劉雨桐，姚妍婷，黎芮伶，韓文琪，石 婷，王一丹，任玉鵬

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,成都 610041)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)感染引起的豬的重要腹瀉類傳染病，以各日齡豬的腹瀉和脫水為主要特征。目前豬流行性腹瀉被認為是一種跨境傳播的疫病,在全球范圍內(nèi)廣泛流行[1]。據(jù)調(diào)查顯示，2012-2021年，PEDV在包括美國、加拿大、墨西哥、法國和德國等歐美國家[2-4]以及韓國[5]、越南[6]等亞洲國家持續(xù)流行。在國內(nèi)，Su等[7]對2015-2018年22個省市543份樣本的分子檢測結(jié)果表明，PEDV總體陽性率達到66.85%(363/543)，群體陽性率為100%(28/28)。周昱行等[8]在2018-2019年青藏高原地區(qū)腹瀉藏豬中檢測PEDV陽性率高于40%，表明其也是導(dǎo)致藏豬腹瀉的主要病因之一。作為西南地區(qū)生豬養(yǎng)殖的主要省份，四川和云南地區(qū)近年來PEDV流行趨勢也持續(xù)上升，如江地科等[9]對2016-2017年四川省12個地區(qū)來源的豬腹瀉樣本檢測發(fā)現(xiàn)，PEDV陽性率為56.52%；張振興等[10]對2021年引起云南曲靖某豬場10日齡仔豬死亡率達65.01%的PEDVN基因進行測序分析，結(jié)果顯示，該毒株與河北 T10-HB2018 株相似性最高，與CV777和AJ1102疫苗株核酸序列存在差異，表明西南地區(qū)流行的PEDV毒株存在一定的基因多樣性。因此，進一步對該地區(qū)PEDV毒株進行分子流行病學(xué)監(jiān)測，了解其變異特征，對PEDV疫苗候選株的篩選和豬腹瀉病的防控都具有重要意義。

PEDV基因組為不分段的單股正鏈RNA，由28 kb堿基組成，從基因組5′-端到3′-端依次為：5′-UTR-ORF1a/b-S-ORF3-E-M-N-3′-UTR[11]。ORF1a/b基因約占RNA全長2/3，編碼復(fù)制酶多聚蛋白。在ORF1a/b基因下游有4個分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白刺突糖蛋白(S)、小包膜蛋白(E)、囊膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)[12]的開放閱讀框。其中，S蛋白包含S1和S2兩個亞結(jié)構(gòu)域，分別介導(dǎo)細胞吸附和膜融合，還含有多個抗原表位和重要中和表位，也是誘發(fā)細胞毒性T細胞反應(yīng)的主要抗原蛋白。在病毒基因組中，S基因容易變異和重組造成病毒毒力、抗原性和組織嗜性改變[13]。因此，監(jiān)測S基因的遺傳變異是豬冠狀病毒分子流行病學(xué)研究中的重要任務(wù)。ORF3基因編碼PEDV唯一輔助蛋白，與病毒的毒力強弱有關(guān)，其編碼產(chǎn)物為離子通道蛋白，能調(diào)控病毒在宿主細胞內(nèi)的增殖[14]，也是PEDV分子流行病學(xué)調(diào)查中的重要靶基因[15]。

本研究擬對采自四川、云南省8個不同地區(qū)規(guī)模豬場200份腹瀉豬樣本進行分子檢測，調(diào)查2020-2021年P(guān)EDV在西南地區(qū)的流行情況。同時，對陽性樣本中PEDVS基因和ORF3基因進行克隆測序，采用生物信息學(xué)軟件進行核苷酸及氨基酸序列的變異性分析和系統(tǒng)進化分析，以豐富中國西南地區(qū)PEDV分子流行病學(xué)資料，了解毒株遺傳變異特征，為本地區(qū)豬流行性腹瀉防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集及處理

2020年10月-2021年2月，在四川的綿陽、樂山、南充、廣元、溫江和云南的昆明、臨滄、保山等8個地區(qū)規(guī)模豬場采集嚴重腹瀉的疑似PEDV感染豬的肛門棉拭子200份，按1∶1體積比加入無菌PBS(1 mol/L)充分混合后，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心10 min，取上清液凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

TRIzol RNA提取試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DL2000 DNA Marker、TaqDNA聚合酶和PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司；PrimeScript?Reverse Transcriptase Kit、pMD19-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞均購自寶生物工程(大連)股份有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

本試驗中用于檢測PEDV、豬A群輪狀病毒(GARV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(SADS-CoV) 的引物均參照文獻[16-18]合成(表1)。同時，根據(jù)GenBank中已登錄的PEDV代表毒株CV777、AJ1102、DR13、LNCT2、SD-M株基因組序列(登錄號分別為：AF353511、JX188454、DQ862099、KT323980.1、JX560761.1)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PEDVS和ORF3基因特異性擴增引物(表2)。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 檢測引物信息

表2 PEDV S和ORF3基因引物信息

續(xù)表

1.4 總RNA提取與cDNA合成

用TRIzol法提取腹瀉豬肛門棉拭子樣本的總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照PrimeScript?Reverse Transcriptase Kit說明書制備cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 臨床樣本病原檢測的PCR擴增及測序

以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)總體系25 μL：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Buffer 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火(溫度見表1)35 s，72 ℃ 延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，按PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書進行回收純化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 PEDV S和ORF3基因的克隆測序

以所有PEDV陽性樣本的cDNA為模板PCR擴增S和ORF3基因。 PCR反應(yīng)總體系25 μL：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Buffer 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。 PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火(溫度見表2) 35 s，72 ℃延伸(時間見表2)，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收純化，并連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.7 PEDV S和ORF3基因的遺傳變異分析

將GenBank中已登錄的中國18個省以及美國、日本、韓國、泰國和越南等不同來源的106條PEDV的S基因和68條ORF3基因序列作為參考，在MegAlign軟件中使用的Clustal V計算S基因和ORF3基因核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列的相似性；用Mega 7.0軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；使用Alignment Report分析S基因和ORF3基因的氨基酸變異性。

1.8 PEDV S基因的重組分析

將測序獲得的PEDV S蛋白氨基酸序列提交至RDP4軟件中，采用9種方法(RDP、GENECONV、Bootscan、Maxchi、Chimaera、SiSscan、PhylPro、LARD和3Seq)[19]進行基因重組分析，9種方法選用默認設(shè)置P<0.01。

2 結(jié) 果

2.1 豬腹瀉病原檢測

在來自四川及云南省8個地區(qū)腹瀉樣本中均未檢出SADS-CoV；但PEDV、GARV和PDCoV群體陽性率分別為：100%(8/8)、75.00%(6/8)和62.50%(5/8)，總體陽性率分別為：15.50%(31/200)、14.00%(28/200) 和7.00%(14/200)(表3)，提示PEDV和GARV可能是引起2020-2021年中國西南地區(qū)豬腹瀉病的主要病因。在所有8個地區(qū)來源樣本中，PEDV陽性率為3.33%～32.00%，表明當前PEDV在西南地區(qū)仍持續(xù)廣泛流行。此外，幾種病毒還呈現(xiàn)不同程度的混合感染，如PEDV和GARV混合感染率為5.50%(11/200)，PEDV和PDCoV混合感染率為2.00%(4/200)，PEDV、GARV和PDCoV混合感染率為0.50%(1/200)。

2.2 PEDV S基因和ORF3基因相似性分析

對所有PEDV陽性樣本中病毒的S和ORF3基因進行克隆測序，對測序結(jié)果進行相似性分析，最終確定獲得8個PEDV毒株，分別命名為：SCGYSWUN02、SCLSSWUN02、SCMYSWUN03、SCNCSWUN01、SCWJSWUN02、YNBSSWUN01、YNKMSWUN01和YNLCSWUN01。 將8株P(guān)EDV的S和ORF3基因序列分別與GenBank上已登錄的106個毒株S基因和68個毒株ORF3基因進行比對，相似性分別為90.5%～99.4%和92.9%～100%。其中，本次獲得的8株P(guān)EDVS基因與經(jīng)典毒株CV777、韓國疫苗株DR13及中國常用疫苗株AJ1102的相似性分別為91.7%～93.4%、91.7%～93.6%和95.8%～97.1%，ORF3基因相似性分別為93.6%～96.3%、88.3%～90.5%、93.9%～98.5%。 5株來自四川的毒株的S基因序列(SCGYSWUN02、SCLSSWUN02、SCMYSWUN03、SCNCSWUN01、SCWJSWUN02)與本地區(qū)往年流行毒株CH/SCCD/1/2018、CH/SCCD/2014、CH/SCLS/3/2019、CH/SCMY/2018、CH/SCMZ/2017、CH/SCQL/1/2018、CH/SCXM/2019、CH/SCZY103/2017、SC-YB73、SNJ-P和swun/H1/CH/SCYA/2019的S基因相似性為94.6%～99.4%；3株來自云南毒株的S基因序列(YNBSSWUN01、YNKMSWUN01、YNLCSWUN01)與云南往年流行毒株(YnP1、YnP2、YnP6和YnP9)的S基因相似性為95.6%～97.7%。

此外，5株四川來源的PEDV中，SCMYSWUN03、SCNCSWUN01和SCGYSWUN02S基因與四川CH/SCLS/3/2019株的相似性分別為98.1%、99.4%和99.2%，而SCWJSWUN02和SCLSSWUN02則分別和福建CH/FJXM/1/2012株、江蘇PED/JS/2016/05/5株S基因更相似(相似性分別為98.0%和98.5%)。3個云南毒株 (YNBSSWUN01、YNKMSWUN01、YNLCSWUN01)則分別與新疆(XJ-DB2株)、云南(YnP2株)和越南(TG5株)毒株S基因相似性最高(相似性分別為97.9%、97.1%和97.7%)(表4)。

表3 臨床樣本病原檢測結(jié)果

表4 8個毒株S和ORF3基因核苷酸相似性比對

從ORF3基因來看，SCWJSWUN02、SCMYSWUN03和SCLSSWUN02株與四川毒株(CH/SCCD/2014、CH/SCMY/2018和SNJ-P)的相似性均較高。而SCNCSWUN01株則與福建XM2-4株相似性最高(相似性為98.4%)。

2.3 PEDV S基因和ORF3基因的系統(tǒng)進化分析

將此8株 PEDVS和ORF3基因序列分別與參考毒株進行比對，并繪制進化樹。結(jié)果顯示，本次測序的8株P(guān)EDV均屬于G2群(圖1)，5株四川源PEDV中，SCMYSWUN03、SCNCSWUN01和SCGYSWUN02 株屬于G2-c亞群，與多個四川近年流行毒株共同聚為一大支，其中與CH/SCLS/3/2019 株的距離最近；SCLSSWUN02株單獨與PED/JS/2016/05/5株聚為一小支；SCWJSWUN02株屬于G2-b亞群，與HUA/14PED96、ZJCZ4和CH/FJXM/1/2012株 3個毒株可能存在演化關(guān)系。3株云南源PEDV中YNLCSWUN01株屬于G2-a亞群，與新疆XJDB2株的親緣關(guān)系最近；YNKMSWUN01和YNBSSWUN01株屬于G2-b亞群，與云南近年流行毒株YnP2、YnP6和YnP9株的距離較近。其中YNKMSWUN01株又與TG5和BT3株聚為一支，與越南PEDV毒株存在密切演化關(guān)聯(lián)。

圖1 基于PEDV S基因構(gòu)建的遺傳進化樹Fig.1 Genetic evolutionary tree based on PEDV S gene

根據(jù)PEDVORF3基因構(gòu)建進化樹可以將所有毒株分為G1、G2a和G2b 3個亞群，G1群主要包含了經(jīng)典毒株CV777、DR13、LZC和其他弱毒疫苗株。本次測序的8個PEDV毒株均屬于G2群(圖2)，其中SCNCSWUN01、YNBSSWUN01和YNKMSWUN01屬于G2-a亞群；SCGYSWUN02、SCWJSWUN02、YNLCSWUN01、SCLSSWUN02、SCMYSWUN03株屬于G2-b亞群。來自四川省的5個毒株中，SCNCSWUN01與福建 CH/FJZZ/9/2012株單獨聚為一小支；SCGYSWUN02和SCWJSWUN02 株聚為一支，與LZW株距離最近；SCLSSWUN02和SCMYSWUN03 株分別與SNJ-P株和CH/SCMY株進化關(guān)系最近。3個云南毒株中，YNLCSWUN01與LNCT2 株ORF3基因可能存在演化關(guān)系，而另外2株(YNKMSWUN01和YNBSSWUN01株)的關(guān)系較近，且與1個越南株HUA PED68和1個湖北株CH/hubei/2016聚為一支。

圖2 基于PEDV ORF3基因構(gòu)建的遺傳進化樹Fig.2 Genetic evolutionary tree based on PEDV ORF3 gene

2.4 PEDV S和ORF3蛋白的變異分析

將本次測序的8個PEDV毒株S和ORF3基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他在GenBank上登錄的106個S蛋白和68個ORF3蛋白氨基酸序列毒株比對發(fā)現(xiàn)，本次測序的8個毒株存在多個氨基酸位點的變異，如表5所示。SCGYSWUN02、SCLSSWUN02、SCMYSWUN03、SCNCSWUN01和SCWJSWUN02 株S蛋白分別存在5、9、14、6和25個氨基酸突變，YNBSSWUN01、YNKMSWUN01、YNLCSWUN01株S蛋白分別存在26、29和26個氨基酸變異；SCMYSWUN03 株S蛋白在59-62位氨基酸處還存在4個氨基酸的缺失(QGVN)，YNKMSWUN01 株在78-82位氨基酸處有5個氨基酸的插入(RRLCI)，在84-88位氨基酸處有5個氨基酸的缺失(GIFVS)。部分毒株在已鑒定的S蛋白受體結(jié)合區(qū)域(249-529位氨基酸處)有2～6個氨基酸的變異，如SCGYSWUN02株的第274位(V→C)和第488位(S→C)；SCLSSWUN02株的第351位(N→R)、第353位(S→R)和第358位(A→T)；SCMYSWUN03株的第318位(A→P)和第379位(T→N)；YNBSSWUN01 株的第247位(N→K)、第346位(S→P)、第347位(F→S)、第457位(A→V)、第461位(V→A)和第463位(Y→N)；YNKMSWUN01 株的第235位(I→P)、第337位(L→R)、第356位(P→A)、第396位(R→S)和第247位(E→Q)；YNLCSWUN01 株的第458位(T→Q)、第464位(C→S)、第472位(K→N)、第478位(F→D)和第482位(G→T)。

此外，在SCLSSWUN02、SCMYSWUN03、SCNCSWUN01、SCWJSWUN02 4個四川毒株ORF3蛋白分別發(fā)現(xiàn)6、5、8和6個氨基酸變異，3個云南毒株YNBSSWUN01、YNKMSWUN01和YNLCSWUN01的ORF3蛋白分別存在4、8和6個氨基酸變異，但未發(fā)現(xiàn)氨基酸缺失或插入。

表5 PEDV S和ORF3蛋白氨基酸變異分析

2.5 PEDV S基因的重組分析

基于遺傳進化分析結(jié)果進一步對PEDV毒株S基因進行重組分析,結(jié)果顯示，8個毒株中的4株S基因可能出現(xiàn)重組事件，概率分別為：SCLSSWUN02株67.3%(P<0.01)，SCMYSWUN03株98.2%(P<0.01)，SCWJSWUN02株60%(P<0.01)，YNKMSWUN01 株62.7%(P<0.01)。其中SCMYSWUN03 株發(fā)生重組的概率最高，為98.2%，其主要親本為G2-c亞群的SCGYSWUN02株，次要親本為G2-b亞群的CH/SCXM/2019株，推測重組區(qū)域為150～270 nt (圖3)。

圖3 SCMYSWUN03株S基因的重組分析Fig.3 The genetic recombination analysis of SCMYSWUN03 S gene

3 討 論

近年來，PEDV在中國西南地區(qū)的流行呈上升趨勢。如楊丹嬌等[20]對四川省部分地區(qū)豬腹瀉樣本中檢測PEDV陽性率達43.06%；Zuo等[21]發(fā)現(xiàn)云南省部分地區(qū)豬腹瀉樣本中PEDV總體陽性率達17.47%。本研究對2020-2021年四川及云南8個地區(qū)的疑似樣本檢測結(jié)果表明，PEDV檢出率為15.50%(31/200)，在所有腹瀉病毒中占比最高。表明PEDV仍是引起中國西南地區(qū)豬群腹瀉的主要病毒。此外，PEDV與GARV、PDCoV常呈現(xiàn)不同形式的混合感染，加劇腹瀉，給豬腹瀉病防控帶來困難。因此，還需持續(xù)對幾種主要腹瀉病毒的感染分布進行調(diào)查，進一步加強對上述病原的檢疫和凈化，為制定更具針對性的防控措施提供依據(jù)。

S蛋白是PEDV的主要毒力和抗原蛋白，在病毒與宿主細胞的結(jié)合、毒株抗原性和致病性方面發(fā)揮重要的作用，也是基因分型的主要依據(jù)[22]?；赟基因構(gòu)建進化樹一般將PEDV分為S-INDEL毒株、G1型和G2型等3個主要基因型[23]。G1型包含CV777、DR13、SD-M株等早期經(jīng)典毒株；G2型又分為G2a、G2b和G2c亞型，是近年來中國主要流行的PEDV毒株[24]。本研究測序的8株P(guān)EDVS基因測序分析結(jié)果表明，與GenBank上已登錄的106個毒株S基因相似性為90.5%～99.4%；與G1型經(jīng)典毒株CV777的相似性較低，但與G2型疫苗株AJ1102的S基因相似性為95.8%～97.1%，提示AJ1102疫苗株可能對西南地區(qū)流行的PEDV毒株具有更好的保護效果。結(jié)合S基因的核苷酸相似性分析結(jié)果，可推測目前四川地區(qū)流行的PEDV毒株除與本地區(qū)往年流行毒株存在親緣關(guān)系外，部分毒株還可能與福建源PEDV發(fā)生基因重組或重配，形成了新的PEDV毒株。 同樣的現(xiàn)象在3個云南毒株中也存在。 如YNBSSWUN01和YNKMSWUN01 2個云南毒株ORF3基因更接近于湖北毒株(CH/hubei/2016和M3/SX2017)，但其S基因又分別與云南YnP2株和越南TG5株相似性最高，這表明不同毒株間的基因重配現(xiàn)象是PEDV基因組變異的重要方式之一。

對S基因系統(tǒng)進化分析顯示，8個毒株包含了G2a、G2b和G2c 3種亞型，表明當前西南地區(qū)流行的PEDV毒株基因組具有遺傳多樣性。這與Tian等[25]對2014-2018年四川地區(qū)流行的 PEDV基因型調(diào)查結(jié)論相符，并進一步提示近年來該地區(qū)流行的PEDV持續(xù)表現(xiàn)出較高的變異性。在5株四川源PEDV中，SCMYSWUN03、SCNCSWUN01、SCGYSWUN02和SCLSSWUN02株屬于G2-c亞群。與多個四川近年流行毒株距離較近，存在演化關(guān)聯(lián)。而SCWJSWUN02株屬于G2-b亞群，與福建CH/FJXM/1/2012株親緣關(guān)系較近，表明四川地區(qū)當前流行的PEDV毒株存在省際間相互傳播的可能。此外，在3個云南源PEDV毒株中，YNLCSWUN01株為G2-a亞群，與新疆XJDB2株的親緣關(guān)系最近；YNKMSWUN01和YNBSSWUN01株為G2-b亞群，與云南近年流行毒株YnP2、YnP6和YnP9的距離較近。尤其是YNKMSWUN01株與2個越南毒株(TG5和BT3株)單獨聚為一支，可能存在密切演化關(guān)聯(lián)。這提示，PEDV在中國西南地區(qū)的流行不僅存在區(qū)域內(nèi)傳播的特征，也存在區(qū)域間(如省際、國際間) 傳播的可能。尤其云南省地處邊陲，更易于在同周邊國家生豬及其相關(guān)制品貿(mào)易往來的過程中導(dǎo)致病毒相互傳播，需加強對PEDV的檢疫。

進一步對S基因推導(dǎo)的氨基酸序列進行了變異性分析和重組分析。結(jié)果表明，8個PEDV毒株S蛋白氨基酸序列與已登錄的參考序列相比都存在不同數(shù)量的氨基酸位點突變，尤其是SCMYSWUN03、YNBSSWUN01、YNLCSWUN01株在已經(jīng)證實的PEDV S蛋白中和抗原表位(499-638位氨基酸處)[26]上存在氨基酸的突變。部分毒株還出現(xiàn)了連續(xù)的氨基酸插入或缺失。此外，還發(fā)現(xiàn)上述毒株氨基酸突變多集中于S1區(qū)(1-789位氨基酸)。研究表明，PEDV S蛋白S1區(qū)包含了主要的中和表位和受體結(jié)合域，在介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用，同時S1區(qū)也決定了PEDV的組織嗜性及病毒對宿主細胞的感染能力[27]。所以，這些氨基酸變化是否對病毒毒力或抗原性造成影響有待于進一步證實。

此外，基因重組分析結(jié)果表明，8株P(guān)EDV中有4株發(fā)生了重組事件，重組概率均>60%。主要由本地區(qū)往年流行的毒株為親本發(fā)生重組，同時也出現(xiàn)了不同區(qū)域間流行毒株的重組現(xiàn)象，如SCLSSWUN02株親本株分別為江蘇 PED/JS/2016/05/5株和越南的TG5株；YNKMSWUN01株親本株為G2/b亞群的湖北CH/hubei/2016株和G1/b亞群的江蘇JSLS/1/2015株，為跨群重組。進一步驗證了相似性分析和遺傳進化分析的結(jié)論，即當前西南地區(qū)流行的PEDV毒株存在較高的基因多樣性，不同地區(qū)毒株存在相互傳播和密切的演化關(guān)聯(lián)。

PEDVORF3基因是PEDV唯一的輔助蛋白，也與病毒毒力的強弱有關(guān)，在病毒增殖過程中起重要調(diào)控作用[28]。本研究對檢出的8株P(guān)EDVORF3基因也進行了相似性分析和系統(tǒng)進化分析。結(jié)果顯示，本次獲得的8株P(guān)EDVORF3基因相較于S基因更為保守。另外，基于ORF3基因的進化分析同樣將所有PEDV毒株分成G1和G2兩個大群，本次測序毒株均為G2群。但基于ORF3基因構(gòu)建的進化樹與基于S基因的又有所不同。如在ORF3基因的進化樹中，SCNCSWUN01株ORF3基因與福建 CH/FJZZ/9/2012株單獨聚為一小支，但在S基因構(gòu)建進化樹中其與CH/SCLS/3/2019四川流行株距離更近，由此推測目前四川地區(qū)流行的PEDV毒株，除與本地區(qū)往年流行毒株存在演化關(guān)聯(lián)外，部分毒株還可能與福建源PEDV發(fā)生基因重配，形成了新的PEDV毒株。

4 結(jié) 論

本研究在四川和云南部分地區(qū)獲得8個PEDV毒株，經(jīng)過生物信息學(xué)分析表明，8株P(guān)EDV的S和ORF3基因序列分別與GenBank上已登錄的106個毒株S基因和68個毒株ORF3基因進行比對，相似性分別為 90.5%～99.4%和92.9%～100%。部分毒株S蛋白存在連續(xù)氨基酸的插入或缺失，如SCMYSWUN03株S蛋白在59-62位氨基酸處存在4個氨基酸的缺失；YNKMSWUN01株在78-82位氨基酸處有5個氨基酸的插入，在84-88位氨基酸處有5個氨基酸的缺失。8株P(guān)EDV毒株與其他省份地區(qū)的毒株存在演化關(guān)聯(lián)，在基因重組分析中SCMYSWUN03株重組概率為98.2%，提示四川地區(qū)流行的PEDV毒株可能與其他地區(qū)發(fā)生了基因重配，形成了新的PEDV毒株。本研究為本地區(qū)豬腹瀉病的防控和凈化提供了理論依據(jù)，也為新型疫苗候選株的篩選提供了參考數(shù)據(jù)。