎng)高效[28-30]等重要農(nóng)藝性狀的功能基因被科學家克隆，基因的克隆為功能標記的開發(fā)提供了先決條件。由于功能標記是基于基因內(nèi)突變位點開發(fā)的，與基因完全共分離，能有效解決連鎖標記的問題，因此在水稻抗病[31]、耐低溫[32]、抗除草劑[33-34]、水稻粒型及稻米品質(zhì)育種中廣泛應用[35-36]。本研究中功能標記RCGX的通用性驗證表明，在大部分的云南地方稻種資源中，種皮顏色基因Rc的變異是相對保守的，所以基于Rc基因開發(fā)功能標記用于云南地方有色米資源的鑒定和育種，是行之有效的策略和途徑，同時也可為云南紅米品種的快速篩選提供有效的技術支持。

4 結(jié) 論

云南高黃酮紅米種質(zhì)‘rm257’的種皮顏色在不同測交組合中表現(xiàn)為受1對顯性基因控制或受2個基因位點的控制及影響。功能標記RCGX與種皮顏色性狀共分離，加之測交父本在Rc基因通過序列比對確實存在14 bp缺失。說明Rc基因極有可能是控制‘rm257’種皮顏色的目標基因。利用96份云南地方核心種質(zhì)材料對功能標記的通用性進行檢驗的結(jié)果表明，Rc基因在水稻紅色種皮顏色中的變異是相對保守的，且云南地區(qū)多數(shù)的白米地方種都表現(xiàn)出了Rc基因的缺失變異。