李倩倩，龍?jiān)浦荆?鞏，金 清，劉錦錦，楊 柳，黃 英，余道兵，宋文博，黃 超，湯細(xì)彪

(武漢科前生物股份有限公司，武漢 430000)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一種人畜共患病原菌，部分高致病性菌株不僅引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、肺炎或急性死亡等，且危害與養(yǎng)殖業(yè)密切相關(guān)的人群健康，引起人類腦膜炎、肺炎、感染性休克和死亡[1]。根據(jù)菌體莢膜多糖抗原性的區(qū)別，豬鏈球菌可分為35種血清型(1～34型和1/2型)，其中血清2型在豬群和患病人群中的分離率最高，血清3、7和9型分離率次之[2]。研究者對(duì)2002-2013年豬群中豬鏈球菌的血清型在全球的分布進(jìn)行研究顯示，從豬的臨床病例中分離的豬鏈球菌主要血清型依次為2、9、3、1/2和7型，有15.5%的菌株無(wú)法分型，其中北美(加拿大和美國(guó))流行的優(yōu)勢(shì)血清型為2和3型，南美(巴西)主要是2和1/2型，歐洲(荷蘭和西班牙)主要是9和2型，亞洲(中國(guó)和韓國(guó))主要流行2、3、4型等[3-4]。趙顧[5]對(duì)2017-2018年安徽省不同規(guī)?；i場(chǎng)中分離的53株豬鏈球菌進(jìn)行血清分型發(fā)現(xiàn)，3、2、8、9型的分離率依次為20.7%、18.9%、11.3%和9.4%，血清3型占有主導(dǎo)地位。王娟等[6]對(duì)廣東地區(qū)1 326份樣品的豬鏈球菌分離結(jié)果顯示，以2型(16.58%)、3型(9.63%)和7型(6.95%)為主，其次為9型(5.34%)。王巍[7]從四川省12個(gè)市的豬場(chǎng)病料中分離出34株豬鏈球菌，經(jīng)PCR鑒定發(fā)現(xiàn)2型最多，占47.1%；7和3型分別為26.5%和11.8%。Zhang等[8]對(duì)2013-2017年的中國(guó)豬場(chǎng)豬鏈球菌流行率的調(diào)查結(jié)果顯示，中國(guó)豬鏈球菌主要為血清2、9和7型等，9型逐年持續(xù)增高，從2013年的12.1%升高至2017年的25.8%。不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型調(diào)查結(jié)果表明，豬鏈球菌血清3和9型在中國(guó)部分地區(qū)占據(jù)一定的地位，但目前對(duì)于血清3和9型豬鏈球菌的病原學(xué)研究很少，且尚無(wú)針對(duì)這2種血清型的疫苗。因此，本研究對(duì)發(fā)病豬病料進(jìn)行豬鏈球菌血清3型分離培養(yǎng)和鑒定，通過(guò)蠟螟幼蟲(chóng)和BALB/c小鼠模型篩選疫苗候選菌株，制備豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活疫苗，評(píng)估其在BALB/c小鼠上的免疫保護(hù)效果，以期豐富豬鏈球菌的菌種庫(kù)，為豬鏈球菌血清3型及多血清型聯(lián)合防控提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病料及菌株 臨床病料從武漢科前生物股份有限公司診斷中心獲得。菌株ZYS為2005年四川資陽(yáng)分離的豬鏈球菌血清2型菌株(SS2 ZYS),菌株YT為實(shí)驗(yàn)室前期篩選到的豬鏈球菌血清9型強(qiáng)毒株(SS9 YT),這2株菌均由武漢科前生物股份有限公司保存；商品化豬鏈球菌滅活疫苗(豬鏈球菌2+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)(武漢科前生物股份有限公司)。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基(TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)均購(gòu)自BD Biotech公司；新生胎牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物有限公司；革蘭氏染液購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；2×M5 HiPer plusTaqHiFi PCR Mix、第三代膠紅核酸染料(M5 HiPure Next Ⅲ Gelred)均購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司。

東勝龍PCR儀(型號(hào)：ETC811)購(gòu)自蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；電泳儀(型號(hào)：DYY-8C型)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；高速臺(tái)式離心機(jī)(型號(hào)：H1850)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；DL-CJ-2ND Ⅰ潔凈工作臺(tái)購(gòu)自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；恒溫振蕩器(SHZ-8-2)購(gòu)自國(guó)華(常州)儀器制造有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)：BG-GDSAUT0520)購(gòu)自北京杰瑞恒達(dá)科技有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 蠟螟幼蟲(chóng)1 300只左右，體重0.2～0.3 g，購(gòu)自武漢維物起源生物科技有限公司；SPF級(jí)6周齡體重18～22 g的健康雌性BALB/c小鼠330只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬鏈球菌分離鑒定 在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌采集病料(心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液等)接種于TSA平板(含10%新生牛血清)上，37 ℃靜置培養(yǎng)18～24 h。選取疑似鏈球菌形態(tài)的單菌落進(jìn)行PCR鑒定、革蘭氏染色、鏡檢，選取革蘭氏染色陽(yáng)性的、鏈狀的單菌落繼續(xù)在TSA平板上劃線、傳代。純化后的菌株用50%甘油保存菌液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌體PCR鑒定 參照Liu等[9]根據(jù)莢膜多糖合成基因設(shè)計(jì)豬鏈球菌血清3型分型及鑒定引物(表1)。引物均由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。用無(wú)菌接種環(huán)挑取TSA平板上菌落，置于50 μL PBS中，水浴煮沸10 min,冰浴2 min后離心取上清作為PCR模板。 PCR擴(kuò)增體系10 μL：模板0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×M5 HiPer plusTaqHiFi PCR Mix 5μL,用ddH2O補(bǔ)足10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；16 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 引物信息

續(xù)表

1.2.3 蠟螟初步篩選疫苗候選菌株 選取650只0.2～0.3 g蠟螟幼蟲(chóng)隨機(jī)分為26組，24組分別注射豬鏈球菌血清3型臨床分離菌株和豬鏈球菌血清2型ZYS菌株，同時(shí)設(shè)置PBS和空白對(duì)照組，每組25只；采用蠟螟最后尾足注射，注射劑量為25 μL/只，攻菌劑量為0.8×106～5.0×106CFU/只。攻菌后置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，持續(xù)觀察7 d，每24 h記錄蠟螟的死亡情況，蠟螟通體變黑，晃動(dòng)平皿蠟螟不動(dòng)即認(rèn)為其死亡。該篩選試驗(yàn)重復(fù)2次，選取致死率較高的菌株通過(guò)BALB/c小鼠進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.4 BALB/c小鼠篩選疫苗候選菌株 選取170只BALB/c小鼠進(jìn)行3輪豬鏈球菌血清型3型強(qiáng)毒株篩選，隨機(jī)分為3組，分為豬鏈球菌血清3型臨床分離株組、豬鏈球菌血清2型ZYS組、PBS對(duì)照組，每組10只；第1、2、3輪篩選均采用腹腔注射，各菌株的攻菌量分別為1.0×109～2.0×109、7.0×109～9.0×108和4.0×109～5.0×109CFU/只，注射劑量為200 μL/只。攻菌后連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。

1.2.5 毒力基因檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[10-12]，選擇豬鏈球菌的主要毒力因子胞外蛋白因子(epf)、溶血素(sly)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、纖連蛋白(fbps)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)、毒力相關(guān)因子(orf2)、89K毒力島、谷氨酸脫氫酶(gdh)作為鑒定基因，合成8對(duì)引物，引物信息見(jiàn)表1。以篩選得到的1株強(qiáng)毒株DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而確定強(qiáng)毒株的基因型。

1.2.6 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 無(wú)菌操作臺(tái)中挑取 TSA 平板(含10%新生牛血清)上經(jīng)過(guò)傳代、純化的單菌落，接種于10 mL TSB培養(yǎng)基(含 10%新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)5～8 h，作為種子液。將種子液按1%的比例接入30 mL TSB培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每1或2 h取出200 μL菌液于96孔板中，測(cè)量D600 nm值，每管重復(fù)3個(gè)孔，取平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 BALB/c小鼠致病性試驗(yàn) 將菌株種子菌液按1%的比例轉(zhuǎn)接于60 mL TSB培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h，吸取100 μL菌液進(jìn)行10倍倍比稀釋，涂TSA平板，從而計(jì)算細(xì)菌密度。收集菌液，5 000 r/min離心10 min，棄去上清，用原培養(yǎng)基0.1倍體積的PBS重懸菌體。將40只BALB/c小鼠分為5組，每組8只，菌株設(shè)置4個(gè)濃度梯度，分別為2.2×109、2.2×108、2.2×107和2.2×106CFU/只進(jìn)行腹腔注射攻毒，注射劑量為200 μL/只，同時(shí)設(shè)置PBS對(duì)照組(菌株濃度為0 CFU/只)。連續(xù)觀察7 d，記錄每組小鼠的死亡情況。

1.2.8 滅活菌株制備 將前期篩選的豬鏈球菌血清9型菌株YT和此次篩選的豬鏈球菌血清3型疫苗候選菌株進(jìn)行復(fù)蘇，從TSA平板上挑取單菌落到5 mL TSB液體培養(yǎng)基(含10%新生胎牛血清)中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8～9 h，作為一級(jí)種子菌液；按2%的比例將種子菌液接種于TSB液體培養(yǎng)基(含10%新生胎牛血清)中，培養(yǎng)6～8 h；培養(yǎng)后菌液需進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定豬鏈球菌血清3型菌株和豬鏈球菌血清9型菌株YT的量；按總體積加入0.3%甲醛溶液，37 ℃滅活15 h，然后對(duì)菌液進(jìn)行滅活檢測(cè)，取滅活菌液進(jìn)行TSA平板和TSB液體培養(yǎng)，從而確定滅活是否徹底；將滅活后菌液4 ℃、8 000 r/min離心10 min獲得菌體，用生理鹽水清洗5遍，去除殘留的甲醛溶液，最后用生理鹽水調(diào)整濃度，制成所需濃縮的抗原液，濃縮抗原液中豬鏈球菌血清3型和豬鏈球菌血清9型菌株YT含量均為2×1010CFU/mL；對(duì)濃縮抗原進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)。

1.2.9 豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活疫苗制備 將無(wú)菌檢測(cè)后的濃縮抗原液按豬鏈球菌血清3和9型菌株抗原液1∶1配比混合，然后將混合抗原液與Summit Poly Solution佐劑4∶1配比，從而制得豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活疫苗，疫苗中豬鏈球菌3和9型含菌量均為2×109CFU/mL。

1.2.10 臨床觀察 選取BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只。其中10只腿部肌內(nèi)注射豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活疫苗，0.2 mL/只，連續(xù)觀察7 d，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(不注射)和PBS組(注射等量PBS)。

1.2.11 免疫攻毒保護(hù) 選取BALB/c小鼠90只，隨機(jī)分為3組，豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活疫苗組(3+9型二價(jià)滅活疫苗組)、商品化豬鏈球菌滅活疫苗(豬鏈球菌2型+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)組(商品化滅活疫苗組)和陰性對(duì)照組，每組30只。每只腿部肌內(nèi)注射0.2 mL相應(yīng)的疫苗，陰性對(duì)照組注射等劑量的PBS，免疫14 d后進(jìn)行二免。二免14 d后，分別用豬鏈球菌血清2型ZYS菌株(2.0×108CFU/只)、篩選出的豬鏈球菌血清3型強(qiáng)毒株(2.0×108CFU/只)和豬鏈球菌血清9型YT菌株(8.0×107CFU/只)，腹腔注射攻毒，每個(gè)菌株注射10只，攻毒后觀察7 d內(nèi)小鼠的臨床癥狀和死亡數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離與鑒定

病料經(jīng)37 ℃靜置培養(yǎng)18～24 h后觀察到灰白半透明色，針尖大小的光滑呈圓形的小菌落，在強(qiáng)光下可見(jiàn)淺藍(lán)色熒光(圖1A)，革蘭氏染色呈陽(yáng)性(圖1B)。血清3型特異性引物及鑒定引物PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，分離出23株細(xì)菌均為豬鏈球菌血清3型，分別命名為KQ3-1～KQ3-23。部分PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

A，分離株菌落形態(tài)；B，分離株革蘭氏染色(1 000×)A，Colony morphology of the isolates;B，Gram straining of the isolates (1 000×)圖1 臨床分離菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.1 Colony morphology and Gram staining microscopic examination results of the clinical isolates

①A,引物thrA；B，引物cps3L。②M，DL1000 DNA Marker;1～23,23株臨床分離株;24,陰性對(duì)照(ddH2O)①A，thrA primer;B，cps3L primer.②M，DL1000 DNA Marker;1-23,23 strains of clinical isolates;24,Negative control (ddH2O)圖2 分離菌PCR鑒定Fig.2 Identification of the isolates by PCR

2.2 蠟螟篩選疫苗候選菌株

蠟螟幼蟲(chóng)攻毒2次試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。豬鏈球菌血清2型ZYS組的死亡率高達(dá)100%，PBS對(duì)照組死亡率為4%，空白對(duì)照組死亡率為0，各臨床分離株組的死亡率不同。 選取2次篩選死亡率較高的6株菌進(jìn)行后續(xù)BALB/c小鼠復(fù)篩，編號(hào)分別為KQ3-1、KQ3-4、KQ3-17、KQ3-19、KQ3-20和KQ3-22。

2.3 BALB/c小鼠篩選疫苗候選菌株

小鼠攻毒篩選試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，根據(jù)第1次篩選死亡時(shí)間及死亡率，發(fā)現(xiàn)6株菌中有2株菌的死亡率均為100%，2株菌的死亡率在90%，2株菌死亡率分別為70%和80%。隨即對(duì)死亡率>90%的4株菌進(jìn)行第2、3輪篩選，根據(jù)攻菌量、死亡時(shí)間及死亡率發(fā)現(xiàn)KQ3-1株的致病性較強(qiáng)，死亡率為100%。

2.4 毒力基因鑒定

對(duì)豬鏈球菌KQ3-1株進(jìn)行毒力基因擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，擴(kuò)增出大小分別為571、443和688 bp的gapdh、sly和gdh基因；未擴(kuò)增出fbps、orf2、mrp、89K和epf基因，表明該菌株的基因型為gapdh+/sly+/fbps-/orf2-/mrp-/89K-/gdh+/epf-。

2.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

根據(jù)不同時(shí)間液體培養(yǎng)物中豬鏈球菌的密度變化繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，0～4 h為遲緩期，4～8 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8～12 h為穩(wěn)定期。表明菌株KQ3-1培養(yǎng)8 h左右液體培養(yǎng)基中細(xì)菌的密度最大，可獲得大量的細(xì)菌抗原。

2.6 BALB/c小鼠致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)小鼠感染KQ3-1菌株12 h內(nèi)可引起小鼠精神萎靡、扎堆、毛發(fā)聳立、運(yùn)動(dòng)遲緩、死亡等臨床癥狀，而對(duì)照組無(wú)明顯癥狀。攻毒7 d后，每組小鼠的死亡情況見(jiàn)表4。根據(jù)改良寇氏法計(jì)算，KQ3-1菌株對(duì)BALB/c小鼠的LD50為5.2×107CFU/只。

①M(fèi)，DL1000 DNA Marker;1、9，gapdh基因；2、10，sly基因；3、11，fbps基因；4、12，orf2基因；5、13，mrp基因；6、14，89K毒力島；7、15，gdh基因；8、16，epf基因。②1～8，模板為ddH2O，9～16，模板為KQ3-1①M(fèi),DL1000 DNA Marker;1 and 9,gapdh gene;2 and 10,sly gene;3 and 11,fbps gene;4 and 12,orf2 gene;5 and 13,mrp gene;6 and 14,89K virulence island;7 and 15,gdh gene;8 and 16, epf gene.②1-8,Template was ddH2O;9-16,Template was KQ3-1圖3 豬鏈球菌血清3型菌株KQ3-1毒力基因檢測(cè)Fig.3 Identification of virulence genes of KQ3-1 strain

圖4 KQ3-1菌株生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of KQ3-1 strain

表4 豬鏈球菌KQ3-1菌株攻毒后小鼠存活情況

2.7 抗原及疫苗無(wú)菌檢測(cè)

將濃縮抗原和制備的疫苗同時(shí)用TSA和TSB培養(yǎng)基進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)，結(jié)果顯示，TSA和TSB培養(yǎng)基中均無(wú)菌生長(zhǎng)，空白對(duì)照的TSA和TSB培養(yǎng)基中均無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照的TSA和TSB培養(yǎng)基中有菌落生長(zhǎng)，表明疫苗無(wú)菌檢測(cè)合格。

2.8 安全性及免疫攻毒評(píng)估

疫苗組、空白對(duì)照組和PBS組注射前后小鼠無(wú)明顯差別，精神狀況、食欲均正常，觸摸小鼠腿部注射部位無(wú)腫脹、硬塊、結(jié)節(jié)等免疫反應(yīng)，持續(xù)觀察7 d全部存活，表明該滅活疫苗具有良好的安全性。

免疫后攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用豬鏈球菌血清2型ZYS菌株、豬鏈球菌血清3型KQ3-1菌株和豬鏈球菌血清9型YT菌株對(duì)陰性對(duì)照組、豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活苗組和豬鏈球菌滅活疫苗(豬鏈球菌2+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)組攻毒后，陰性對(duì)照組死亡率分別為90%、100%和100%，豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活苗組死亡率分別為70%、20%和30%，商品化豬鏈球菌滅活疫苗(豬鏈球菌2+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)組死亡率分別為30%、100%和90%(表5)。表明本試驗(yàn)疫苗對(duì)豬鏈球菌血清2、3和9型的保護(hù)率分別為30%、80%和70%，而商品化的滅活疫苗對(duì)豬鏈球菌菌血清2型保護(hù)效果為70%，對(duì)3和9型的保護(hù)率分別為0和10%；因此，研發(fā)的豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活苗能有效預(yù)防豬鏈球菌血清3和9型強(qiáng)毒株的感染。

表5 豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活疫苗效力試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

目前豬鏈球菌疫苗主要分為滅活疫苗、弱毒活疫苗和亞單位疫苗。市售商品化疫苗主要豬鏈球菌病蜂膠滅活疫苗、豬鏈球菌病滅活疫苗(豬鏈球菌2型+馬鏈球菌獸疫亞種)、豬敗血性鏈球菌病活疫苗、豬鏈球菌病-副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗、豬鏈球菌病滅活疫苗(豬鏈球菌2+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)及豬鏈球菌滅活疫苗(2型，HA9801株)等[13]。由于豬鏈球菌血清型眾多，滅活疫苗和弱毒活疫苗對(duì)多個(gè)血清型的保護(hù)能力有限，使得保護(hù)效果不理想。而單獨(dú)以1種或幾種毒力因子制成的亞單位疫苗不能起到完全的免疫保護(hù)效果，因此，滅活疫苗仍有著不可替代的作用。近年來(lái)豬鏈球菌血清2型在中國(guó)廣泛存在并流行，成為當(dāng)前危害中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要病原之一，也給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)威脅。同時(shí)，豬鏈球菌血清3和9型也是優(yōu)勢(shì)血清型，呈上升的趨勢(shì)[5-7,14-15]，而針對(duì)豬鏈球菌血清3、9型尚無(wú)相關(guān)的疫苗，給豬鏈球菌的防控帶來(lái)了風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要開(kāi)發(fā)一種能預(yù)防豬鏈球菌血清3和9型的疫苗解決上述問(wèn)題。

豬鏈球菌的生物學(xué)特性隨著菌株和培養(yǎng)條件的變化而有所不同，不同菌株之間往往差異很大，分離新的致病性菌株，篩選免疫原性和安全性良好的疫苗菌株至關(guān)重要[16]。前期實(shí)驗(yàn)室已成功分離和篩選出豬鏈球菌血清9型的疫苗候選菌株YT，而豬鏈球菌血清3型疫苗候選菌株尚未獲得。因此，本研究基于武漢科前生物股份有限公司診斷中心平臺(tái)，以來(lái)自全國(guó)各地豬場(chǎng)送檢的病料為材料，分離鑒定豬鏈球菌。通過(guò)對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、PCR鑒定確定菌種和血清型，獲得23株豬鏈球菌3型臨床分離株。進(jìn)一步從23株豬鏈球菌菌株中鑒定出強(qiáng)毒株。動(dòng)物模型是判斷細(xì)菌毒力的重要工具，目前國(guó)際上尚無(wú)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)的豬鏈球菌感染模型，而各個(gè)研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)研究目的的不同建立了不同的動(dòng)物模型。常用的動(dòng)物感染模型主要包括斑馬魚(yú)模型、小鼠模型、豚鼠模型和仔豬模型[17]。此外，蠟螟幼蟲(chóng)已成功用于人類和動(dòng)物傳染病的研究，Velikova等[18]開(kāi)發(fā)了該動(dòng)物模型應(yīng)用在豬鏈球菌毒力的評(píng)估。通過(guò)豬鏈球菌感染蠟螟幼蟲(chóng)、仔豬和斑馬魚(yú)模型，發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌血清2型致病菌株對(duì)于蠟螟幼蟲(chóng)的毒力評(píng)估與仔豬和斑馬魚(yú)模型一致。蠟螟幼蟲(chóng)模型簡(jiǎn)單、快速、精確、成本低，可大規(guī)模使用，適合作為豬鏈球菌的感染模型。因此，通過(guò)蠟螟幼蟲(chóng)和BALB/c小鼠模型對(duì)23株豬鏈球菌血清3型進(jìn)行篩選，篩選到1株強(qiáng)毒株KQ3-1。

為進(jìn)一步了解KQ3-1株的生物學(xué)特性，試驗(yàn)對(duì)其生長(zhǎng)曲線、毒力因子和致病性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，疫苗候選菌株KQ3-1培養(yǎng)8 h左右液體培養(yǎng)基中細(xì)菌密度最大，可獲得大量的細(xì)菌抗原。毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因型為gapdh+/sly+/fbps-/orf2-/mrp-/89K-/gdh+/epf-。Vecht15]研究發(fā)現(xiàn)，從發(fā)病豬體內(nèi)分離的鏈球菌80%是mrp+/epf+型，而健康豬中86%是mrp-/epf-型[19]。KQ3-1株雖不攜帶強(qiáng)致病毒力基因mrp和epf基因，但BALB/c小鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，KQ3-1株的致病性很強(qiáng)，LD50為5.2×107CFU/只。 不同毒力基因的組合對(duì)菌株的致病性具有一定影響[20]，KQ3-1攜帶3個(gè)毒力基因，對(duì)于每個(gè)基因在菌株致病性中發(fā)揮的作用仍需進(jìn)一步探究。

利用本試驗(yàn)篩選的豬鏈球菌血清3型疫苗候選菌株KQ3-1和豬鏈球菌血清9型疫苗候選菌株YT制備的豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活疫苗對(duì)血清3和9型菌株的攻毒保護(hù)率為80%和70%，而商品化豬鏈球菌滅活疫苗(豬鏈球菌2+7型+馬鏈球菌獸疫亞種)對(duì)血清3型菌株攻毒無(wú)保護(hù)效果，對(duì)血清9型菌株攻毒保護(hù)率為10%。而本試驗(yàn)制備的疫苗對(duì)血清3和9型的保護(hù)效果仍有待提高。疫苗制備中佐劑的選擇和滅活方式也起著關(guān)鍵性的作用，選擇合適的滅活方式和佐劑能將抗原的免疫原性發(fā)揮到最佳狀態(tài)[21]。下一步試驗(yàn)將對(duì)不同的佐劑和滅活方式進(jìn)行篩選，從而制備對(duì)豬鏈球菌血清3和9型具有更好免疫效果的疫苗。

4 結(jié) 論

本研究利用蠟螟和BALB/c小鼠模型從23株臨床豬鏈球菌血清3型菌株中篩選出1株疫苗候選菌株KQ3-1，進(jìn)而結(jié)合前期篩選的豬鏈球菌血清9型疫苗候選菌株制備了豬鏈球菌3+9型二價(jià)滅活疫苗，證明其在BALB/c小鼠模型上能有效預(yù)防血清3和9型強(qiáng)毒菌株的感染。