李亞暉，羅勝軍，唐興剛，袁明貴，魏琦麟，婁 華，向 蓉,3

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省中獸藥工程技術(shù)研究中心，廣州 510640；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000)

天然植物富含多種活性成分，如黃酮、多糖、生物堿、皂苷、揮發(fā)油等[1],這些活性物質(zhì)大多具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等生物活性[2]，且具有天然環(huán)保無殘留，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[3]，在當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)減抗替抗的形勢(shì)下成為替抗產(chǎn)品最佳選擇之一，在養(yǎng)殖中已有大規(guī)模使用[4]。牡荊屬植物(VitexL.)是馬鞭草科(Verbenaceae)牡荊亞科植物[5]，在中國分布廣泛，種類多樣性豐富。牡荊屬植物已被證實(shí)有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、祛痰平喘、抑菌等藥理作用[6]。國內(nèi)外學(xué)者在牡荊屬植物，尤其是該屬穗花牡荊、黃荊等的化學(xué)成分和生物活性方面做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)牡荊屬植物含有大量的黃酮類[7]，是牡荊屬植物中重要的活性成分，包括黃酮類(L1)和查耳酮(L2)等結(jié)構(gòu)類型[8]。而目前在中國分布廣泛的牡荊(VitexnegundoL. var.cannabifolia(Sieb. et Zucc.) Hand.-Mazz. (V.negundo))相關(guān)研究較少，其活性研究也不夠深入。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所獸藥研發(fā)中心課題組前期針對(duì)牡荊提取物化學(xué)成分分析的研究中已確定的成分以黃酮類化合物為主，鑒于植物中總黃酮易溶于有機(jī)溶劑[9]，本研究采用乙醇加熱回流法提取牡荊中總黃酮，以乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比為因素，運(yùn)用正交試驗(yàn)，確定牡荊提取物的最佳制備工藝，并探討牡荊提取物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌活性，為牡荊提取物制劑的制備及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物與菌株

牡荊采自廣東省河源市，蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：A05GB144263)購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%；產(chǎn)氣莢膜梭菌G型為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所獸藥研究室凍存。

1.2 主要試劑及儀器

亞硝酸鈉 (批號(hào):20120314)、硝酸鋁(批號(hào):21050903-2)、氫氧化鈉(批號(hào):200514)、乙醇(批號(hào)：2019120203)、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(批號(hào)：028030)、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)(批號(hào)：028020)均購自廣州市叢源儀器有限公司。

UV1780紫外分光光度計(jì)購自蘇州島津儀器有限公司；00000246號(hào)萬分之一電子天平購自北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋購自常州奧華儀器有限公司；DHZ-3D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自重慶雅馬拓科技有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 溶液配制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇適量，水浴40 ℃使其溶解，冷卻至室溫后加60%乙醇至刻度，搖勻，得蘆丁儲(chǔ)備液。精密量取5.00 mL蘆丁儲(chǔ)備液，置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(含蘆丁0.2 mg/mL)。精密稱取牡荊粉末1.00 g，加入80%乙醇溶液50 mL，加熱回流，過濾取上清液棄藥渣，即得供試品溶液。

1.4 總黃酮含量的測(cè)定

參考向蓉[10]方法，利用NaNO2-AL(NO3)3-NaOH顯色法進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定。 精密量取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.00 mL，加5%亞硝酸鈉(50 mg/mL)溶液1.00 mL，混勻，放置6 min；再加10%硝酸鋁溶液(100 mg/mL)1.00 mL，搖勻，放置6 min；加NaOH溶液(40 mg/mL)10.00 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白。 在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

精密量取一定體積的供試品溶液,按上述顯色法操作后測(cè)定吸光度，將所得值代入回歸曲線方程,再按下列公式計(jì)算出所稱取的牡荊樣品中總黃酮含量。

式中，X，回歸線方程所得值(mg/mL)；n，稀釋倍數(shù)；v，樣液總體積(mL)；V，測(cè)定取樣體積(mL)；W，樣品質(zhì)量(mg)。

1.5 方法學(xué)考察

分別從精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率對(duì)1.4已建立的方法進(jìn)行方法學(xué)考察。①精密度試驗(yàn)：顯色后的供試液連續(xù)測(cè)6次吸光度，計(jì)算總黃酮濃度。②穩(wěn)定性試驗(yàn)：供試液分別于顯色0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)吸光度，計(jì)算總黃酮濃度。 ③重復(fù)性試驗(yàn)：制備6份供試液，測(cè)定6份供試液的吸光度，計(jì)算總黃酮的濃度，重復(fù)3次。 ④加樣回收率試驗(yàn)：平行制備6份供試液，平均分成3組，各取5.0 mL(內(nèi)含3 mg總黃酮)分別加入一定量的對(duì)照品，使加入量分別約為化合物原始含量的80%、100%和120%，測(cè)定其吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.6 單因素試驗(yàn)

牡荊總黃酮提取的基本條件為：乙醇濃度60%、提取時(shí)間1.5 h、提取溫度60 ℃、料液比1∶10。單因素試驗(yàn)條件：乙醇濃度分別設(shè)定為40%、50%、60%、70%、80%和90%；提取時(shí)間分別設(shè)定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h。提取溫度分別設(shè)定為40、50、60、70、80和90 ℃；料液比分別設(shè)定為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35。分別考察乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度和料液比對(duì)牡荊總黃酮提取量的影響。

1.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素的最優(yōu)工藝水平，選擇乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、料液比(D)作為考察因素，以牡荊總黃酮的提取量作為考察指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)(表1)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最佳工藝條件下的乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.9 抑菌試驗(yàn)

復(fù)蘇純化后的產(chǎn)氣莢膜梭菌，挑取單菌落接種至FT培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)5 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。采用滅菌空白培養(yǎng)基校正菌液濃度，使活菌數(shù)為1×106CFU/mL，制成菌懸液。

取96孔培養(yǎng)板，在96孔板每孔中加入100 μL FT液體培養(yǎng)基。在第1～7行(A～G)的第1列中，加入牡荊提取液100 μL，按2倍稀釋原則逐級(jí)分別稀釋至250、125、62.5、31.25、15.63、7.81和3.91 μg/mL。第1～6行(A～F)中，每孔加入100 μL菌懸液,第7行(G)為陰性對(duì)照組，第8行(H)為空白對(duì)照組。在37 ℃生化培養(yǎng)箱中厭氧孵育24 h，觀察96孔板中有無菌落生長(zhǎng)。考察在最佳工藝條件下提取的牡荊提取物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的最小抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，回歸方程為：y=11.496x+0.0463，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Stand curve of Rutin

2.2 方法學(xué)考察

依照方法學(xué)考察要求，分別進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率考察。精密度試驗(yàn)RSD=0.177%，表明該儀器的精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)在50 min時(shí)RSD=2%，說明供試品溶液在50 min內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)的RSD=0.94%，符合要求，說明該方法的重復(fù)性良好。加樣回收率分別為101.55%、102.56%、104.44%，RSD=1.42%。以上方法學(xué)考察結(jié)果均符合要求，表明牡荊總黃酮含量測(cè)定方法成立。

2.3 單因素試驗(yàn)

由圖2A可知，隨著乙醇濃度升高牡荊提取液總黃酮含量先升后降，乙醇濃度為60%時(shí)總黃酮含量最高(31.10 mg/g)。由圖2B可知，隨著提取溫度升高牡荊提取液中總黃酮含量逐漸降低，提取溫度為40 ℃時(shí)，總黃酮含量最高(30.69 mg/g)。 由圖2C可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)牡荊提取液中總黃酮含量先降后升再降，提取時(shí)間為2.5 h時(shí)總黃酮含量最高(30.69 mg/g)。 由圖2D可知，隨著料液比的增加牡荊提取液總黃酮含量基本呈先升后降趨勢(shì)，在料液比為1∶35時(shí)，總黃酮含量最高(44.35 mg/g)。

2.4 正交試驗(yàn)

由表2可知，最佳提取工藝條件組合為：A3B2C3D3，即乙醇濃度60%、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間2.5 h、料液比為1∶35，由RD>RC>RA>RB得其因素影響順序?yàn)椋毫弦罕?提取時(shí)間>乙醇濃度>提取溫度。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最佳工藝條件進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，在最佳提取工藝條件下3次驗(yàn)證試驗(yàn)提取物總黃酮含量分別為46.23、45.28和46.16 mg/g，平均可達(dá)45.89 mg/g，RSD為1.15%，具有較好的重復(fù)性。

2.6 抑菌試驗(yàn)

牡荊提取物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC檢測(cè)結(jié)果見表3。由表3可知，牡荊提取物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有較好的抑制效果，MIC值為7.81 μg/mL。

圖2 乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)和料液比(D)對(duì)牡荊提取液總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration (A),extraction temperature (B),extraction time (C) and solid-liquid ratio (D) on total flavonoids content of V. negundo extract

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

3 討 論

黃酮類化合物是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類低分子質(zhì)量的天然物質(zhì)[11],廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實(shí)中,且具有廣譜抑菌性[12]，多種耐抗生素的細(xì)菌依然對(duì)其敏感，且該類化合物不易產(chǎn)生耐藥性[13]。牡荊屬植物中普遍存在黃酮類化合物,從該屬植物中已獲得的黃酮類化合物有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查耳酮、二氫查耳酮以及黃烷醇種結(jié)構(gòu)類型共49個(gè)化合物,其中16個(gè)為黃酮苷類[14]。孫阿寧等[15]在牡荊素對(duì)葡聚糖硫酸鈉所誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的藥效試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，牡荊素能有效減輕小鼠試驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎,緩解炎癥反應(yīng)。 所以本試驗(yàn)以總黃酮提取量作為主要考察指標(biāo)。

黃酮類化合物多為結(jié)晶性固體，少數(shù)為無定型粉末，不溶于水或難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑[16]，目前最常用的有甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯[17]等有機(jī)溶劑,由于乙醇無毒性、價(jià)格低廉,所以本試驗(yàn)選擇采用乙醇加熱回流對(duì)牡荊進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。由正交結(jié)果及方差分析可知，乙醇加熱回流提取牡荊總黃酮的最優(yōu)工藝為乙醇濃度60%、提取時(shí)間2.5 h、提取溫度50 ℃、料液比為1∶35，其因素影響順序?yàn)榱弦罕?提取時(shí)間>乙醇濃度>提取溫度。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在最優(yōu)提取工藝下，總黃酮提取量平均可達(dá)45.89 mg/g。代現(xiàn)平等[18]在山牡荊總黃酮提取工藝試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，黃酮提取量平均為39.63 mg/g，本試驗(yàn)的牡荊總黃酮的提取量相對(duì)較高。黃瓊[19]在牡荊揮發(fā)油和黃酮提取工藝試驗(yàn)中得出微波法的提取效果最好，微波法有節(jié)省提取時(shí)間和試劑、污染小的優(yōu)點(diǎn),但對(duì)設(shè)備有一定的要求,而且一次性提取的物料較少,不能進(jìn)行大規(guī)模的提取。同時(shí)在微波法下考察不同部位總黃酮提取量中，葉的提取量最高，達(dá)93.30 mg/g，莖最低，為31.89 mg/g。本試驗(yàn)所用牡荊為地上部分，總黃酮提取量相對(duì)單獨(dú)牡荊葉的提取量較低，但是因?yàn)槟登G地上部分產(chǎn)量大，采摘方便，乙醇加熱回流也可以滿足大量提取，所以本試驗(yàn)的提取方法更適用于實(shí)際生產(chǎn)中。本提取工藝不足之處在于乙醇用量相對(duì)較多，在實(shí)際生產(chǎn)中成本較高。

黃酮類化合物具有廣泛抑菌性[20]，但是從應(yīng)用的角度來看，MIC值<100 μg/mL的黃酮類化合物才具有一定的價(jià)值，MIC值<10 μg/mL的黃酮類化合物會(huì)引起人們更大的關(guān)注[21]。而產(chǎn)氣莢膜梭菌作為一種多產(chǎn)毒素產(chǎn)生菌，是引起人和動(dòng)物壞死性腸炎的主要病原體[22]，由其引起的雞壞死性腸炎給全世界的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為家禽養(yǎng)殖中最重要的腸道疫病之一的病原體[23]。 在本試驗(yàn)中，最優(yōu)提取工藝下的牡荊提取物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC值為7.81 μg/mL。段凱文等[24]在中藥及組方對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌體外抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃連的抗菌活性最強(qiáng)，MIC值為0.98 mg/mL,本試驗(yàn)中牡荊提取物的抑菌濃度相對(duì)更低。蘇皓瑀等[25]在酸化劑及其衍生物與植物精油復(fù)合使用的體外抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，復(fù)合精油對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC值為312.50 μg/mL，植物精油與單月桂酸甘油酯復(fù)合物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌體外抑菌效果最好，MIC值為4.88 μg/mL。本試驗(yàn)的抑菌試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于單獨(dú)使用復(fù)方精油的試驗(yàn)結(jié)果，但不如酸化劑和植物精油復(fù)合物的抑菌試驗(yàn)結(jié)果。相較之下，牡荊提取物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外抑菌能力可觀，有作為新型獸藥或飼料添加劑進(jìn)行開發(fā)的潛力。

4 結(jié) 論

牡荊在乙醇濃度60%、提取時(shí)間2.5 h、提取溫度50 ℃、料液比為1∶35的提取工藝條件下總黃酮含量最高，可達(dá)45.89 mg/g，該條件下的牡荊提取物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC值為7.81 μg/mL，有較好的抑菌效果。