肖 俊，張桂芳，李艷芳，丁立云，徐先棟，傅義龍，饒 毅

（江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039）

腸道微生物在魚類生長過程中起著非常重要的作用，其平衡狀態(tài)關(guān)系到魚類機(jī)體的健康。正常的腸道微生物菌群對魚體有營養(yǎng)、免疫調(diào)節(jié)和抑制病原菌等作用。有研究表明，魚飼料中添加益生菌可以提高魚類生產(chǎn)性能和飼料利用率，增強(qiáng)免疫能力。

發(fā)酵中草藥是將中草藥以一種或多種優(yōu)選的益生菌作為菌種，在體外模擬腸道環(huán)境和中藥成分在體內(nèi)的消化分解過程，對提取的中藥有效成分進(jìn)行生物學(xué)轉(zhuǎn)化[1]。已有的研究證明發(fā)酵中草藥在促生長、增強(qiáng)水產(chǎn)動物非特異性免疫能力等方面優(yōu)于未發(fā)酵的中草藥[2-3]。中草藥經(jīng)益生菌發(fā)酵后，產(chǎn)生了更多的抑菌活性物質(zhì)，中草藥中的營養(yǎng)物質(zhì)有利于菌體的生長，因此益生菌和中草藥的協(xié)同作用使抑菌活性得到了增強(qiáng)[4]。目前的研究大部分都是集中在外源益生菌發(fā)酵中草藥上，從宿主體內(nèi)分離益生菌發(fā)酵中草藥的研究還很少。研究表明從宿主體內(nèi)篩選的益生菌能更好的適應(yīng)宿主體內(nèi)的環(huán)境并在宿主體內(nèi)定殖[5]，因此篩選原籍益生菌至關(guān)重要。試驗從健康的草魚腸道中分離原籍乳酸菌，確保菌株能很好地適應(yīng)草魚腸道的環(huán)境，發(fā)揮菌株的益生性，并對其生長、耐酸、耐鹽能力進(jìn)行分析，旨在篩選出性能穩(wěn)定、益生性好的菌株，為以后研究發(fā)酵中草藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗魚試驗用草魚來自江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所試驗基地魚池，平均體重約為450 g，體質(zhì)健壯。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑MRS 液體培養(yǎng)基、MRS 固體培養(yǎng)基、TaKaRa 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司、16SrDNA 基因引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成、藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司、HCl、NaOH、膽鹽等。

1.2 試驗方法

1.2.1 腸道乳酸菌的分離草魚腸道乳酸菌分離在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。將魚放在白色托盤中，用75%酒精擦拭魚體表，剖開魚腹，取出腸道?？v向剪開腸道，用PBS 緩沖液沖洗掉腸內(nèi)糞便，取少許腸道剪碎并用無菌生理鹽水沖洗2～3 次，放入MRS 液體培養(yǎng)基中30℃富集培養(yǎng)24 h。將富集培養(yǎng)液按 10-1 梯度稀釋至10-7 ，各取100 μL 稀釋液涂布含1% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣環(huán)的單菌落，再次劃線接種于MRS 固體培養(yǎng)基純化。取2次純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.2 細(xì)菌的16S r DNA 序列測定按TaKaRa 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，并以其為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，引物為通用引物，反應(yīng)體系為25 μL 體系。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對。

1.2.3 耐酸、耐膽鹽能力測試將鑒定為乳酸菌的菌株進(jìn)行耐酸、耐膽鹽能力測試試驗，測試方法參照向雙云[6]的方法進(jìn)行。

耐 酸 能 力 測 試 用1mol/L 的HCl 和1 mol/L 的NaOH將MRS液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)成2.0、3.0、4.0 共3 個處理組，將菌株按1%的接種量分別接種于3 個處理組中，每個處理組設(shè)3 個平行，30℃處理3 h，以不調(diào)節(jié)pH 值的MRS 液體培養(yǎng)基為對照。處理完畢后，每個處理組和對照組的菌液10 倍稀釋至合適的稀釋度，取3 個合適稀釋度菌液100 μL 分別涂布于MRS固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)菌落數(shù)，記錄結(jié)果，每個處理計算平均菌落數(shù)。試驗結(jié)束后按公式（1）計算乳酸菌的存活率。

存活率（%）=（處理組平均活菌數(shù) / 對照組平均活菌數(shù)）×100 （1）

耐膽鹽能力測試 在MRS 液體培養(yǎng)基中分別加入0.1%、0.2%、0.3%濃度的膽鹽后成3 個處理組，將菌株培養(yǎng)24 h 后的菌液按5%（v/v）接種于3 個處理組中，每個處理設(shè)3 個平行，30℃處理3 h，以不添加膽鹽的MRS 液體培養(yǎng)基為對照。處理完畢后，按耐酸能力測試的方法進(jìn)行平板菌落計數(shù)，計算乳酸菌的平均存活率。

1.2.4 生長曲線測定將耐酸、耐膽鹽能力強(qiáng)的菌株按1%的比例接種于MRS 液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，設(shè)3 個平行。從第2 h 開始，每隔2 h 取樣測定其OD600，以MRS 液體培養(yǎng)基為空白對照，記錄數(shù)據(jù)繪制生長曲線。

1.2.5 安全性測試將待測乳酸菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)12 h 至指數(shù)期后，10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用無菌生理鹽水重懸，再離心洗滌一次，最后制成濃度為108 CFU/mL 的菌懸液。選取體重為50.5±4.5 g 的健康草魚，分成10 尾一組。試驗組每尾草魚經(jīng)胸鰭基部注射0.2mL 菌懸液，設(shè)3個平行，對照組注射0.2 mL 無菌生理鹽水。注射后連續(xù)觀察7 d，統(tǒng)計各組草魚的存活狀況。

1.2.6 抑菌能力測試測試方法參照向雙云[6]的方法設(shè)計。選取大腸桿菌和維氏氣單胞菌為指示菌。在營養(yǎng)瓊脂平板上注入0.1 mL 指示菌菌液，用涂布器涂布均勻。在培養(yǎng)基表面垂直擺放牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基表面接觸無空隙。在杯中加入待測菌菌液，每株菌液做3 個平行。置于4℃冰箱中處理1 h后，再30℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。以牛津杯周圍沒有肉眼可見細(xì)菌生長區(qū)域為抑菌圈，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，取3 個平板的平均值。根據(jù)抑菌圈平均值判斷乳酸菌對大腸桿菌的敏感性。抑菌圈直徑小于10 mm 為不敏感，10～15 mm 為中度敏感，15 mm 以上為高度敏感。

1.2.7 藥敏測試按上述安全性測試的方法將待測菌株制成濃度為106 CFU/mL 的菌懸液，取100 μL 分別涂布于MRS 固體培養(yǎng)基上。采用藥敏紙片擴(kuò)散法，將紙片無菌操作均勻置于培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，測量各藥敏紙片抑菌圈的直徑，重復(fù)3 次試驗。根據(jù)敏感性標(biāo)準(zhǔn)判定各藥物對菌株的敏感性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS16.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行顯著性檢驗，P＜0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

從草魚腸道中分離出12 株乳酸菌，它們在MRS平板上的形態(tài)基本一致，均為圓形，乳白色，表面光滑濕潤，革蘭氏染色判定為陽性菌。16S r DNA序列測序結(jié)果顯示，其中8 株乳酸菌屬于乳球菌屬（Lactococcus），分別是6 株乳酸乳球菌（L.lactis），2 株格氏乳球菌（L.garvieae），4 株腸球菌屬（Enterococcus），均為糞腸球菌（E.faecalis）。格氏乳球菌為致病菌，乳酸乳球菌和糞腸球菌為益生菌，因此，選取2 株具有較強(qiáng)產(chǎn)酸能力的乳酸乳球菌（CR1、CR2）和2 株糞腸球菌（CR3、CR4）進(jìn)行益生效果評價。

2.2 乳酸菌生長曲線

從圖1 可以看出，試驗選取的4 株乳酸菌均于4 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期，OD600值快速上升，8 h 后生長達(dá)到高峰，進(jìn)入生長穩(wěn)定期。乳酸乳球菌CR1、CR2生長速率較糞腸球菌CR3、CR4 快，且4 h 后差異顯著（P＜0.05），表明乳酸乳球菌CR1、CR2 的生長性能相對較好。

圖1 乳酸菌的生長曲線

2.3 乳酸菌耐酸能力測定

從圖2 可以看出，試驗選取的4 株乳酸菌在pH值為4.0 的條件下存活率均在80%以上，差異不顯著（P＞0.05），隨著pH 值的降低，菌株的存活率均顯著下降，在pH 值為2.0 的條件下，菌株CR1、CR2、CR3 的存活率平均為26%、22%、30%，差異不顯著（P＞0.05），菌株CR4 的存活率為0，顯著低于CR1、CR2、CR3（P＜0.05），表明CR4 對酸的耐受能力較弱。

圖2 乳酸菌對酸的耐受試驗

2.4 乳酸菌耐膽鹽能力測定

從圖3 中可以看出，試驗選取的4 株乳酸菌存活率隨膽鹽濃度增加而降低，其中，菌株CR2 的存活率顯著低于CR1 和CR3（P＜0.05），在膽鹽濃度增加到0.3%時，CR2 的存活率低于10%，表明菌株CR2 對膽鹽耐受能力較差。

圖3 乳酸菌對膽鹽的耐受試驗

2.5 乳酸菌安全性測定

注射乳酸菌菌懸液后，4 株乳酸菌試驗組和對照組草魚都未出現(xiàn)死亡，將試驗魚解剖，發(fā)現(xiàn)試驗組和對照組草魚內(nèi)臟均正常無病變，表明4 株乳酸菌都安全。

2.6 乳酸菌抑菌能力測試

從表1 中可以看出，4 株乳酸菌對大腸桿菌均表現(xiàn)了高度敏感的抑制效果。CR1 和CR4 對維氏氣單菌也表現(xiàn)出了高度敏感的抑制作用，CR2、CR3 對維氏氣單菌為中度敏感。

表1 4 株乳酸菌菌株的抑菌能力測試結(jié)果

2.7 乳酸菌藥敏測試

從表2 中可以看出，4 株乳酸菌對不同的抗生素表現(xiàn)出了不同的敏感性。菌株CR1 對9 種抗生素中的7種敏感，對恩諾沙星中度敏感，僅對丁胺卡那耐藥。CR2、CR3 和CR4 等3 株菌株都僅對其中4～5 種抗生素敏感，對恩諾沙星、頭孢他啶和丁胺卡那都表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。

表2 乳酸菌藥敏測試結(jié)果

3 討 論

3.1 乳酸菌分離鑒定

乳酸菌是水產(chǎn)動物消化道中的亞優(yōu)勢種，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等益生作用[7-9]。目前已有較多研究從魚腸道中分離得到乳酸菌，如楊媛媛等[10]從健康鯽魚腸道內(nèi)分離鑒定出38 株乳酸菌，分別屬于乳球菌屬、明串珠菌屬、肉食桿菌和腸球菌屬；Soltani 等[11]從波斯鱘的腸道中分離鑒定出47 株乳酸菌，分別為乳酸乳球菌、韋斯氏菌、戊糖片球菌和糞腸球菌；Ring 等[12]從大西洋鮭魚、嘉魚等4 種魚腸道中分離鑒定出11株乳酸菌株，均屬于肉食桿菌。從以上研究中看出，不同的魚腸道中分離出的乳酸菌有些相同有些也存在差異，本研究從草魚腸道中分離出的12 株乳酸菌分別屬于乳球菌屬和腸球菌屬，與以上的研究也不盡相同，這可能是由于研究者的研究方法存在差異，也與魚類的食性以及生存環(huán)境有很大的關(guān)系。

3.2 乳酸菌生長特性

腸道中乳酸菌只有達(dá)到一定數(shù)量的時候，才能改善和調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)微生物菌群的平衡，產(chǎn)生對宿主健康有益的作用[13]，不同來源的乳酸菌的生長速度會有差異，同一來源的乳酸菌由于菌株本身的特性，在生長速度上也會有所不同[6]，所以生長速度也是乳酸菌產(chǎn)生作用的重要條件之一。楊靜等[14]研究表明植物乳桿菌及糞腸球菌分別培養(yǎng)了6 h 和8 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期，分別于18 h 和16 h 后吸光值達(dá)到最大；王紅濤[15]的研究也發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌與屎腸球菌分別于4 h和8 h 進(jìn)入對數(shù)生長期，分別于30 h 和12 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期。研究中選取的乳酸菌于4 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期，8 h 后進(jìn)入生長穩(wěn)定期，對比上述研究來看生長速度均比較快。4 株乳酸菌中CR1、CR2 生長速率較CR3、CR4 快，表明CR1、CR2 顯示了更好的生長特性。

3.3 乳酸菌耐酸耐膽鹽

耐酸和耐膽鹽能力是影響乳酸菌發(fā)揮益生功效的重要影響因素，乳酸菌必須具有較強(qiáng)的耐酸能力才能順利通過胃中的酸性環(huán)境而到達(dá)腸道中發(fā)揮其益生功能[16]，進(jìn)入小腸將會面臨高濃度的膽鹽環(huán)境，高濃度膽鹽會破壞細(xì)胞膜正常結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜蛋白解離，使細(xì)胞內(nèi)容物滲漏而造成細(xì)胞死亡[17]。從耐酸耐膽鹽試驗結(jié)果可以看出，從草魚腸道分離出的乳酸菌都能很好的適應(yīng)腸道環(huán)境，但在低pH 值以及高膽鹽脅迫下，菌株的耐酸耐膽鹽能力還是會出現(xiàn)顯著差異，這與鄒建華等[18]的研究結(jié)果相似。

3.4 乳酸菌抑菌能力

對致病菌的抑制作用也是評價乳酸菌產(chǎn)生作用的重要條件之一。乳酸菌會產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、過氧化氫、細(xì)菌素等多種物質(zhì)來抑制致病菌的生長[19-20]，同時促進(jìn)腸道蠕動，加速病原菌排除體外[21-22]，從而可以起到調(diào)節(jié)腸道微生物生態(tài)平衡、維護(hù)腸道健康等作用。Sahoo 等[23]研究從南亞野鯪和真卡特拉鲃腸道分離獲得的5 株乳酸菌的抑菌能力，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌等8 株指示菌均有很強(qiáng)的抑制作用；高擎等[24]研究報道，11 株乳酸菌對大腸桿菌 K88、K99、雞白痢沙門菌指示菌均有不同程度的抑制作用。本研究用大腸桿菌和維氏氣單胞菌對4 株乳酸菌進(jìn)行抑菌能力測試，結(jié)果顯示4 株菌株對大腸桿菌均有很強(qiáng)的抑制作用，CR1 和CR4 對維氏氣單菌也表現(xiàn)出了高度敏感的抑制作用，CR2、CR3 對維氏氣單菌僅為中度敏感。說明從草魚腸道分離的4 株乳酸菌和其他大部分乳酸菌一樣，對常見病原菌具有抑制作用。

3.5 乳酸菌藥敏測試

耐藥性評價是益生乳酸菌應(yīng)用安全性評價的首要內(nèi)容[25]。乳酸菌的耐藥性有其有利的一面，如乳酸菌和抗生素一起使用時，可使乳酸菌存活于宿主腸道，幫助宿主恢復(fù)腸道菌群平衡[26]。但其耐藥基因可以各種方式在腸道菌群間相互傳遞，從而導(dǎo)致致病菌也獲得耐藥性，危害宿主健康[27]。該研究分離的4 株乳酸菌對不同的抗生素表現(xiàn)出了不同的敏感性。菌株CR1對9 種抗生素中的7 種敏感，對恩諾沙星中度敏感，僅對丁胺卡那耐藥。CR2、CR3 和CR4 等3 株菌株都僅對其中4～5 種抗生素敏感，對恩諾沙星、頭孢他啶和丁胺卡那都表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。近年來，抗生素和有益菌的聯(lián)合或配合應(yīng)用已成為飼料添加劑研究的熱點。恩諾沙星是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中較常用于治療細(xì)菌性疾病的內(nèi)服藥，研究分離的乳酸菌對恩諾沙星存在一定程度的耐藥性，在治療過程中不會被殺滅，可作為益生菌應(yīng)用到實際生產(chǎn)中。

4 結(jié) 論

從草魚腸道分離了4 株乳酸菌，對其生長速度、耐酸、耐膽鹽、安全性、抑菌能力和藥物敏感度進(jìn)行測試。結(jié)果表明4 株乳酸菌中，乳酸乳球菌CR1 具有較好的益生特性，可作為發(fā)酵漁用中草藥飼料添加劑的益生菌。