周 偉，劉旭平,張艷敏,彭雯娟，趙 亮,,譚文松,

(1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2.上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203)

斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(post weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)于1991年在加拿大西部首次被發(fā)現(xiàn)，此后在亞洲、歐洲、美國和墨西哥也相繼被報道。 在20世紀90年代中期，豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)被確認為PMWS的病原體，也是所有主要養(yǎng)豬國最重要的病毒性病原體之一。感染PCV2后尚無有效治療藥物，只有通過提前接種疫苗進行預防。目前，商業(yè)化的豬圓環(huán)病毒疫苗主要有滅活疫苗和亞單位疫苗，另外還有部分新型疫苗尚處于試驗研究階段[1]。國內(nèi)亞單位疫苗核心技術仍掌握在外企手中，導致價格居高不下，豬場普及率較低。PCV2滅活疫苗因具有安全、穩(wěn)定以及價格便宜等優(yōu)點，被眾多養(yǎng)豬場采用。但是目前國內(nèi)滅活疫苗抗原的主要生產(chǎn)方式仍然是滾瓶貼壁培養(yǎng)或微載體懸浮培養(yǎng)PK-15細胞增殖PCV2[2]。滾瓶貼壁培養(yǎng)和微載體懸浮培養(yǎng)均依賴于細胞的貼壁生長，放大規(guī)模受限；貼壁培養(yǎng)過程依賴動物源成分血清，增加了工藝成本，且易引起批間差異和污染。除此之外，貼壁培養(yǎng)無法對工藝過程進行實時監(jiān)控，存在可重復性差的缺陷。截至目前國內(nèi)在PCV2疫苗制備的無血清懸浮培養(yǎng)工藝上尚屬空白，仍有較大的發(fā)展空間[3-6]。2011年中國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的1708號公告中明確指出滾瓶等傳統(tǒng)方式生產(chǎn)的獸用疫苗生產(chǎn)線將停止受理GMP申請[7]。因此，開發(fā)高效的懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)工藝對豬圓環(huán)病毒疫苗產(chǎn)業(yè)升級具有重大意義。

無血清懸浮培養(yǎng)工藝需有馴化成功的懸浮PK-15細胞株以及合適的培養(yǎng)工藝參數(shù)，故細胞馴化和工藝開發(fā)是工藝建立過程中的重要步驟。張瑞永等[8]通過馴化貼壁PK-15細胞適應低血清生長環(huán)境，成功建立了低血清培養(yǎng)工藝，病毒滴度達106.375TCID50/mL。華濤等[9]利用微載體培養(yǎng)PK-15細胞并優(yōu)化微載體工藝參數(shù)，使病毒滴度達107.25TCID50/mL，但細胞貼附在微載體上需多次消化傳代，增加了工藝復雜度，從而一定程度上限制了其工業(yè)化應用。

目前，國內(nèi)多數(shù)PCV2疫苗生產(chǎn)仍以含血清工藝為主，且尚缺乏懸浮PK-15細胞株，規(guī)模放大受限，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定且生產(chǎn)成本偏高，間接導致國內(nèi)豬場疫苗普及率較低。為了提高病毒產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，本研究利用無血清懸浮培養(yǎng)PK-15細胞增殖PCV2，并對PCV2增殖的工藝參數(shù)和細胞代謝特性進行了初步研究，以期為建立工業(yè)化大規(guī)模無血清懸浮培養(yǎng)PK-15細胞生產(chǎn)PCV2工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株與病毒株

PK-15細胞購自中國食品藥品檢定研究院細胞資源保藏研究中心；PCV2由廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基Proli-S001S均購自上海倍諳基生物科技有限公司；胰蛋白酶購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自BIOSUN公司；葡萄糖試劑盒購自上海榮盛生物技術有限公司；乳酸和尿素氮試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；一抗Anti-PCV2 NC Monoclonal Antibody(JNT0301)購自MEDIAN公司；二抗熒光素標記的小鼠IgG抗體購自KPL公司。細胞培養(yǎng)方瓶與搖瓶購自Corning公司；二氧化碳培養(yǎng)箱(Heracell 150i)購自Thermo公司；軌道式搖床(OS-100)購自Allsheng公司；細胞計數(shù)儀(IC-1000)購自上海睿鈺生物科技有限公司；生化分析儀(BP100PLUS)購自Nova公司；1260 HPLC系統(tǒng)和C18氨基酸分析柱均購自Aglient公司；倒置熒光顯微鏡(Eclipse 80i)購自Nikon公司。

1.3 PK-15細胞培養(yǎng)、馴化及馴化細胞的生長特性

1.3.1 PK-15細胞貼壁培養(yǎng)與無血清懸浮馴化 用DMEM+10% FBS培養(yǎng)基復蘇PK-15細胞，待匯合度達到90%時進行傳代，傳代比例為1∶4。將培養(yǎng)2 d且細胞匯合度達到90%的貼壁PK-15細胞經(jīng)0.25%胰酶消化成單個細胞后，終止消化并離心去上清，而后使用Proli-S001S培養(yǎng)基重懸并置于搖床上130 r/min振蕩培養(yǎng)，馴化初期，需對培養(yǎng)體系進行沉降換液(4 ℃)以去除培養(yǎng)環(huán)境中的代謝副產(chǎn)物并補充新鮮培養(yǎng)基。 馴化后期，以1.0×106/mL細胞密度進行稀釋傳代。每隔1 d取樣檢測活細胞密度(viable cell density,VCD)和細胞活率(viability,Via)并計算每天細胞的比生長速率變化。使用0.4 g/L臺盼藍染色液與細胞液等比例混合(100 μL細胞液加100 μL染色液)，而后將混合液加入細胞計數(shù)板中，使用IC1000細胞計數(shù)儀計數(shù)，計算細胞活率與比生長速率。

Via=Xv/(Xv+Xd)×100%

式中：Xv表示活細胞密度(mL-1)；Xd表示死細胞密度(mL-1)。

式中：μ代表比生長速率(d-1)，Xv2和Xv1分別對應時間t2和t1時的活細胞密度(mL-1)，當μ>0時代表比生長速率，當μ<0時代表比死亡速率。Δt=t2-t1(d)。

1.3.2 懸浮PK-15細胞連續(xù)傳代和生長曲線測定 懸浮PK-15細胞連續(xù)傳代：取馴化成功且處于對數(shù)生長期的懸浮PK-15細胞，以1.0×106/mL的細胞密度接種于125 mL搖瓶中，培養(yǎng)體積為30 mL，每2 d取樣檢測活細胞密度和細胞活率并進行稀釋傳代，連續(xù)傳代15次。生長曲線測定：批培養(yǎng)模式下，以1.0×106/mL的細胞密度接種于125 mL搖瓶中，培養(yǎng)體積為30 mL，每隔24 h取樣，并檢測活細胞密度和細胞活率,細胞密度和活率隨時間變化曲線即為細胞生長曲線。

1.4 PCV2增殖條件摸索

1.4.1 感染復數(shù)摸索 取對數(shù)生長期的懸浮PK-15細胞，以1.0×106/mL接種于125 mL搖瓶中，培養(yǎng)體積為30 mL。分別按感染復數(shù)(MOI)為0.10、0.05、0.01和0.001換算出相應病毒液體積，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每隔24 h取樣，檢測活細胞密度、細胞活率，并在病毒感染后72 h留取無菌樣，根據(jù)Karber法計算病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)[10]。當TCID50最大時，其對應的感染復數(shù)即為最佳增殖條件。

1.4.2 細胞接種密度摸索 取對數(shù)生長期的懸浮PK-15細胞以1.0×106/mL(CDI-1)、3.0×106/mL(CDI-3)和5.0×106/mL(CDI-5)接種于125 mL搖瓶中，培養(yǎng)體積為30 mL。接種前均離心全量換液，并用新鮮培養(yǎng)基重懸。分別按最佳感染復數(shù)加入相應病毒液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。 每隔24 h取樣，檢測活細胞密度、細胞活率。在病毒感染后72 h留取無菌樣檢測TCID50。

1.5 病毒感染前后細胞代謝分析

1.5.1 病毒感染前后細胞代謝物差異分析 細胞接種病毒前(對照組)后(感染組)，在0、24、48、72、96 h取樣，10 000 r/min離心5 min，取上清。用試劑盒檢測培養(yǎng)過程中葡萄糖(Glu)、乳酸(Lac)和氨的濃度；以鄰苯二甲醛-氯甲酸芴甲酯(OPA-FMOC)為衍生試劑對樣品中的氨基酸進行在線色譜分析[11]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

細胞密度、細胞活率、比生長速率、葡萄糖濃度、谷氨酰胺濃度、乳酸濃度和氨濃度結果用平均值±標準差表示，病毒滴度采用JMP13軟件中的Turkey-Kremer進行均值的統(tǒng)計檢驗，氨基酸代謝速率結果采用JMP13進行獨立樣本t檢驗。用Origin pro 2017軟件進行繪圖。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 PK-15細胞的無血清懸浮馴化及其生長特性

2.1.1 PK-15細胞的無血清懸浮馴化結果 馴化期間細胞生長狀態(tài)及比生長速率如圖1所示。馴化初期活細胞密度為1.0×106/mL，比生長速率為0.1 d-1左右，但細胞活率>90%。馴化中期，細胞逐漸適應Proli-S001S培養(yǎng)基，活細胞密度較馴化初期明顯提高，且細胞活率仍然>90%，在此期間細胞比生長速率由0.1 d-1緩慢增加到0.3 d-1。馴化后期，細胞比生長速率由0.3 d-1逐漸增加至0.6 d-1，且生長狀態(tài)較為穩(wěn)定。說明經(jīng)過30 d的直接馴化，PK-15細胞能夠完全適應無血清懸浮培養(yǎng)體系。

2.1.2 馴化PK-15細胞的生長特性 由圖2A可知，懸浮PK-15細胞每2 d傳1代，代次之間細胞生長穩(wěn)定，傳15代次未出現(xiàn)明顯的生長衰減，且傳代過程中細胞活率始終維持在90%以上。由圖2B可知，以1.0×106/mL接種后峰值活細胞密度在第4天出現(xiàn)，可達6.2×106/mL，且在第4天之前，細胞活率均>90%，但在峰值活細胞密度下僅能維持1 d左右，第4天后活細胞密度與細胞活率均開始快速下降。

圖1 PK-15細胞馴化過程中生長狀態(tài)(A)和比生長速率(B)變化情況Fig.1 Changes of growth status (A) and specific growth rate (B) of PK-15 cells during acclimation

圖2 懸浮PK-15細胞傳代穩(wěn)定性(A)和生長(B)情況Fig.2 Passage stability (A) and growth (B) of suspension cultured PK-15 cells

2.2 PCV2在無血清懸浮培養(yǎng)PK-15細胞上增殖條件摸索

2.2.1 不同感染復數(shù)對PCV2增殖影響 由圖3A可知，在感染后0～24 h，各組細胞生長狀態(tài)相似，細胞生長幅度接近。在感染24 h后，隨著感染復數(shù)的降低，活細胞密度升高。各組活細胞密度均在感染72 h附近達到峰值，隨后活細胞密度開始下降。細胞活率在感染48 h附近開始低于90%。由圖3B可知，當感染復數(shù)為0.05時，最終收獲的病毒滴度可達到最大，為105.8TCID50/mL。因此后續(xù)試驗感染復數(shù)均采用0.05。

2.2.2 不同細胞接種密度對PCV2增殖影響 在最佳感染復數(shù)為0.05的基礎上考察不同細胞接種密度對病毒增殖的影響。由圖4A可知，當細胞接種密度為1.0×106/mL時，在感染后72 h內(nèi)細胞仍能維持生長，細胞活率緩慢下降。感染72 h后活細胞密度及活率快速下降。3.0×106/mL和5.0×106/mL組在感染24 h后細胞密度和活率開始快速下降。由圖4B可知，增加細胞接種密度并不能有效地提高PCV2滴度，最佳細胞接種密度為1.0×106/mL，此時病毒滴度可達106.2TCID50/mL。

肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖3 不同感染復數(shù)組細胞生長(A)和PCV2增殖(B)情況Fig.3 Cell growth (A) and PCV2 proliferation (B) in different MOI groups

圖4 不同細胞接種密度組細胞生長(A)和PCV2增殖(B)情況Fig.4 Cell growth (A) and PCV2 proliferation (B) in different CDI groups

2.3 病毒感染前后細胞代謝分析

2.3.1 病毒感染前后細胞代謝物差異 由圖5可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組葡萄糖和谷氨酰胺濃度逐漸降低，同時伴隨相應代謝副產(chǎn)物乳酸和氨的生成(圖5A)。與對照組相比，感染組環(huán)境中各物質(zhì)濃度變化明顯加快，在72 h附近感染組出現(xiàn)了葡萄糖和谷氨酰胺耗竭，且乳酸由生成轉(zhuǎn)為消耗(圖5B)。通過對比可發(fā)現(xiàn)，在96 h時，感染組中副產(chǎn)物氨濃度高于同期對照組約 5 mmol/L。

圖5 細胞感染病毒前(A)后(B)代謝差異對比Fig.5 Comparison of metabolic differences before (A) and after (B) cell infection with virus

2.3.2 病毒感染前后細胞代謝速率差異 由表1可知，在0～24 h，感染組細胞對葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的比消耗或比生成速率分別提高了127.8%、139.9%、355.1%和294.8%。 在24～48 h葡萄糖和谷氨酰胺作為能源物質(zhì)仍然被快速消耗，然而除葡萄糖外2組細胞對乳酸、谷氨酰胺和氨之間的差異有明顯下降。在48～72 h期間，葡萄糖、谷氨酰胺和氨的代謝速率差異進一步縮小，但乳酸代謝途徑開始發(fā)生變化。在72～96 h，對照組細胞代謝速率快于感染組，且乳酸代謝速率差異進一步擴大。

由圖6可知，與對照組相比，感染組細胞對各氨基酸代謝速率均顯著加快，Asn、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Tyr、Val、Met、Trp、Ile和Leu的比消耗速率分別比對照組提高了39.9%、114.4%、36.4%、411.9%、78.1%、42.7%、132.7%、160.9%、84.5%、81.3%、126.4%和126.8%，而Asp、Glu和Lys呈現(xiàn)出完全相反的代謝特性，對照組表現(xiàn)為細胞消耗，而感染組則出現(xiàn)生成。Ala在2組細胞中表現(xiàn)出代謝同向性，且對照組細胞代謝速率大于感染組。感染組和對照組細胞對Cys和Phe代謝速率非常接近。

表1 不同時間段感染病毒前后細胞對葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的代謝速率變化

**,差異極顯著(P<0.01)**,Extremely significant differences (P<0.01)圖6 細胞感染病毒前后氨基酸代謝速率Fig.6 Metabolism rate of amino acids before and after cell infection with virus

3 討 論

在動物細胞無血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)PCV2過程中，懸浮細胞的馴化、生產(chǎn)工藝參數(shù)以及培養(yǎng)過程的各營養(yǎng)物代謝等因素均會對病毒增殖產(chǎn)生影響。細胞作為生產(chǎn)全過程的起點，對工藝過程的培養(yǎng)模式及生產(chǎn)能力具有決定性作用。劉天倫等[12]通過梯度降血清連續(xù)傳代馴化貼壁PK-15細胞，馴化期間共采用3種培養(yǎng)方法，共需傳代23次。本研究采用直接馴化法，無需逐步替代培養(yǎng)體系，且馴化過程僅耗時30 d，過程操作較為簡便。閃伊紅等[13]用微載體培養(yǎng)PK-15細胞增殖PCV2，種子細胞擴增過程需微載體、血清及胰酶等額外的試劑和耗材，并且當反應器規(guī)模增大時，種子貼壁擴增階段的規(guī)模也會大大增加，對工藝過程提出了更大挑戰(zhàn)。本研究結果表明，無血清懸浮培養(yǎng)具有較高的活細胞密度及生長速率，規(guī)模放大過程僅需線性放大培養(yǎng)體積即可，操作簡便且染菌風險大大降低。 說明懸浮PK-15細胞株在操作過程及規(guī)模放大過程中均有非常明顯的優(yōu)勢。

病毒生產(chǎn)工藝過程涉及多個工藝參數(shù)的影響，其中感染復數(shù)和細胞接種密度的確定對工藝至關重要。梁武等[14]通過對工藝參數(shù)的摸索和優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當感染復數(shù)為0.5、細胞接種密度為0.5×106/mL時，病毒滴度可達到最大。邱貞娜等[15]在貼壁培養(yǎng)工藝上針對性考察了細胞密度對PCV2增殖的影響，發(fā)現(xiàn)最佳細胞接種密度為1.5×105～2×105/mL。本研究結果表明，最佳感染復數(shù)為0.05，最佳細胞接種密度為1.0×106/mL。與上述研究出現(xiàn)不同結果，其原因可能是細胞株、病毒株、培養(yǎng)基及培養(yǎng)模式之間存在較大差異。有研究報道，PCV2復制增殖依賴于宿主細胞分裂的S期[16]，本研究中高感染復數(shù)下觀察到細胞生長受到抑制且病毒滴度較最佳感染復數(shù)有所下降，推測可能與細胞生長受到影響有關。而較低的感染復數(shù)下會出現(xiàn)多數(shù)細胞并未被感染，且后期細胞裂解或因病毒感染產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)又易造成細胞資源的浪費?；趹腋∨囵B(yǎng)工藝，發(fā)現(xiàn)最佳細胞接種密度為1×106/mL，較貼壁培養(yǎng)大幅提高[17]，這可能得益于懸浮培養(yǎng)體系下可使細胞和病毒有效碰撞幾率大大增加。另外，本研究發(fā)現(xiàn)細胞接種密度與病毒滴度呈負相關，分析原因可能是因為PCV2體外復制效率較低，其增殖隨宿主細胞生長而進行，導致病毒復制周期較長[18-19]，環(huán)境中部分細胞并未被PCV2感染。工藝參數(shù)對最終病毒產(chǎn)量有很大影響，其摸索和優(yōu)化是工藝建立過程必不可少的環(huán)節(jié)。

葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)代謝和乳酸、氨等代謝副產(chǎn)物積累對于細胞生長及產(chǎn)物滴度具有重要影響。賈涵婧[20]開發(fā)了流感疫苗的流加培養(yǎng)工藝，從而大幅提高了培養(yǎng)過程的細胞密度，同時解決了營養(yǎng)物限制及代謝副產(chǎn)物累積等問題。本研究通過細胞代謝研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)后期感染組的培養(yǎng)環(huán)境開始出現(xiàn)葡萄糖和谷氨酰胺耗竭，細胞開始代謝乳酸，而對照組中未發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象，推測可能是病毒感染后細胞代謝途徑發(fā)生較大變化[21]。同時感染組和對照組均出現(xiàn)副產(chǎn)物氨快速積累，因此或許可以進行補料工藝以及灌流培養(yǎng)工藝的探索從而更新培養(yǎng)液營養(yǎng)以獲得更高的病毒產(chǎn)量[22]。糖酵解速率加快往往伴隨副產(chǎn)物乳酸初期大量生成，研究表明，氨和乳酸的積累對細胞不利，惡化培養(yǎng)后期細胞生長環(huán)境[23]。本研究中，乳酸在感染組的后期被完全消耗，從能量代謝角度推測可能與病毒增殖呈正相關[24]，但對照組中培養(yǎng)初期大量生成乳酸卻是一個不好的信號，同時和批培養(yǎng)過程結合分析，可以推測后期細胞活率快速下降可能與此有關。在培養(yǎng)后期，感染組中氨濃度已接近于7.0 mmol/L，遠高于同期細胞培養(yǎng)抑制上限，因此可以繼續(xù)優(yōu)化細胞代謝途徑或培養(yǎng)基組分進而減小代謝副產(chǎn)物的生成。氨基酸作為細胞培養(yǎng)非常重要的一類營養(yǎng)物質(zhì)，其代謝情況對細胞生長和產(chǎn)物表達具有直接影響。本研究對氨基酸代謝分析發(fā)現(xiàn)，細胞感染病毒后多數(shù)氨基酸代謝速率顯著加快。Tyr代謝兼具生糖和生酮功能，為細胞代謝的重要營養(yǎng)物質(zhì)[25]；病毒核酸與蛋白的合成不僅需要葡萄糖提供能量以及合成蛋白的基本元件氨基酸，同時也需要Ser、His和Met等能提供一碳單元的氨基酸[26]。另外，病毒也會誘使胞內(nèi)發(fā)生各種抗(促)病毒反應，如加速Gly和Glu合成谷胱甘肽增強抗氧化反應等[27]，此類反應需要上百種細胞因子和蛋白酶類參與[28]，會進一步加大細胞對能量、碳源和氮源的需求[29]。因此，深入了解細胞代謝需求進而優(yōu)化營養(yǎng)環(huán)境可進一步提升工藝經(jīng)濟性。

4 結 論

經(jīng)過30 d的直接馴化，可以獲得懸浮PK-15細胞株，PK-15細胞可用于增殖PCV2，最終病毒滴度可達106.2TCID50/mL，本研究結果為無血清懸浮培養(yǎng)PK-15細胞生產(chǎn)PCV2疫苗提供一定理論和實踐基礎，也為國內(nèi)疫苗產(chǎn)業(yè)工藝升級提供一定的借鑒。