閆業(yè)聯(lián)，張夢雅，劉秋晨，汪 薪，徐長志，宗艷峰，朱治樺，吳蘇城，宋 雨，李運(yùn)生，張運(yùn)海，曹祖兵

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種安徽省重點(diǎn)實驗室，合肥 230036)

體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)也稱體細(xì)胞克隆，包括去核、注核、融合和激活等步驟，SCNT能將已分化的體細(xì)胞重編程為全能性狀態(tài)，徹底改變?nèi)藗儗ι嘲l(fā)育經(jīng)典理論的認(rèn)識。應(yīng)用SCNT技術(shù)已成功克隆非洲爪蟾、小鼠、牛等20余種動物[1]，SCNT囊胚可用來產(chǎn)生多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells,PSCs)，也稱為核移植胚胎干細(xì)胞(nuclear transfer embryonic stem cells,ntESCs)，它與供體同源，可用于更新和替換損壞的細(xì)胞和組織，同時，SCNT胚胎也是一種幫助人們理解細(xì)胞記憶如何被重編程產(chǎn)生全能細(xì)胞的模型，顯示出SCNT在農(nóng)業(yè)良種擴(kuò)繁、瀕危物種保護(hù)、生物醫(yī)學(xué)以及基礎(chǔ)研究等方面的巨大潛力[1]。然而，SCNT效率低下、表型異常發(fā)生率高嚴(yán)重阻礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。 牛的克隆效率最高，也僅為5%～20%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于體外受精(invitrofertilized,IVF)的效率(40%～60%)[2]。此外，克隆動物常出現(xiàn)胎盤增生、胎盤發(fā)育不全[3]以及出生后巨胎癥[4]、免疫缺陷[5]、呼吸障礙[6]等異常現(xiàn)象。但是，成功克隆的動物大多可產(chǎn)生正常表型的后代，意味著這些異?，F(xiàn)象主要是由表觀遺傳重編程不完全引起的，而非基因突變造成的[7]。隨著低樣本量測序技術(shù)的發(fā)展和完善，人們能夠在SCNT胚胎中檢測到更詳細(xì)的全基因組表觀遺傳修飾圖譜，進(jìn)一步揭示SCNT胚胎表觀遺傳重編程中的缺陷，為提高克隆效率提供了線索[8]。作者簡述了SCNT的發(fā)展歷程，并對影響SCNT胚胎著床前發(fā)育效率的表觀遺傳事件進(jìn)行總結(jié)(圖1A)，強(qiáng)調(diào)了一些可能影響SCNT效率的表觀遺傳標(biāo)記(圖1B)，以及對一些克服表觀遺傳障礙提高克隆效率的方案進(jìn)行梳理，旨在促進(jìn)對SCNT相關(guān)表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的理解，從而更有效地提高克隆效率。

圖1 SCNT胚胎發(fā)育過程中的重編程事件及其在生殖克隆中的相關(guān)障礙[1]Fig.1 Molecular mechanisms of SCNT reprogramming and its associated barriers in reproductive cloning[1]

1 體細(xì)胞核移植

1958年，Gurdon等[9]將非洲爪蟾(Xenopuslaevis)幼體腸細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞，獲得了第1例SCNT動物個體。1986年，Willadsen[10]通過電融合1個卵裂球與去核卵母細(xì)胞移植入受體子宮，成功獲得了3只存活的羔羊，為哺乳動物SCNT提供了依據(jù)。1997年，Wilmut等[11]將成年芬多斯母羊的乳腺上皮細(xì)胞與蘇格蘭黑面母羊的去核卵細(xì)胞電融合，獲得了首個SCNT哺乳動物“多利”，這一里程碑式的成就開啟了克隆時代。牛、小鼠、山羊、豬、歐洲盤羊、家兔、家貓、馬、大鼠、騾子、狗、雪貂、狼、水牛、紅鹿、單峰駱駝、食蟹猴等相繼被成功克隆[12]，其中最引人矚目的是2018年食蟹猴的成功克隆[13]，再次證實了SCNT的可行性。

同時，SCNT在治療性克隆、線粒體疾病等研究中也得到了發(fā)展，2001年，Wakayama等[14]在成年小鼠體細(xì)胞克隆胚胎中分離出了具備多能性特征的ntESCs；2007年Byrne等[15]報道了在成年恒河猴皮膚成纖維細(xì)胞核移植的克隆胚胎中，成功地分離獲得了2枚ESCs，其不僅有正常的核型，且具備體內(nèi)外三胚層分化的多能性；2013年，該團(tuán)隊利用人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞核移植，在克隆胚胎中成功地獲得了4枚有正常二倍體核型和具備多能性的ntESCs[16]，隨后，正常成年人[17]、糖尿病[18]及老年性黃斑變性病人[19]體細(xì)胞來源的ntESCs的相繼獲得，使得治療性克隆成為研究熱點(diǎn)。

2 體細(xì)胞核移植后的表觀遺傳重編程

2.1 DNA甲基化

DNA甲基化主要指發(fā)生在CpG雙核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化過程，其產(chǎn)物為5-甲基胞嘧啶(5-mC)[20]，在受精胚胎中，母系和父系等位基因主要通過10-11易位(ten-eleven translocation，TET)蛋白(TET1、2、3)介導(dǎo)5-mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)和胸腺嘧啶DNA糖基化酶(thymine DNA glycosylase,TDG)介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)[21]這兩種DNA去甲基化途徑，來清除DNA分子上親本甲基化標(biāo)記[22]，在囊胚期達(dá)到最低甲基化水平。 隨后借助DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)(DNMT3A、DNMT3B、DNMT1)建立并維持新的甲基化模式[22]。

由于供體細(xì)胞基因組DNA高度甲基化[23]，SCNT胚胎發(fā)育過程中可能也經(jīng)歷著DNA甲基化的動態(tài)變化，在小鼠SCNT胚胎中發(fā)現(xiàn)，定位于假原核(pseudo pronucle，PPN)的TET3誘導(dǎo)5-mC向5-hmC的轉(zhuǎn)化[24]，在其1-細(xì)胞晚期仍存在與供體細(xì)胞相近的DNA甲基化模式[25]，到2-細(xì)胞、4-細(xì)胞階段，SCNT胚胎依然比受精胚胎甲基化水平更高[8]，發(fā)育阻滯在2-細(xì)胞和4-細(xì)胞階段的SCNT胚胎的甲基化水平分別比能夠發(fā)育到囊胚階段的2-細(xì)胞和4-細(xì)胞的甲基化水平高[26]，直到囊胚期才達(dá)到與IVF囊胚相似的甲基化水平(15.6%vs19.1%)[27]。此外，小鼠植入前SCNT胚胎中存在的異常再甲基化差異甲基化區(qū)域(re-methylated differentially methylated regions，rDMRs)，導(dǎo)致對合子基因組激活(zygotic genome activation，ZGA)十分重要的基因和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的錯誤表達(dá)，嚴(yán)重阻礙了克隆胚胎的正常發(fā)育[28]。綜上表明，SCNT胚胎發(fā)育過程中經(jīng)歷去甲基化/再甲基化的動態(tài)變化，而一種與受精胚胎相似的DNA甲基化模式對SCNT成功重編程至關(guān)重要。

2.2 組蛋白修飾

組蛋白修飾是指真核生物的細(xì)胞核中，與DNA結(jié)合的堿性蛋白質(zhì)氨基末端發(fā)生的甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等共價修飾，不僅在調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，而且可以作為表觀遺傳標(biāo)記傳遞給子細(xì)胞[29]。 然而，SCNT胚胎與IVF胚胎在組蛋白甲基化和乙酰化方面存在明顯差異[30]。

2.2.1 組蛋白甲基化 組蛋白甲基化在胚胎發(fā)育的各個階段均有重要作用[31]。研究較多的是位于基因啟動子處的轉(zhuǎn)錄激活標(biāo)記組蛋白3賴氨酸4三甲基化(H3K4me3)，在母體基因組中，存在與部分甲基化的DNA域高度重疊的非典型H3K4me3(non-canonical form of H3K4me3,ncH3K4me3)形式，成熟卵母細(xì)胞到2-細(xì)胞早期階段的基因組沉默常伴隨著ncH3K4me3的整體顯現(xiàn)，過表達(dá)賴氨酸特異性去甲基化酶5b(lysine-specific demethylase 5b，Kdm5b)導(dǎo)致大量卵母細(xì)胞中H3K4me3顯著下調(diào)并重新激活轉(zhuǎn)錄，表明它可能參與了基因抑制[32]。在2-細(xì)胞晚期，啟動子上典型H3K4me3峰的建立會取代非典型H3K4me3，H3K4me3去甲基酶Kdm5a/b的敲低會導(dǎo)致胚胎難以發(fā)育到囊胚階段，并導(dǎo)致合子基因組激活缺陷[33]，說明及時去除H3K4me3修飾對于ZGA是必需的。

組蛋白3賴氨酸9三甲基化(H3K9me3)異常是SCNT胚胎中常見的抑制性修飾，它與異染色質(zhì)的形成有關(guān)，抑制相關(guān)基因的表達(dá)[34]。在小鼠SCNT胚胎2-細(xì)胞期存在一些相對于IVF胚胎未能激活的區(qū)域，被稱為抗重編程區(qū)域(reprogramming-resistant regions,RRRs)，造成ZGA缺陷，影響克隆胚胎正常發(fā)育。在體細(xì)胞中這些RRRs中富集H3K9me3[35]，過表達(dá)H3K9me3特異性組蛋白去甲基化酶Kdm4d或在供體小鼠胎兒成纖維(mouse embryonic fibroblast，MEF)細(xì)胞中敲除Suv39h1和Suv39h2(兩種H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶)可以去除RRRs中的H3K9me3，使得小鼠SCNT胚胎在2-細(xì)胞期正常激活基因組，顯著提高了胚胎的發(fā)育效率[35]。通過其他Kdm4家族基因改善H3K9me3修飾，也在牛[36]、食蟹猴[13]、人[19]顯示出類似的效果。雖然在SCNT中使用Kdm4d可獲得與IVF相當(dāng)?shù)闹踩肼?，但植入的SCNT胚胎只有不到15%能足期發(fā)育，而且在kdm4d處理后的SCNT胚胎中仍可觀察到胎盤異常[35]。表明H3K9me3可能主要阻礙SCNT著床前胚胎發(fā)育。

組蛋白3賴氨酸27三甲基化(H3K27me3)異常重編程會阻礙SCNT胚胎發(fā)育，H3K27me3在IVF植入前胚胎的啟動子區(qū)域缺失，在體細(xì)胞中主要富集于CpG島嶼(CGI)和CGI相關(guān)啟動子上，在母體基因組中廣泛分布[37]。在植入前后胚胎發(fā)育中均發(fā)揮關(guān)鍵作用[38]，在小鼠SCNT胚胎2-細(xì)胞中存在異常重編程，當(dāng)發(fā)育到桑椹胚時來自供體細(xì)胞啟動子相關(guān)的H3K27me3基本消失，達(dá)到與IVF胚胎相似的分布模式[27]。過表達(dá)H3K27me3特異性去甲基化酶Kdm6a顯著增加了SCNT囊胚形成率，但足期發(fā)育率沒有提高，敲低Kdm6b可提高Kdm6a的表達(dá)，不僅促進(jìn)了ZGA，提高了囊胚的形成率，而且提高了出生率和ntESCs的產(chǎn)生效率[39]。 而對胚胎植入后的影響，主要是由H3K27me3印跡基因(如Sfmbt2或其相關(guān)的microRNA簇)的印跡缺失(loss of imprint,LOI)造成的[40]。

2.2.2 組蛋白乙?；?組蛋白乙酰化通常發(fā)生在核心組蛋白N-端堿性氨基酸集中區(qū)域的特定賴氨酸殘基上，具有增加染色質(zhì)可及性，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活的作用[41]。Dahl等[33]對小鼠體內(nèi)胚胎的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白3賴氨酸27乙?；?H3K27ac)的基因組覆蓋范圍從卵母細(xì)胞到2-細(xì)胞胚胎均顯著增加，與啟動子H3K4me3峰的建立過程十分相似，表明這些活性標(biāo)志可能共同作用介導(dǎo)ZGA。當(dāng)供體細(xì)胞注入去核MⅡ期卵母細(xì)胞后，體細(xì)胞中核心組蛋白(H3K9、H3K14、H4K16)快速去乙酰化，在克隆胚胎激活后發(fā)生再乙?；痆30]。豬SCNT胚胎1-細(xì)胞與2-細(xì)胞期H3K18ac、H4K8ac水平均顯著低于IVF胚胎，但囊胚時期SCNT胚胎與IVF胚胎中二者水平基本一致[42]。Yang等[43]發(fā)現(xiàn)異常的乙酰化區(qū)域阻礙合子基因的激活，曲古抑菌素A (trichostatin A,TSA)處理和過表達(dá)雙同源盒(double homebox，Dux)(Dux)挽救異常的H3K9ac修飾，能夠明顯提高克隆小鼠的發(fā)育效率，表明正確的組蛋白乙?；鼐幊掏瑯邮翘岣逽CNT效率的重要途徑。

2.3 組蛋白變體

當(dāng)供體細(xì)胞核注入去核卵母細(xì)胞后，必須被重塑成類似于受精卵的細(xì)胞核才能保證SCNT成功[44]。受精后，主要與魚精蛋白包裝在一起的精子基因組經(jīng)歷整體重塑，存在于母系的組蛋白，如H3.3(由H3f3a和H3f3b編碼)和H2AFX迅速重新包裝精子的DNA[45]。在SCNT后，進(jìn)入去核卵母細(xì)胞的供體細(xì)胞染色質(zhì)開始濃縮，不久后，MacroH2A(由H2afy和H2afy2編碼)從體細(xì)胞核染色質(zhì)中解離，直到桑椹胚階段，MacroH2A在染色質(zhì)中重新建立[46]。大多數(shù)供體細(xì)胞來源組蛋白變體在激活后5 h內(nèi)消失,伴隨著這個過程，所有卵母細(xì)胞來源的H3變體(H3.1、H3.2和H3.3)、H2A組蛋白家族成員X(H2A histone family member X,H2AFX)以及卵母細(xì)胞特異性的組蛋白變體H1foo在SCNT時被迅速整合到供體細(xì)胞核中[45]。除此之外，卵母細(xì)胞獨(dú)特的核心組蛋白變體TH2A和TH2B(分別由Hist1h2aa和Hist1h2ba編碼)，在體細(xì)胞中過表達(dá)能夠誘導(dǎo)染色質(zhì)開放并促進(jìn)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)重編程[47]。在小鼠SCNT前，敲低卵母細(xì)胞的組蛋白變體H3.3會阻礙多能基因的激活，影響胚胎發(fā)育[48]，說明組蛋白變體在SCNT重編程中具有重要作用。

2.4 基因組印跡

基因組印跡是指在胚胎發(fā)育期間，通過表觀遺傳修飾來自親本的等位基因或染色體，導(dǎo)致2個親本來源的等位基因有不同的表達(dá)活性，具有這種差異的基因被稱為印跡基因[49]。基因組印跡在配子形成期間被清除和建立，并在生物體的整個生命周期中保持，保證了早期胚胎的正常發(fā)育[50]。然而，基因組印跡在克隆胚胎中沒有得到有效維持，導(dǎo)致印跡基因異常表達(dá)[12]。

DNA甲基化是哺乳動物主要的基因組印跡，不同親本來源的等位基因調(diào)控區(qū)的差異性DNA甲基化(differentially methylated region，DMR)能夠決定及維持印跡基因的差異表達(dá)[51]。H19/胰島素樣生長因子2(insulin like growth factor 2，IGF2)是哺乳動物中典型的印跡基因簇，均受DMR調(diào)控，其父源等位基因上的DMR被甲基化，在該位點(diǎn)上H19沉默刺激IGF2活化和細(xì)胞生長，而母源等位基因上的H19是一種抑制因子，對IGF2表達(dá)具有順式沉默效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IGF2和H19的異常表達(dá)可導(dǎo)致克隆犢牛死亡[52]，在異常死亡的克隆豬胎盤中也檢測到IGF2和H19的表達(dá)異常[53]，在人和小鼠中，H19、IGF2和胰島素樣生長因子2受體(insulin like growth factor 2 receptor，IGF2R)等印跡基因的異常表達(dá)會導(dǎo)致胎兒過度生長，通過檢測DMR的DNA甲基化水平發(fā)現(xiàn)巨胎癥的克隆綿羊中IGF2R表達(dá)較正常胎兒顯著降低[54]。低甲基化的H19/IGF2印跡導(dǎo)致H19轉(zhuǎn)錄增加，抑制克隆胎兒的生長，而高甲基化的H19/IGF2印跡介導(dǎo)的IGF2過表達(dá)導(dǎo)致克隆胎兒的過度生長[12]。在小鼠SCNT植入前胚胎中印跡基因H19、母源表達(dá)3(maternally expressed 3,Meg3)、IGF2R、Achaete-Scute家族BHLH轉(zhuǎn)錄因子2(achaete-scute family bhlh transcription factor 2,Ascl2)和小核核糖核蛋白多肽N(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N,SNRPN)只有4%正常表達(dá)[55]；與常規(guī)妊娠相比，從死亡克隆妊娠和活犢分離的牛胎盤中觀察到6個印跡基因(H19、X非活性特異性轉(zhuǎn)錄本(X inactive specific transcript,XIST)、IGF2R、SNRPN、父源表達(dá)3(paternally expressed 3，PEG3)和IGF2異常表達(dá)[56]，意味著對基因組印跡機(jī)制的深入研究對改善SCNT效率具有重要意義。

除DNA甲基化之外，H3K27me3修飾是一個新的印跡基因調(diào)控機(jī)制，在胚胎著床前發(fā)育過程中，母系沉積的H3K27me3抑制至少76個基因的母系等位基因表達(dá)，其中Sfmbt2、Gab1、Smoc1、Jade1在胎盤中受H3K27me3介導(dǎo)的非典型印跡調(diào)控，在胎兒中丟失印跡(雙等位表達(dá))，在小鼠SCNT胚胎囊胚期所有依賴H3K27me3的印跡基因基本上都失去了印跡狀態(tài)，成為雙等位基因表達(dá)，這可能是由于供體細(xì)胞中缺乏H3K27me3印跡標(biāo)記，因為它在供體細(xì)胞來源的胚胎譜系中缺失[40]。然而，在豬和牛植入后克隆胚胎中沒有發(fā)現(xiàn)H3K27me3基因印跡缺失，這表明H3K27me3印跡系統(tǒng)可能不是跨物種保守的[57]。印跡基因Ndn和Xist在克隆牛胚胎中的異常表達(dá)與乙酰化組蛋白4賴氨酸5(AcH4K5)相關(guān)[58]，而小鼠Xist(X-inactive specific transcript)是H3K27me3調(diào)控的印跡基因的一員[59]。Xist是位于X染色體上的17 kb的長鏈非編碼RNA，參與調(diào)控X染色體失活(XCI)[60]。哺乳動物X染色體通過印跡失活和隨機(jī)失活保證雄性和雌性細(xì)胞之間X染色體編碼基因表達(dá)水平的平衡[61]。然而在小鼠SCNT胚胎中，Xist普遍高表達(dá)，導(dǎo)致2條X染色體異常失活，引起SCNT胚胎移植后死亡[62]。在牛[62]和豬[63]中也觀察到SCNT后異常Xist激活，與產(chǎn)前胚胎死亡有關(guān)，說明異常的Xist表達(dá)可能也屬于H3K27me3印跡調(diào)控的體細(xì)胞克隆障礙[64]。

2.5 染色質(zhì)開放性

染色質(zhì)開放性也被稱為染色質(zhì)可及性，是指核大分子能夠與染色質(zhì)化的DNA進(jìn)行物理接觸的程度，基因的表達(dá)依賴于染色質(zhì)的可及性[12]。受精后，染色質(zhì)組織不同的精子和卵子都經(jīng)過重編程，以獲得相似的染色質(zhì)可及性，從而使2個親本等位基因的表達(dá)相等[65]。在胚胎激活后12 h內(nèi)，小鼠SCNT胚胎1-細(xì)胞的染色質(zhì)可及性重編程伴隨著DNase Ⅰ高敏感位點(diǎn)(DNase Ⅰ hypersensitive sites，DHSs)的整體缺失基本完成[66]，DHSs與基因表達(dá)呈正相關(guān)，存在于供體細(xì)胞并在克隆胚胎中重新編程，然而，供體細(xì)胞的特異性DHSs無法被重新編程到克隆胚胎的DHSs，阻礙了克隆胚胎中的基因表達(dá)[66]。另外，供體細(xì)胞的染色質(zhì)狀態(tài)對轉(zhuǎn)錄重編程有重要影響，Miyamoto等[67]對非洲爪蟾的研究發(fā)現(xiàn)，供體細(xì)胞中沉默但已有開放轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的基因在SCNT后容易被激活。 Djekidel等[66]利用liDNase-seq技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)DHS譜重編程與供體特異性轉(zhuǎn)錄因子(TFs)網(wǎng)絡(luò)向合子網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)換有關(guān)，一些體細(xì)胞TFs無法與染色質(zhì)分離，也可能是SCNT重編程的障礙,這其中潛在的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

3 表觀遺傳重編程改善的策略

盡管人們已經(jīng)嘗試優(yōu)化SCNT程序、更換供體/受體細(xì)胞類型、改變?nèi)ズ伺c融合方法等提高克隆效率，但并未像消除表觀遺傳障礙那樣顯著提高克隆效率，因為決定克隆胚胎發(fā)育能力的關(guān)鍵之一是表觀遺傳重編程的程度[44]。目前，改善供體細(xì)胞重編程狀態(tài)最常用的方法是藥物處理或調(diào)控胚胎發(fā)育相關(guān)重要基因的表達(dá)，下文將從表觀修飾劑、組蛋白去甲基化酶、抑制Xist表達(dá)、魚精蛋白和精子RNA幾個方面進(jìn)行梳理。

3.1 表觀修飾劑

Han等[68]通過在供體細(xì)胞中過表達(dá)TET3來優(yōu)化SCNT胚胎的去甲基化過程，成功提高了克隆山羊的出生率(3.6%vs1.5%)。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DNA methyltransferases inhibitors，DNMTi)(圖2A)或靶向DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的siRNA來修正異常的再甲基化過程可顯著提高克隆效率(圖2B)，如利用5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dc)[69]、zebularine[70]、RG108[71]處理降低基因組DNA甲基化水平可以改善克隆胚胎的發(fā)育；通過注射靶向DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT3a和DNMT3b)的siRNA(圖2B)，可將小鼠SCNT胚胎囊胚發(fā)育率提高近10%(48.2%vs39.5%)，且小鼠SCNT胚胎的足期發(fā)育率由0.88%提升到5.33%[28]。組蛋白去乙酰酶抑制劑(histonedeacetylase inhibitor,HDACi)能夠增加組蛋白乙酰化，打開染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，有利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，激活參與早期胚胎發(fā)育的基因[12](圖2A)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)TSA、Scriptaid、Oxamflatin、SAHA、quisinostat、丙戊酸等多種HDACi，其中TSA是抑制Ⅰ和Ⅱ類HDACs最有效、最常用的抑制劑[72]，可將小鼠克隆胚胎效率從1%提高到6%[73]。TSA和5-aza-dc共同處理SCNT胚胎，能夠極大地提高小鼠、豬克隆胚胎的發(fā)育效率[74]。此外，使用TSA和Scriptaid 2種HDACi聯(lián)合處理家兔克隆胚胎比使用單一HDACi更有利于提高克隆效率[75]。但值得思考的是，這些藥物(如HDACi和DNMTi)在整體基因組范圍內(nèi)對其靶標(biāo)產(chǎn)生作用，那它們的副作用是什么？它們在激活一些基因的同時也會抑制其他基因表達(dá)嗎？此外，這些表觀修飾劑對除小鼠之外其他物種的著床后克隆胚胎發(fā)育的影響鮮有報道，均需要進(jìn)一步研究。

A，組蛋白去乙酰酶抑制劑或DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理激活后重構(gòu)卵母細(xì)胞；B，注射小干擾RNA、信使RNA以及精子小RNA等方法提高克隆效率；C，構(gòu)建外源性表達(dá)魚精蛋白1的體細(xì)胞；D，通過使用精子樣結(jié)構(gòu)供體細(xì)胞改善核移植效率A,SCNT improvement by exposure of histone deacetylase inhibitors (HDACi) after reconstructed oocyte activationor DNA methyltransferase inhibitor (DNMTi);B,SCNT improvement by Injection of siRNA,mRNA and sperm-borne small RNAs;C,Exogenous expression of Protamine 1 (Prm1) gene in the somatic donor nuclei;D,SCNT improvement by using donor cells with spermatid-like structures圖2 改善SCNT的策略Fig.2 Strategies for improving SCNT

3.2 組蛋白去甲基化酶

組蛋白賴氨酸去甲基化酶(histone lysine demethylases family,Kdms)可以通過優(yōu)化組蛋白修飾水平，改善克隆胚胎發(fā)育效率(圖2B)。研究發(fā)現(xiàn)，H3K9me3去甲基化酶Kdm4d和Kdm4b均能有效降低H3K9me3水平，使得囊胚率提高到80%以上[8]，且Kdm4d mRNA注射到SCNT胚胎中能將出生率從僅1%提高到8.7%[35]。同樣，當(dāng)把H3K4me3特異性去甲基化酶Kdm5b mRNA注射到去核卵母細(xì)胞中可將小鼠囊胚率從約30%提高到50%以上，過表達(dá)Kdm4b和Kdm5b可將囊胚率提高到95%以上，并有超過11%的克隆胚胎發(fā)育成活的動物[8]，而接受Kdm4b和Kdm5b mRNA和siDNMT3a和siDNMT3b共注射的去核卵母細(xì)胞的胚胎發(fā)育率更高[28]。 靈長類動物食蟹猴(Macacafascicularis)的成功克隆得益于TSA和H3K9me3甲基化去甲基化酶Kdm4d的聯(lián)合處理[13]，證明了消除多重表觀遺傳障礙是改善SCNT重編程的有效方法。

3.3 抑制Xist表達(dá)

SCNT胚胎中普遍存在Xist高表達(dá)，造成X染色體失活機(jī)制異常，敲除或敲低小鼠克隆胚胎中Xist基因，能夠提高克隆胚胎的發(fā)育效率[76]。而將Xist敲除與Kdm4過表達(dá)相結(jié)合，可將克隆效率提高到20%以上[27]。在克隆豬早期胚胎中，Kdm4a的過表達(dá)會上調(diào)Xist的表達(dá)，因此不能提高克隆豬胚胎后期的體內(nèi)發(fā)育能力[77]。不同物種間的差異提示人們對不同物種間表觀遺傳變化的準(zhǔn)確理解對推動SCNT技術(shù)的應(yīng)用十分關(guān)鍵。

3.4 魚精蛋白和精子小RNA

除了集中在卵母細(xì)胞上的研究，對精子認(rèn)識的不斷深入為提高SCNT效率提供了新的策略。通過構(gòu)建外源性表達(dá)魚精蛋白1的供體細(xì)胞(圖2C)，能夠產(chǎn)生精子細(xì)胞樣染色質(zhì)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，提高SCNT囊胚率[78](圖2D)。精子攜帶的小RNA(圖2B)可降低兔SCNT胚胎8-細(xì)胞期H3K9me3水平，降低SCNT囊胚的凋亡指數(shù)，顯著提高植入前克隆胚胎的發(fā)育能力[79]。注射牛精子小RNA到SCNT胚胎中改善了α-微管蛋白K40的乙?；驮诵纬陕蔥80]。有研究發(fā)現(xiàn)，精子microRNA-449b[81]、microRNA-125b[82]均在改善表觀遺傳重編程方面發(fā)揮重要作用。但相關(guān)精子因子對出生率的改善還未見報道，因此，精子因子在提升克隆效率方面仍需深入探索。

綜上所述，表觀遺傳調(diào)控是一個復(fù)雜且相互協(xié)調(diào)的網(wǎng)絡(luò)，它不僅局限于各種表觀遺傳的獨(dú)立調(diào)控，而且還存在精密的互相調(diào)節(jié)關(guān)系。這意味著單獨(dú)消除某一項表觀遺傳障礙，提升克隆效率的作用有限，使用多種方法以及多個角度的結(jié)合來克服SCNT過程中表觀遺傳重編程障礙[83]，是提高克隆胚胎發(fā)育能力新的方向。 而要使SCNT技術(shù)有更廣闊的應(yīng)用前景，則需要人們在豬、牛等大型動物上進(jìn)行更多研究。

4 小 結(jié)

近年來，隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的應(yīng)用，在發(fā)現(xiàn)和識別克隆胚胎發(fā)育相關(guān)的重編程因子方面取得了巨大進(jìn)展，一些改善表觀重編程的策略，如組蛋白去乙酰化酶抑制劑、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、組蛋白去甲基化酶以及抑制Xist表達(dá)等使克隆胚胎的發(fā)育能力獲得了顯著提升，但對克隆動物出生率的提升依然有限。一些對小鼠克隆效率提升十分有效的方法(如HDACi)在大型動物上卻不盡人意，仍需要開發(fā)適合所有物種的理想核重編程策略。除了前述的各種表觀遺傳獨(dú)立調(diào)控的機(jī)制外，它們之間存在許多相互調(diào)控的關(guān)系；不同基因組位點(diǎn)及不同轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)換模式在表觀遺傳重編程中的調(diào)控方式仍不清晰；且環(huán)境因素可能影響表觀遺傳調(diào)控，因此運(yùn)用多組學(xué)分析來闡明SCNT涉及的重編程因素和機(jī)制或許是提高人們對胚胎發(fā)育的理解、改善克隆胚胎發(fā)育能力的有效途徑。

在對提高克隆效率的長期探索拓展了SCNT的應(yīng)用。如節(jié)約生產(chǎn)種公畜的時間和費(fèi)用，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)動物的擴(kuò)繁，為保護(hù)瀕危物種提供了新方法；結(jié)合SCNT與生物反應(yīng)器制作技術(shù)，產(chǎn)生生物反應(yīng)器(乳腺生物反應(yīng)器)，生產(chǎn)特定蛋白治療人類疾病。此外，利用SCNT可以由供體細(xì)胞產(chǎn)生生物個體的特點(diǎn)，特別是當(dāng)與CRISPR/Cas9等基因組編輯技術(shù)相結(jié)合時，可以在大型動物中快速高效地制造人類疾病模型，用來篩選藥物以及研究人類疾病的發(fā)病機(jī)制。因此，克隆研究的每一次進(jìn)步都會使其應(yīng)用領(lǐng)域更加廣泛。

在未來的研究中，提高SCNT胚胎的發(fā)育效率依然是人們努力的方向，隨著多種阻礙克隆胚胎發(fā)育的障礙被揭示，進(jìn)一步增加了克隆研究的復(fù)雜性，意味著僅通過單一的處理消除所有障礙是不現(xiàn)實的，聯(lián)合去除多重障礙可能是實現(xiàn)完全重編程的更有效方法。另外，與最新的測序技術(shù)以及最新的基因編輯技術(shù)結(jié)合，將會更加清晰迅速地解析表觀遺傳重編程機(jī)制，以期實現(xiàn)幾乎完全的重編程，從而大幅度提高克隆效率。