王志亮，楊喜喜，鐵雅楠，伏曉玉，王欣榮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

胚胎移植(embryo transfer,ET)與超數(shù)排卵(superovulation)作為研究動(dòng)物繁殖的重要技術(shù)，對(duì)縮短動(dòng)物繁殖周期，提高生產(chǎn)力水平起到非常重要的作用[1-2]。目前對(duì)大部分動(dòng)物進(jìn)行超排處理時(shí)，常用的激素種類及組合有促卵泡素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)+人絨毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)、FSH+促黃體素(luteinizing hormone，LH)+hCG、孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)+hCG、促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)、雌二醇(estradiol，E2)以及人絕經(jīng)期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，hMG)等[3]。各種激素因其自身特點(diǎn)在注射方式上也有所不同，由于FSH和LH在動(dòng)物體內(nèi)半衰期短，所以需要每天持續(xù)注射[4]，而PMSG半衰期較長(zhǎng)只需注射一次即可，但首次超排不如FSH、LH等內(nèi)源性激素的效果好，重復(fù)超排效果卻好于FSH等激素[5]。研究表明，家兔采用50 IU PMSG效果不如50 IU PMSG+50 IU hCG，表明PMSG+hCG聯(lián)合的超排效果明顯優(yōu)于PMSG[6]，在有效實(shí)現(xiàn)超數(shù)排卵的前提下，由于PMSG與hCG具有價(jià)格低廉、操作方便的優(yōu)點(diǎn)，所以在生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用，也能取得很好的經(jīng)濟(jì)效益。有研究表明，在家兔上通過對(duì)35 IU hMG+100 IU hCG、10 IU FSH+100 IU hCG和80 IU PMSG+100 IU hCG 3種超排方式比較，發(fā)現(xiàn)PMSG+hCG組合超排效果較好，胚胎回收率最高[7]。通過對(duì)動(dòng)物超排后激素變化的研究發(fā)現(xiàn)，激素處理能夠引起動(dòng)物內(nèi)源性激素變化而改變動(dòng)物生殖器官生理狀態(tài)，達(dá)到較好的超排效果[8-9]。

影響超排的因素有很多，如季節(jié)、動(dòng)物的年齡、體重、品種和飼養(yǎng)條件等均會(huì)對(duì)超排效果造成影響[10]，但最主要的因素還是動(dòng)物生殖系統(tǒng)對(duì)超排激素的反應(yīng)情況。在超排過程中，通過多種激素的協(xié)同調(diào)節(jié)，會(huì)影響卵巢上卵泡發(fā)育的時(shí)間和數(shù)量，使多個(gè)卵泡在發(fā)育過程中能夠抵抗閉鎖發(fā)育成熟而排卵。超排方法主要有恒量法和遞減法，有研究表明，對(duì)家兔注射40、 50、 60、 70、 80、 90 IU PMSG 1次，或10 IU FSH 6次恒量注射后再進(jìn)行12.5～7.5 IU FSH 6次遞減注射，結(jié)果表明只要?jiǎng)┝亢线m2種超排方法均可實(shí)現(xiàn)有效超排[11]。家兔屬于常年發(fā)情、刺激性排卵的動(dòng)物，使用超排處理可在短期內(nèi)獲取大量卵母細(xì)胞和胚胎。超排處理涉及到動(dòng)物下丘腦等性腺軸上發(fā)生的一系列生理變化，包括生殖激素的調(diào)節(jié)與協(xié)同反饋、卵巢等不同部位的組織學(xué)改變等?，F(xiàn)階段主要研究不同超排劑量對(duì)超排處理和胚胎的獲取與重復(fù)超排對(duì)動(dòng)物繁殖性能的影響，而對(duì)超排后動(dòng)物生殖器官組織形態(tài)學(xué)變化和內(nèi)源性血清激素變化研究較少[12-13]?；诒菊n題組前期對(duì)激素用量的篩選(未發(fā)表)，本研究用70 IU PMSG+100 IU hCG對(duì)家兔進(jìn)行超排處理，通過生殖器官形態(tài)和生殖激素水平的變化來(lái)研究其影響，以揭示外源激素干預(yù)下家兔激素分泌的變化及生殖器官的組織學(xué)特點(diǎn)，以期為超排效果提供形態(tài)學(xué)和激素水平變化的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 性成熟雌性家兔(伊拉肉兔品系)購(gòu)自甘肅某養(yǎng)殖有限公司，購(gòu)入后在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)訓(xùn)基地進(jìn)行飼養(yǎng)。經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，挑選12只體重大小一致的家兔分為2組，每組6只，單籠飼養(yǎng)，兔舍采用人工控溫與光照，自由采食飲水，屠宰時(shí)體重為(3.38±0.01) kg。

1.1.2 主要試劑及儀器 PMSH和hCG均購(gòu)自寧波第二激素廠；蘇木精染液(武漢谷歌生物科技有限公司)、無(wú)水乙醇、二甲苯、鹽酸和中性樹膠均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抑制素(inhibin，INH)、FSH、LH、孕酮(progesterone，P4)和E2激素測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。石蠟切片機(jī)(RM2016)購(gòu)自Leica公司；正置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自尼康公司；游標(biāo)卡尺(0～500 mm)購(gòu)自上海恒量量具有限公司，；自動(dòng)脫水機(jī)(JJ-12J)、包埋機(jī)(JB-P5)和凍臺(tái)(JB-L5)均購(gòu)自武漢俊杰電子有限公司；組織攤片機(jī)(KD-P)和烘片機(jī)(KD-H)購(gòu)自浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的處理及樣品采集 將12只動(dòng)物分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。給試驗(yàn)組家兔大腿內(nèi)測(cè)注射70 IU PMSG，72 h后在相同位置注射100 IU hCG，對(duì)照組均對(duì)應(yīng)注射等體積生理鹽水。試驗(yàn)組和對(duì)照組家兔均采取與雄兔合籠刺激誘導(dǎo)排卵，合籠24 h處死采集卵巢、輸卵管、子宮等樣品，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量各樣品物理參數(shù)后，4%多聚甲醛固定。分別在注射PMSG前、注射hCG前及處死前采集對(duì)照組和試驗(yàn)組家兔耳緣靜脈血，3 000 r/min離心5 min，吸取上層血清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生殖器官物理參數(shù)測(cè)量 用游標(biāo)卡尺測(cè)量卵巢的長(zhǎng)、寬和厚，輸卵管長(zhǎng)、輸卵管壺腹部、峽部及漏斗部的寬度，子宮的長(zhǎng)度、寬度、周長(zhǎng)及子宮壁的厚度，并統(tǒng)計(jì)排卵點(diǎn)數(shù)及充血卵泡數(shù)。

1.2.3 組織切片的制備 對(duì)家兔生殖器官的物理數(shù)據(jù)測(cè)量后，將卵巢、輸卵管和子宮分離，在4%多聚甲醛中固定24 h后，對(duì)卵巢進(jìn)行修塊，經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片、攤片、沾片、烤片、二甲苯脫蠟、蘇木精染色、鹽酸分化、水洗、伊紅染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，將制備好的卵巢切片置于顯微鏡下鏡檢，選取3個(gè)以上不同視野進(jìn)行拍照并采集照片，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量卵泡直徑和卵母細(xì)胞直徑。

1.2.4 血清激素測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書采用ELISA法測(cè)定血清中INH、FSH、LH、P4和E2含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

激素測(cè)定數(shù)據(jù)用Excel 2010統(tǒng)計(jì)，用SPSS 25.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 超排對(duì)卵巢組織形態(tài)的影響

家兔卵巢呈紡錘形，質(zhì)感較硬不易變形，表面有大小不等的卵泡突出，經(jīng)超排處理后卵巢體積明顯變大，表面卵泡、充血卵泡和排卵點(diǎn)增多(圖1)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組卵巢重量、長(zhǎng)度、寬度和厚度均極顯著增加(P<0.01)；卵巢上的排卵點(diǎn)數(shù)、充血卵泡數(shù)、閉鎖卵泡數(shù)均極顯著增多(P<0.01)(表1)。通過對(duì)卵巢切片的觀察發(fā)現(xiàn)，超排后家兔卵巢皮質(zhì)內(nèi)有大量的卵泡發(fā)育，而對(duì)照組發(fā)育卵泡數(shù)量相對(duì)較少，同時(shí)2組都有一定數(shù)量的黃體存在，且試驗(yàn)組的黃體數(shù)量較多，而對(duì)照組中可見的黃體數(shù)量較少且已經(jīng)發(fā)生退化(圖2)。

2.2 超排對(duì)卵泡和卵母細(xì)胞的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，除次級(jí)卵泡直徑顯著減小外(P<0.05)，其他各級(jí)卵泡的直徑均差異不顯著(P>0.05)，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞的直徑差異也不顯著(P>0.05)。

由圖3可知，無(wú)論是否有超排處理，家兔卵巢的組織學(xué)特征相似，即隨著卵巢皮質(zhì)表層大量原始卵泡的發(fā)育，其周圍出現(xiàn)了單層卵泡細(xì)胞層，此時(shí)原始卵泡發(fā)育為初級(jí)卵泡，隨后出現(xiàn)透明帶而發(fā)育為次級(jí)卵泡，之后隨著卵泡腔的出現(xiàn)則發(fā)育為三級(jí)卵泡，并幾乎占據(jù)整個(gè)皮質(zhì)層。在卵泡發(fā)育的各個(gè)階段大部分卵泡發(fā)生閉鎖，且腔前卵泡和有腔卵泡有著不同的閉鎖方式，僅有少部分優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育為成熟卵泡并排卵。

A，對(duì)照組；B，試驗(yàn)組A,Control group;B,Experimental group圖1 各組卵巢形態(tài)觀察Fig.1 Observation of ovary morphology in each group

①A，對(duì)照組；B，試驗(yàn)組。②TA，白膜；C，皮質(zhì)；M，髓質(zhì)；F，卵泡；CL，黃體①A,Control group;B,Experimental group.②TA,Tunica albuginea;C,Cortex;M,Medulla;F,Follicle;CL,Corpus luteum圖2 各組卵巢組織形態(tài)(100×)Fig.2 Ovarian tissue morphology in each group (100×)

表2 各組不同級(jí)別卵泡和卵母細(xì)胞直徑

PRF，原始卵泡；PF，初級(jí)卵泡；SF，次級(jí)卵泡；PO，初級(jí)卵母細(xì)胞；ZP，透明帶；IC，間質(zhì)細(xì)胞；FA，卵泡腔；SG，顆粒層；TFI，卵泡內(nèi)膜；TFE，卵泡外膜；AF，閉鎖卵泡PRF,Primitive follicles;PF,Primary follicle;SF，Secondary follicle;PO,Primary oocyte;ZP,Zona pellucida;IC,Interstitial cells;FA,Follicular cavity;SG,Stratum granulosum;TFI,Theca folliculi intern;TFE,Theca folliculi externa;AF,Atresia follicles圖3 各組不同級(jí)別卵泡組織形態(tài)Fig.3 The histological morphology of follicles of different grades in each group

2.3 超排前后子宮和輸卵管的組織形態(tài)學(xué)變化

由表3可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組輸卵管長(zhǎng)度和壺腹部寬度均顯著增加(P<0.05)，漏斗部寬度極顯著增加(P<0.01)。由表4可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組子宮長(zhǎng)度極顯著增加(P<0.01)，子宮寬度顯著增加(P<0.05)；子宮周長(zhǎng)和子宮壁厚小于對(duì)照組，但差異均不顯著(P>0.05)。

表3 輸卵管物理參數(shù)測(cè)定結(jié)果

表4 子宮物理參數(shù)測(cè)定結(jié)果

2.4 超排前后生殖激素水平的變化

對(duì)照組家兔血清INH水平隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，在注射PMSG前和hCG前試驗(yàn)組INH含量均顯著降低(P<0.05)(圖4A)；與對(duì)照組相比，在注射hCG前試驗(yàn)組FSH含量顯著增加(P<0.05)，處死前FSH顯著降低(P<0.05)(圖4B)；試驗(yàn)組血清中LH無(wú)明顯變化，對(duì)照組血清中LH含量先降低后上升，且注射hCG前和處死前試驗(yàn)組LH含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖4C)；試驗(yàn)組與對(duì)照組血清中P4含量變化均不明顯，但都有下降趨勢(shì)，且2組間差異不顯著(P>0.05)(圖4D)；對(duì)照組血清中E2含量呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)，而在試驗(yàn)組中基本無(wú)變化，且2組間差異不顯著(P>0.05)(圖4E)。

①Ⅰ，注射PMSG前；Ⅱ，注射hCG前；Ⅲ，處死前。②*，差異顯著(P<0.05)；無(wú)*，差異不顯著(P>0.05)①Ⅰ,Before the injection of PMSG;Ⅱ,Before the injection of hCG;Ⅲ,Before the slaughtering.②*,Significant difference(P<0.05)；No *,No significant difference(P>0.05)圖4 血清激素INH(A)、FSH(B)、LH(C)、P4(D)和E2(E)在不同時(shí)期的含量Fig.4 Contents of serum hormone INH (A),FSH (B),LH (C),P4 (D) and E2(E) in different periods

3 討 論

3.1 超排處理對(duì)家兔生殖器官形態(tài)及組織學(xué)特征的影響

相較于FSH、LH等激素超排方案，PMSG與hCG價(jià)格低廉且操作方便[14]。PMSG能夠促使卵巢中卵泡快速發(fā)育，而與卵母細(xì)胞一起構(gòu)成卵泡的體細(xì)胞(卵泡細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞)的分化則是其生長(zhǎng)的主要原因[15]。本研究結(jié)果表明，在卵泡發(fā)育過程中，外源激素的處理對(duì)大多數(shù)卵泡直徑無(wú)影響，但能顯著減小次級(jí)卵泡的直徑。Downs[16]研究表明，PMSG可以促使卵巢中卵泡的同步發(fā)育，能夠使次級(jí)卵泡快速發(fā)育成三級(jí)卵泡，說(shuō)明PMSG主要作用于生長(zhǎng)卵泡的發(fā)育，但對(duì)卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞大小無(wú)顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組卵巢中有大量的閉鎖卵泡，且各級(jí)閉鎖卵泡的組織結(jié)構(gòu)不完全相同。在閉鎖的原始卵泡中，卵母細(xì)胞會(huì)先塌縮退化后消失，初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡閉鎖形式為透明帶塌縮以及卵母細(xì)胞核固縮后消失。而在閉鎖的有腔卵泡中，首先卵母細(xì)胞退化消失，隨后顆粒細(xì)胞逐漸充滿整個(gè)卵泡腔后致密化，最后顆粒細(xì)胞凋亡消失。有研究指出，小尾寒羊生長(zhǎng)卵泡的閉鎖有2種形態(tài)，一種是實(shí)心卵泡，另一種是囊狀卵泡[17]。這與本研究觀察到的家兔卵泡的閉鎖方式有所不同。在東北虎的卵巢中，卵泡閉鎖體現(xiàn)在卵母細(xì)胞退化消失，透明帶松散褶皺，顆粒細(xì)胞間疏松結(jié)合超1/3[18]。研究顯示，東北梅花鹿卵泡的閉鎖主要有2種類型，第一種普遍發(fā)生于原始卵泡、初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡中，表現(xiàn)為卵母細(xì)胞發(fā)生退行性變化，是卵泡閉鎖的主要形式；第二種主要發(fā)生于三級(jí)卵泡中，表現(xiàn)為卵泡細(xì)胞核致密化，細(xì)胞質(zhì)空泡化并瓦解[19]。在本研究中家兔卵泡的閉鎖狀態(tài)與梅花鹿的相似，即在無(wú)腔卵泡和有腔卵泡中存在2種閉鎖類型，但不同物種之間不同類型的閉鎖差異的具體原因尚需進(jìn)一步研究。另外本研究也顯示，對(duì)照組中的閉鎖卵泡數(shù)少于試驗(yàn)組，這可能是超排處理使卵泡大量發(fā)育的同時(shí)，卵泡的閉鎖也有所增加所致。

PMSG能夠使動(dòng)物卵巢中卵泡大量發(fā)育生長(zhǎng)，卵巢基質(zhì)增加[20]，使得卵巢體積增大，重量增加。本研究觀察到，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組卵巢的皮質(zhì)和髓質(zhì)中的細(xì)胞數(shù)量多且排列緊密，另外結(jié)締組織和血管也表現(xiàn)出增多和變大的趨勢(shì)。胡鵬飛等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，4 IU PMSG處理對(duì)小鼠子宮的增大也有影響，本研究也檢測(cè)到輸卵管和子宮在處理前后有部分形態(tài)發(fā)生顯著變化。因此,本研究通過70 IU PMSG+100 IU hCG的激素組合對(duì)家兔進(jìn)行超排處理，會(huì)對(duì)家兔卵巢的形態(tài)及組織學(xué)特征產(chǎn)生一定的影響，如卵巢增大、排卵點(diǎn)以及黃體數(shù)目增多等，且對(duì)輸卵管、子宮大小也有影響，但對(duì)成熟卵泡和卵母細(xì)胞的直徑?jīng)]有顯著影響。

3.2 超排處理對(duì)家兔血清生殖激素分泌的影響

INH是抑制垂體促性腺激素細(xì)胞分泌FSH的主要調(diào)節(jié)因子之一。在促性腺激素的作用下，卵巢顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞合成并分泌INH[22-23]。Meng等[24]研究發(fā)現(xiàn)，卵泡內(nèi)抑制素的表達(dá)水平取決于卵泡的發(fā)育階段，說(shuō)明INH是卵泡發(fā)育能力的重要影響因子。在新發(fā)育的優(yōu)勢(shì)卵泡中分泌的抑制素B(INHB)具有2個(gè)功能[25]：一是負(fù)反饋調(diào)節(jié)垂體分泌FSH，二是與LH局部協(xié)同作用，增加膜細(xì)胞分泌雄激素的能力[26]。在雌性動(dòng)物的發(fā)情周期，垂體分泌的LH通過血液循環(huán)到達(dá)卵巢，協(xié)調(diào)垂體分泌的FSH刺激卵母細(xì)胞和卵泡發(fā)育，促進(jìn)雌激素的分泌釋放，在形成LH峰后促進(jìn)排卵[27]。PMSG具有FSH相似的功能，能夠促進(jìn)卵泡的發(fā)育，且具有LH的部分功能，能夠促進(jìn)卵泡排出和黃體的形成。本研究中，在PMSG注射后INH一直呈遞減趨勢(shì)，且在注射hCG后顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明超排處理使INH濃度降低，INH對(duì)FSH的分泌抑制作用減小，PMSG和hCG與INH協(xié)同作用促使FSH升高，刺激更多卵泡成熟，使卵巢能夠排出大量成熟卵母細(xì)胞，促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的增生和雌激素的分泌，在卵母細(xì)胞排出后FSH濃度會(huì)發(fā)生下降[28]，而家兔為刺激排卵動(dòng)物，試驗(yàn)組在注射完hCG交配后刺激卵母細(xì)胞排出與外源性激素反饋影響FSH濃度迅速下降。而PMSG和hCG均有類似LH的作用，與自身LH共同作用從而導(dǎo)致LH處于較高濃度并發(fā)生了鈍化，但LH濃度一段時(shí)間內(nèi)仍然維持相對(duì)較高的水平，說(shuō)明處理也能夠起到延長(zhǎng)妊娠的作用。

卵巢內(nèi)雌激素主要分泌部位為卵泡的顆粒細(xì)胞，主要包括E2和雌酮，而且兩者可互相轉(zhuǎn)化。雌激素通過對(duì)下丘腦的反饋?zhàn)饔茫{(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素和促性腺激素分泌，在促進(jìn)卵泡發(fā)育，調(diào)節(jié)發(fā)情周期起重要作用[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，PMSG超排處理豬后其E2在72 h之前緩慢增長(zhǎng)，在72 h達(dá)到最高，隨后濃度降低[29]，本研究在家兔中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，但與對(duì)照組相比差異不顯著。孕酮主要來(lái)源于卵巢的黃體細(xì)胞，其中P4是孕激素中活性最高的，也是雌激素和雄激素的共同前體。有研究表明，對(duì)水牛和豬注射PMSG超排后，P4濃度會(huì)降低[29-30]，本試驗(yàn)結(jié)果與水牛和豬上的結(jié)果一致，說(shuō)明超排處理對(duì)孕酮水平的降低作用是一致的，但降低程度因物種而異。由此可見，采用70 IU PMSG+100 IU hCG激素組合對(duì)家兔進(jìn)行超排處理對(duì)E2和P4的分泌量并不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。

4 結(jié) 論

用70 IU PMSG+100 IU hCG的激素對(duì)兔進(jìn)行超排處理，可使卵巢體積增大、表面的排卵點(diǎn)數(shù)增多，黃體和閉鎖卵泡數(shù)目增多，血清中INH濃度降低、FSH和LH濃度升高，且外源性與內(nèi)源性激素協(xié)同作用于卵巢，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的超排效果。