郭 騫，張 鈺，方小偉，安 妮，袁 梅，方 春

(長江大學動物科學學院，荊州 434025)

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)為李斯特菌屬成員，是一種革蘭氏陽性無芽孢短桿菌，可引發(fā)人和動物的李斯特菌病，表現為敗血癥、腦膜炎及流產等癥狀[1]。作為一種食源性病原菌，單增李斯特菌主要經消化道感染人和動物，該菌有13個血清型，但絕大多數臨床病例由血清型4b和1/2b(譜系Ⅰ)，以及1/2a和1/2c(譜系Ⅱ)菌株引起[2]。侵染宿主細胞相關的毒力因子包括第一毒力島編碼的毒力調控因子PrfA、磷脂酶PlcA和PlcB、溶血素LLO、金屬蛋白酶Mpl及肌動蛋白聚集因子ActA；第二毒力島編碼的內化素InlA和InlB[3]。InlA與宿主細胞表面的E-鈣黏素特異性結合介導單增李斯特菌侵入特定類型宿主細胞，而InlB則與c-Met等結合介導該菌入侵多種類型宿主細胞[2，4]。InlA被Sec分泌系統(tǒng)轉位至細菌胞外后通過其C-端的LPXTG基序共價錨定在細胞壁上；而InlB則通過其C-端的GW基序以非共價鍵錨定在細菌表面的磷壁酸上[5]。前期研究發(fā)現，弱毒株M7的低致病性可能與其InlB不能正常錨定在細菌表面相關[6]。在4b血清型菌株中，gttA和gttB基因介導壁磷壁酸(wall teichoic acid,WTA)的半乳糖基化，敲除它們導致細菌表面的WTA缺乏半乳糖基化修飾，顯著降低細菌表面InlB錨定的豐度和單增李斯特菌的致病性[7-8]；參與WTA的半乳糖基化修飾的基因除了4b血清型特異的gttA和gttB外，可能還需要保守存在于其他血清型菌株中的galU、galE和gtcA基因共同參與完成糖基化修飾原料的合成、轉位和轉移[7]。由于不同血清型菌株表面WTA的糖基化修飾類型并不一樣[9]，尚不清楚galU、galE和gtcA基因在單增李斯特菌中的具體功能。本研究擬構建gtcA基因缺失株，進而評估其對單增李斯特菌InlB錨定和致病力的影響，以期為闡明InlB錨定的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

單增李斯特菌EGDe-prfA*(血清型為1/2a型)、穿梭質粒pKSV7和回補質粒pIMK2均由浙江大學分子微生物與食品安全實驗室饋贈；雞成纖維細胞DF1和小鼠巨噬細胞RAW264.7均由長江大學動物病原微生物學實驗室保存；11日齡SPF雞胚購自湖北峪口禽業(yè)有限公司。

腦心浸液培養(yǎng)基BHI購自北京陸橋生物技術有限公司；LB培養(yǎng)基、HRP標記的山羊抗兔IgG和ECL顯影液均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；核酸染料GoldView購自上海賽百盛生物公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑及DNA Marker均購自武漢擎科生物技術有限公司；限制性核酸內切酶購自NEB公司；無縫克隆試劑盒購自北京艾德萊生物有限公司；InlA、InlB和GAPDH多克隆抗體均由長江大學動物病原微生物學實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 缺失株與回補株的構建 缺失株構建方法參照任靜靜等[10]進行，基于單增李斯特菌EGDe基因組(登錄號：NC003210)，利用Vector NTI軟件設計目的基因gtcA(lmo2549)上、下游同源臂引物(表1)。第一輪PCR以基因組為模板，分別用引物pFL353-A/B和pFL353-C/D擴增上、下游同源臂；第二輪PCR以純化的上、下游同源臂為模板，用引物pFL353-A/D擴增融合的同源臂；PCR產物純化后與BamH Ⅰ線性化的pKSV7重組連接構建重組穿梭質粒pFL353。將pFL353電轉至親本株感受態(tài)細胞中，在含10 μg/mL氯霉素的BHI中，于42 ℃條件下連續(xù)傳代使其與基因組發(fā)生同源重組。通過旁側引物pFL353-A/E鑒定重組成功的單克隆，于無抗培養(yǎng)基中連續(xù)傳代消除重組后的質粒，以獲得缺失株ΔgtcA。

回補株構建方法：用pFL353-A/D引物擴增gtcA基因及其啟動子片段，PCR產物經SalⅠ和SmaⅠ雙酶切后與酶切的pIMK2連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，長出菌落后挑單菌落進行PCR鑒定，保存陽性克隆并提取回補質粒，將回補質粒電轉入缺失株ΔgtcA，構建回補株CΔgtcA。

PCR反應體系20 μL：2×MasterMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s,72 ℃延伸(時間按60 s/kb設置)，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；16 ℃保存。

表1 引物信息

1.2.2 生長曲線測定 分別挑取親本株EGDe-prfA*、缺失株ΔgtcA和回補株CΔgtcA菌落于3 mL BHI培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)12 h。取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min收集菌體，再用新的BHI培養(yǎng)基重懸菌體，分別取10 μL菌液至990 μL BHI中，渦旋混勻后接種于96孔板，200 μL/孔，每組設置4個平行孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 h使用酶標儀測定D600 nm值，于平臺期停止測定。

1.2.3 內化素的錨定分析 參照Fang等[6]方法進行，挑單菌落至100 mL BHI中于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，12 000 r/min離心10 min后分別收集菌體和培養(yǎng)上清；菌體用PBS洗滌2次后加入2 mL含2% SDS PBS重懸，于37 ℃水浴鍋中孵育2 h，12 000 r/min離心10 min收集上清即為菌體表面蛋白(CW)樣品；培養(yǎng)上清經0.22 μm濾膜過濾后加入100%三氯乙酸至終濃度為10%，置于4 ℃沉淀過夜。12 000 r/min離心10 min收集沉淀，加入0.1 mol/L NaOH溶解沉淀即為培養(yǎng)上清蛋白(SN)樣品，樣品分裝成小份后-80 ℃保存?zhèn)溆?。?份加入Loading Buffer，煮沸10 min后進行SDS-PAGE分離，利用濕轉法(200 mA，100 min)將PAGE膠上的蛋白轉印至PVDF膜上。PVDF膜用含5%脫脂乳的TBST室溫封閉2 h，洗滌3次后加入一抗，InlA和InlB多克隆抗體(1∶200稀釋)和內參GAPDH多克隆抗體(1∶500稀釋)，于4 ℃搖床孵育過夜，再用TBST洗膜5次，每次5 min；加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h后用TBST洗膜5次，每次5 min。將ECL顯影液均勻鋪在膜表面，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。利用Image J軟件對Western blotting圖像進行灰度分析，各組樣品中目的條帶灰度值通過相應的內參GAPDH進行校正，各組校正后的灰度值與親本株灰度值相比即為相對灰度值。

1.2.4 細胞侵染試驗 細胞試驗參照Fang等[11]方法進行，將DF1或RAW264.7細胞接種于24孔板，密度為2×105/孔，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日更換為950 μL無抗細胞培養(yǎng)基；加入50 μL合適稀釋度的菌液使感染復數(細菌與細胞的數量比)約為10，混勻后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，實際感染劑量N0通過平板計數菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)確定。

DF1細胞黏附試驗：于感染后30 min棄培養(yǎng)液，用PBS洗3次，每孔加入1 mL滅菌去離子水充分吹吸混勻，使細胞破裂釋放出細菌，倍比稀釋后通過平板計數確定黏附的細菌數N1；DF1細胞侵襲試驗：在感染后30 min棄培養(yǎng)基，洗滌3次后加入含50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，棄培養(yǎng)液后洗滌3次，以同樣的方法裂解細胞，平板計數確定侵入胞內的細菌數N2。試驗做3次重復。

黏附率(%)=N1/N0×100%

侵襲率(%)=N2/N0×100%

RAW264.7細胞吞噬試驗：于感染后30 min棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3次，每孔加入1 mL 含50 μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)液，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h后，參照黏附試驗方法，棄培養(yǎng)液、洗滌、裂解細胞、倍比稀釋后通過平板計數確定吞噬的細菌數N3。RAW264.7細胞中增殖試驗：處理方法同吞噬試驗，加入含50 μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)液孵育4 h后，棄培養(yǎng)液、洗滌、裂解細胞、倍比稀釋后通過平板計數確定胞內細菌數N4。試驗做3次重復。

吞噬率(%)=N3/N0×100%

增殖倍數=N4/N3

1.2.5 雞胚毒力試驗 雞胚毒力試驗參照黃專等[12]方法進行，將11日齡SPF雞胚隨機分為3組，每組12只，置于38 ℃孵化箱中孵育。 EGDe-prfA*、ΔgtcA和CΔgtcA接種于BHI培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，12 000 r/min離心10 min收集菌體，用PBS洗滌3次后，再用PBS重懸，倍比稀釋至合適的梯度后經尿囊腔注射感染雞胚，0.2 mL/只(約104CFU)，實際感染劑量通過平板計數法確定。感染2 d后每組取7只雞胚，無菌剖檢采集肝臟和脾臟，置于研缽中，加入1 mL PBS進行充分研磨，勻漿液經倍比稀釋后進行平板計數，確定感染雞胚肝臟和脾臟中的細菌載量。剩余5只繼續(xù)孵育并監(jiān)測雞胚存活情況，每天2次，結果以存活曲線表示。

1.2.6 統(tǒng)計分析 試驗數據通過GraphPad Prism 5.0進行作圖，選擇非配對t檢驗(unpairedttest)方法進行統(tǒng)計分析。數據以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 缺失株與回補株的構建

第一輪PCR擴增得到741和590 bp的同源臂片段(圖1A)；第二輪PCR擴增得到1 307 bp融合的同源臂片段(圖1B)。融合的同源臂片段與BamH Ⅰ線性化的pKSV7重組連接后獲得重組質粒pFL353，PCR鑒定得到1 307 bp的片段(圖1C)。將重組質粒pFL353電轉至EGDe-prfA*感受態(tài)細胞中，PCR鑒定得到1 307 bp的片段(圖1D)，在42 ℃條件下連續(xù)傳代篩選重組的克??；于30 ℃條件下連續(xù)傳代消除重組后的質粒，利用旁側引物進行PCR鑒定，EGDe-prfA*擴增的片段為1 866 bp，ΔgtcA擴增得到1 427 bp的片段(圖1E)。

以EGDe-prfA*基因組為模板，擴增得到gtcA基因及其啟動子區(qū)域，片段大小為1 706 bp(圖2A)；目的片段與酶切后的pIMK2載體連接獲得回補質粒pFL353C，PCR鑒定得到1 706 bp的片段(圖2B)；回補質粒pFL353C電轉入缺失株ΔgtcA感受態(tài)細胞中，用質粒引物進行PCR鑒定得到2 007 bp的片段，獲得了回補株CΔgtcA(圖2C)。生長曲線顯示，EGDe-prfA*、ΔgtcA和CΔgtcA在BHI培養(yǎng)基中生長并無顯著差異(P>0.05,圖3)。

2.2 gtcA基因缺失對單增李斯特菌表面錨定InlB的影響

采用Western blotting分析InlA和InlB在單增李斯特菌表面的錨定情況，結果見圖4。由圖4可知，ΔgtcA表面的InlB錨定量極顯著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA(P<0.01)；培養(yǎng)上清中InlB錨定量極顯著高于EGDe-prfA*和CΔgtcA(P<0.01)；InlA在EGDe-prfA*、ΔgtcA和CΔgtcA的表面與培養(yǎng)上清中的分布并無顯著差異(P>0.05)。

M，DL2000 DNA Marker；1，上游同源臂；2，下游同源臂；3，融合同源臂；4、5，DH5α-pFL353；6、7，EGDe-prfA*-pFL353；8，EGDe-prfA*；9～13，ΔgtcAM，DL2000 DNA Marker；1，Upstream homoarm；2，Downstream homoarm；3，Fused homoarm；4 and 5，DH5α-pFL353；6 and 7，EGDe-prfA*-pFL353；8，EGDe-prfA*；9-13，ΔgtcA圖1 缺失株ΔgtcA的構建Fig.1 Construction of deletion strain ΔgtcA

M1，DL2000 DNA Marker；1，gtcA基因片段；2，回補質粒pFL353C；M2,DL5000 DNA Marker;3，回補株CΔgtcAM1，DL2000 DNA Marker；1，gtcA gene fragment；2，Complemental plasmid pFL353C；M2,DL5000 DNA Marker;3，Complemental strain CΔgtcA圖2 回補株CΔgtcA的構建Fig.2 Construction of complemental strain CΔgtcA

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，無顯著性差異(P>0.05)。下同*，Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01)；No*，No significant difference (P>0.05).The same as below圖3 EGDe-prfA*、ΔgtcA和CΔgtcA在BHI中的生長曲線Fig.3 Growth curves of EGDe-prfA*,ΔgtcA and CΔgtcA in BHI broth

圖4 Western blotting結果(A)及相對灰度值(B)Fig.4 Western blotting result (A) and relative intensity ratio (B)

2.3 gtcA基因缺失對單增李斯特菌細胞侵染能力的影響

由表2可知，黏附試驗結果顯示，ΔgtcA對DF1細胞的黏附率顯著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA(P<0.05)；侵襲試驗結果顯示，ΔgtcA對成纖維細胞DF1的侵襲率顯著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA(P<0.05)；吞噬試驗結果顯示，巨噬細胞RAW264.7對ΔgtcA的吞噬率顯著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA(P<0.05)；增殖試驗結果顯示，ΔgtcA與EGDe-prfA*和CΔgtcA在巨噬細胞RAW264.7中3 h內增殖倍數并無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同菌株對DF1細胞的黏附侵襲能力和在巨噬細胞RAW264.7中的吞噬及增殖能力

2.4 gtcA基因缺失單增李斯特菌對雞胚致病力的影響

本研究以雞胚為動物模型評估單增李斯特菌的致病性，雞胚尿囊腔注射感染試驗結果顯示，感染2 d后，ΔgtcA感染雞胚肝臟、脾臟中的平均細菌載量均極顯著低于EGDe-prfA*和CΔgtcA(P<0.01；圖5A、5B)。存活試驗結果顯示，EGDe-prfA*感染3 d 后雞胚全部死亡；ΔgtcA感染4 d后雞胚開始死亡，感染后第7天存活率維持在20%；CΔgtcA感染3～4 d后雞胚全部死亡(圖5C)。表明gtcA基因缺失能降低單增李斯特菌EGDe-prfA*對雞胚的致病力。

圖5 gtcA基因缺失對單增李斯特菌感染雞胚肝臟(A)、脾臟(B)中細菌載量及存活率(C)的影響Fig.5 Effects gtcA gene deletion on the bacteria load in liver (A)，spleen (B) and the survival rate (C) of Listeria monocytogenes infected chicken embryo

3 討 論

本研究利用同源重組技術構建了糖基翻轉酶基因gtcA缺失株，分析了親本株與缺失株生長能力、對細胞的侵染能力以及對雞胚的致病力等生物學特性，結果顯示，gtcA基因缺失不影響單增李斯特菌在BHI培養(yǎng)基中的生長能力及在巨噬細胞中的增殖能力，表明gtcA并非為單增李斯特菌在宿主體內外環(huán)境中生長繁殖所必需的基因。Sumrall等[7]研究發(fā)現，4b型菌株中WTA缺乏半乳糖基化修飾導致InlB不能有效錨定在單增李斯特菌表面；Carvalho等[13]研究發(fā)現，1/2a型菌株中WTA缺乏鼠李糖基化修飾導致InlB不能正常錨定；本研究結果發(fā)現，gtcA基因缺失導致細菌表面InlB錨定量極顯著降低，與先前研究結果一致。細胞和雞胚感染試驗顯示，gtcA基因缺失顯著降低了單增李斯特菌對DF1和RAW264.7細胞的侵染能力及對雞胚的致病力，這可能與InlB不能正常錨定相關。InlB作為單增李斯特菌的主要侵襲相關毒力因子，與其受體c-Met結合介導該菌入侵多種類型的宿主細胞[14-15]。相比之下，InlA的受體E-鈣黏素僅介導該菌入侵人和豚鼠的細胞，以及E-鈣黏素人源化的小鼠細胞[16]。本研究以雞成纖維細胞和雞胚為感染模型，旨在更好地評估InlB錨定異常對單增李斯特菌感染和致病性的影響。Andersson等[17]研究證實，雞胚可以作為一種可靠且經濟實惠的單增李斯特菌感染模型。然而，Gripenland等[18]發(fā)現，在雞胚感染模型中，inlA和inlB基因缺失株對雞胚的致死率與親本株相當，提示InlA和InlB在雞胚感染過程中并非發(fā)揮主導作用，單增李斯特菌入侵雞胚細胞可能由其他侵襲相關蛋白介導。

雖然已經明確了WTA的半乳糖基化修飾和鼠李糖修飾能夠介導InlB的錨定[7,13]，但不同血清型菌株致病力差異是否與其表面WTA修飾類型及InlB錨定相關仍不清楚。不同血清型菌株的WTA修飾類型并不相同，Shen等[19]通過超高效液相色譜串聯質譜分析顯示，1/2a型菌株WTA為鼠李糖和核糖醇修飾；3a型和4a型菌株WTA有核糖醇修飾；4b型菌株WTA則包含半乳糖、葡萄糖和核糖醇修飾。在4b型菌株中，敲除gttA和gttB基因導致WTA不能發(fā)生半乳糖基化，進而影響InlB的錨定和單增李斯特菌的致病性[7-8]。在1/2a型菌株EGDe中敲除鼠李糖修飾相關基因rmlT和rmlABCD可顯著降低InlB在細菌表面的錨定豐度[13,20]。但尚不清楚gtcA基因缺失影響1/2a血清型菌株中InlB錨定的具體分子機制。最早認為gtcA是4b血清型特異的糖基化基因，該基因突變會導致4b型菌株WTA不能發(fā)生半乳糖基化，葡萄糖基化比例也顯著降低，并表現出對李斯特菌噬菌體的抗性[21-22]。分析單增李斯特菌基因組發(fā)現，gtcA基因并非4b血清型菌株特有，在其他血清型菌株中也存在該基因。Rismondo等[23]研究發(fā)現，在1/2a型菌株10403S中gtcA基因參與脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)的半乳糖基化，敲除該基因導致LTA上缺乏半乳糖基化修飾。雖然早期研究推測單增李斯特菌的InlB主要錨定在LTA上，后來發(fā)現LTA合成的關鍵基因ltaP和ltaS缺失導致不能產生LTA，但并不影響InlB的錨定[24-25]，表明InlB并非主要錨定在LTA上。因此，本研究推測1/2a型菌株中gtcA基因可能通過參與WTA修飾介導InlB的錨定，但對于gtcA基因介導WTA糖基化修飾的類型和影響InlB錨定的分子機制仍有待深入探索。

4 結 論

在單增李斯特菌EGDe-prfA*中敲除糖基翻轉酶gtcA基因不影響該菌的生長能力，可極顯著降低細菌表面InlB的錨定量，也可顯著降低該菌對成纖維細胞和巨噬細胞的侵染能力以及對雞胚的致病力。